基于小卫星重复元件1(msr1)的治疗剂和诊断剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因序列、基因序列分析及其在研究和开发，特别是在解决未满足的 医疗需求领域中的应用和分析。特别地，本发明涉及称为MSRl的特定小卫星重复元件在诊 断、治疗和鉴定疾病新的治疗中的应用。
[0002] 发明背景
[0003] 1987年，小卫星重复元件被鉴定为ApoCII基因中的37bp的重复基因内序列，并 且该序列及其变体随后被称为MSRl [1，2]。随后，MSRl元件被描述于几个基因座处，具体而 言，人基因组中的激肽释放酶基因簇、TNNI3和PRPF31，以及小鼠基因组中的PRSS17[3-9]。 PRPF31编码普遍存在的剪接因子PRPF31，其涉及致盲的视网膜疾病常染色体显性视网膜 色素变性（adRP)。在人激肽释放酶基因簇中，发现10簇MSRl元件沿着该基因座分布。虽 然在癌症和对照患者的小量样本之间观察到等位基因频率之间的一些差异，未提示该元件 的功能作用。
[0004] 该元件被描述为染色体19特异性的，其在染色体19ql3. 2-13. 4处为显性的 [1-3]，但没有赋予所述元件除作为标志物外的任何特定作用的功能活动。已表明该元件可 能在TNNI3启动子[7]或者前列腺癌细胞中介导顺式正义-反义嵌合转录子的形成[10] 中起作用。
[0005] 在位置紧密靠近PRPF31核心启动子的MSRl元件簇（hgl9坐 标，chrl9:54618105-54618472)的研究中，所述元件以3个或4个拷贝存在。已证明，单独 地，MSRl元件的拷贝数变异（CNV)对荧光素酶报告子测定具有中度影响，其3-拷贝报告子 构建体具有比4-拷贝构建体高2. 3 - 4. 5倍的活性[8]。
[0006] 视网膜色素变性（RP)为特征在于视网膜光受体（视杆和视锥细胞）进行性退化 的的一组遗传异质性病症。该疾病影响全世界约1/3000名个体，其特征最初为夜盲，然后 是视野受限，最后是中心视敏度的丧失。该疾病可通过所有孟德尔遗传方式引起，包括常染 色体隐性、显性和X-连锁的形式。常染色体显性视网膜色素变性（adRP)占病例的30-40 %; 一种形式的adRP与普遍存在的剪接因子PRPF31中的突变相关。
[0007] 在染色体19ql3. 4处鉴定了主要的adRP基因座，称为RPll ;随后，发现PRPF31为 引起该连锁的致病基因[11，12]。已经鉴定了所有突变方式，包括无义、错义、插入和缺失； 累积地，PRPF31突变占adRP的5%，且为显性疾病的第二最常见诱因[13-14]。PRPF31相 关的adRP的关键特征为表型非外显性，因此存在完全无症状的突变携带者。这是由于群 体中PRPF31的差异化表达：突变等位基因和低表达的野生型等位基因的共同遗传引起疾 病，而突变等位基因和高表达的等位基因的共同遗传避免出现临床症状。已证明，野生型 等位基因在无症状个体中的表达相比其有症状的亲属高两倍多[15]。已证明了正常群体 中PRFP31的差异化表达，且其遵循几乎连续的分布，表明存在基因表达的多基因控制的 可能性[16].。已证明确定非外显的主要基因座位于野生型染色体19ql3. 4,其紧密靠近 PRPF31 [17, 18]。因此，认为最可能相对于PRPF31顺式作用的因子是控制群体中的PRPF31 表达水平的主要因子。
[0008] 当前，尽管诊断测试可以确定个体是否为PRPF31突变携带者，但没有测试能够确 定个体是否为有症状的或无症状的。这使得PRPF31相关的adRP的遗传咨询存在问题。
[0009] 尽管研究取得了重大进展，特别是在遗传学以及治疗和诊断方法的开发方面，但 癌症和相关的疾病仍然是存在严重未满足的医疗需求的领域。卵巢癌是发达国家第二最常 见的妇科癌症和第六最常见的女性癌症。
[0010] 卵巢癌尤其具有非常差的预后，这归因于没有有效的筛查工具、在许多患者中没 有临床症状以及在疾病的晚期才显现。开发有效筛查和治疗的主要障碍在于对该疾病的病 理和组织发生的认识不足。除了家族性癌症综合征中的单基因突变，在鉴定使个体倾向于 发展卵巢癌的体细胞遗传变化方面的进展很少，仅有的令人信服的实例为BNC2中的变异 [19]。
[0011] 一项研究证明PRPF31单体型与侵入性疾病的风险相关（P = 0. 03)，但在深入分析 中未能显示与任何个体SNP的显著相关，提示与PRPF31单体型密切靠近的未基因分型的 变体起作用[20]。在患有晚期高分级上皮卵巢癌的女性中，PRPF31增加的表达预测对化疗 的响应和疾病早期复发[21]。
[0012] PRPF31的启动子区被表征为相对于有注释的PRPF31转录起始位点跨越-397至 +539的基因组片段，该片段被称为BiP[8]。发现观察到的位置紧密靠近启动子元件（hgl9 坐标，chrl9:54618105-54618472)上游的元件以正常群体拷贝（3个或4个拷贝）存在[8， 补充数据]。
[0013] 乳腺癌是发达国家影响女性的最常见的癌症，一生发展疾病的风险为7. 1%。许 多基因座涉及发展乳腺癌的风险，包括激肽释放酶基因座处的几个基因。MSRl元件簇位于 KLK14基因的3' UTR内（chrl9:51580818-51581230)，并且已报道相比匹配的对照个体， 小样本的患有组织学确认的乳腺癌的患者中9-拷贝的等位基因明显更频繁[22]。此外， KLK14表达在几种癌症，包括乳腺癌、卵巢癌、卵巢癌、前列腺癌和睾丸肿瘤中被异常调节
[23]。
[0014] 前列腺癌是男性中最常见的癌症，多于80%的男性到80岁时会发生该疾病。前列 腺癌为发达国家中第六最常见的癌症死亡原因。在非常小量的样本中，正常和癌性前列腺 细胞中KLK4(chrl9:51409713-51410118)处的MSRl元件簇显示等位基因异质性；此外，发 现相同的MSRl元件对癌细胞中顺式正义-反义转录子的形成是重要的[3, 10]。
[0015] 发明概述
[0016] 本发明基于以下发现：群体中MSRl元件的拷贝数变异（CNV)与特定生物学病况的 拥有和/或倾向和/或预后以及MSRl元件的治疗操纵之间的相关性。
[0017] 因此，本发明提供了小卫星重复元件I (MSRl)在鉴定治疗试剂的方法中或作为靶 标的应用，用于处理或治疗涉及与小卫星重复元件I(MSRl)或者其功能变体或衍生物相关 的一个或多个基因的疾病或病况。
[0018] 应理解，MSRl及其功能变体或衍生物包括图1中所示的元件及其变体，并且包括 例如图1和如下所示的原型序列：
[0019] CCCCTCCTCCCTCAGACCCAGGAGGCCAGGCCCCCCAG
[0020] CCCCTCCTCCCTCAGACCCAGGAGGCCAGGCCCCCAG
[0021] 还包括通过在标准重复元件数据库如RepeatMasker (www. repeatmasker. org)和 RepBase (www. girinst. org/repbase/)中检索而确定的任何其他序列及其变体。
[0022] 在本发明的其他方面提供了小卫星重复元件I (MSRl)或者其功能变体或衍生物 在基因治疗方法中的应用。
[0023] 在其他方面，本发明提供了在受试者的疾病或病况中用于预测、诊断、预后或响应 治疗的测试法，所述疾病或病况涉及与小卫星重复元件I(MSRl)或者其功能变体或衍生物 相关的一个或多个基因，其中所述测试法为或包括用于评估所述一个或多个基因的MSRl 基因座处的拷贝数变异（CNV)从而确定所述受试者中存在或发展疾病或病况的风险的方 法。
[0024] 在本发明的其他方面提供了用于实施本发明的测试法的试剂盒。在其他方面，本 发明提供了使用本发明的测试法或方法的靶向筛选程序。
[0025] 本发明的实施方案包括测试法、试剂盒、方法和筛选程序，其中所述基因选自一个 或多个癌症基因，例如选自表2或3中列出的那些。所述测试法可以是基于PCR的。
[0026] 在本发明的一个方面，本发明提供了评估PRPF31基因座处的MSRl元件的CNV的 测试，其基于PRPF31基因座处负责卵巢癌患者中改变的PRPF31基因表达的MSRl元件的 CNV的相关性，以及观察到的PRPF31单倍型和卵巢癌之间的相关性。
[0027] 在一个实施方案中，提供了基于PCR的系统，其使用一条荧光标记的引物并相对 标准分子梯度确定PCR产物大小，从而允许基因型的确定。
[0028] 在本发明的其他方面，提供了筛选程序，其允许鉴定存在增加的风险，特别是发展 卵巢癌的风险并因此需要定期随访从而在较早的阶段检出疾病的个体。此外，因为一些包 含MSRl的基因的差异化调控与对化疗剂治疗的响应相关（例如，PPP1R15A和间皮瘤[24]; 乳腺癌中的KLK3 [25])，如果发现MSRl的CNV为该差异化表达调控的基础，那么确定基因型 的会允许预测对化疗试剂的响应，从而允许在最可能响应的那些患者而非在治疗可能不成 功的那些患者中开始细胞毒性治疗。
[0029] 接下来为阐释本发明的非限制性实例和图表。
【附图说明】
[0030] 图1显示了共有MSRl序列的位置权矩阵。尽管个体MSRl元件的准确序列不同， 描述共有或原型序列是可能的。在此，选择了 1〇〇个体MSRl序列，并生成了位置权矩阵，以 显示哪些碱基最高度保守。字母的高度与保守水平成比例，且变异被显示为主要的碱基下 面的较小的字母。以星号标记的碱基频繁地缺失，因此通常引用为37-38bp长度。
[0031] 图2显示了 -A:通过双荧光素酶报告子分析测试的区域的示意图，其显示了原始 核心启动子片段（BiP)、在原始研究[8]中表现出报告子活性显著差异的片段以及包含这 两个片段（BiP-SNP)的片段。B = HeLa细胞中双荧光素酶报告子分析的结果。C = RPE-I细胞 中双荧光素酶报告子分析的结果。
[0032] 图3显示了 A, B :报告子构建体测试的示意图。A:4种构建体，可变MSRl序列被 克隆