杂交芸苔属植物及其生产方法
【专利说明】杂交芸苔属植物及其生产方法 发明领域
[0001] 本发明涉及转基因的芸苔属植物、植物材料和种子，特别是油籽油菜（oilseed rape)植物，其特征在于这些植物包含两个特定转化事件的组合，具体为在芸苔属基因组特 定位置存在雄性不育基因，和在芸苔属基因组另一特定位置存在育性恢复基因。本发明还 涉及一对转基因芸苔属植物，特别是油籽油菜植物，其特别适于生产杂交种子。更具体地， 一种植物的特征为雄性不育，因为在其基因组中存在雄性不育基因，而另一种植物的特征 为携带可阻止雄性不育基因活性的育性恢复基因。本发明的这对芸苔属植物将形成杂交种 子的能力与最佳总体农学性能、遗传稳定性以及对不同遗传背景的适应性相结合。
[0002] 发明背景
[0003] 转基因在植物中的表型表达由该基因自身的结构及其在植物基因组中的位置来 决定。同时，（外源DNA中的）转基因在基因组的不同位置存在，可以以不同方式影响植物 的总体表型。通过遗传操作对植物从农业上或工业上成功导入商业感兴趣的性状是一个漫 长的、受不同因素影响的过程。经遗传转化的植物的实际转化和再生只是一系列选择步骤 的第一步，其中所述选择步骤包括广泛的遗传鉴定、育种及野外试验的评估。
[0004] 术语"油菜籽"（rapeseed)涵盖芸苔属物种的各种种子。芸苔属（植物）作为最 有价值的油料作物在从中国和印度到芬兰和加拿大广泛种植。多数芸苔属种类属于十字花 科家族。它们起源于二倍体物种，具有从7(地中海包心菜（Brassica fruticulosa))到 12 (白芥（Sinapsis alba))的非整倍体（aneuploid)染色体数。在加拿大最广泛种植的芸 苔属物种为宪菁（turnip rape)，或 Brassica campestris(aa，n = 10)。甘蓝（Brassica oleracea) (cc，n = 9)在近期进化史中分化为至少六种园艺种类，包括椰菜，花椰菜和甘蓝 (cabbage)。黑芥（Brassica nigra) (bb，n = 8)或称黑芥（black mustard)是商业上的 较不重要的作物，主要以其种子为人所知，芥末起初由其种子制得。从这些基本种类，在更 近期的进化阶段中通过互交（intercross)产生双倍体杂种（amphiploid)。这之中最重要 的是欧洲油菜（Brassica napus) (aacc)以及芥菜（Brassica juncea) (aabb)或称褐芥菜 (brown mustard)，前者的冬季种类在北欧提供了最高的油菜籽产量，后者为印度次大陆主 要的油料作物之一。尽管不同芸苔属物种（特别是那些基因组相容的）之间的互交是可 能的，并且经常出于育种目的进行互交，但不是所有的性状（或基因）都能够从一个物种转 移到另一物种，或在转移到不同物种时，不是所有的特性（或基因）都能够保持相同的特征 (或表达模式）。因此，在一个芸苔属物种中赋予天然或嵌合基因最佳表达的遗传基因座， 在另一物种中不一定具有相同的效果。
[0005] 芸苔属物种为两性的，一般60-70%为自花传粉。作为选择基础，杂交体的产生和 遗传变异的导入通常依赖于对自然发生现象（例如自身不相容性和细胞质雄性不育）的适 应。在芸苔属育种中未广泛使用人工授粉控制法例如手工去雄或使用杀配子剂，分别是因 为它们有限的实用性和高成本。
[0006] 已开发了用于产生雄性或雌性不育植物的转基因方法，它们提供了有意义的常规 技术替代方法。
[0007] EP 0, 344, 029描述了用于获得核雄性不育的体系，其中将植物用雄性不育基因 转化，所述雄性不育基因包含例如在绒毡层（tapetum)特异启动子TA29控制下的编码 芽孢杆菌RNA酶分子的DNA，当该基因掺入植物中后，可选择性破坏绒毡层细胞。用此 基因转化烟草及油籽油菜植物导致花粉形成完全受阻的植物（Mariani等，1990, Nature 347:737-741)。
[0008] De Block和De Brouwer (1993, Planta 189:218-225)描述了包含嵌合PTA29:芽 孢杆菌RNA酶基因的欧洲油菜植物花药发育的细胞化学和组织化学分析。
[0009] 为恢复雄性不育植物之子代的育性，开发了这样的体系，其中雄性不育植物与携 带育性恢复基因的转基因植物杂交，育性恢复基因在表达时可抑制或阻止雄性不育基因的 活性（US5, 689, 041;US5, 792, 929 ;De Block和De Brouwer,同上）。WO 96/26283中描 述了在雄性不育植物的生产中使用共同调节的（多个）基因以增加具有良好农艺学性状的 转化体的（产生）频率。典型地，当不育性DNA编码芽孢杆菌RNA酶，共同调节的DNA将编 码芽孢杆菌RNA酶抑制剂。
[0010] 原种事件MS-B2,和包含赋予雄性不育性的此原种事件的雄性不育植物，在 TO01/31042中详细描述（在此引入作为参考），包括转基因和所插入的转基因紧侧翼的植 物DNA序列的表征。
[0011] 包含原种事件MS-B2的参考种子以ATCC保藏号PTA-850于1999年10月14日保 藏于ATCC(10801 University Blvd.，Manassas, VA 20110-2209)。同一种子的另一样品以 保藏号PTA-2485保藏。MS-B2的备选名字为MS 11。
[0012] 原种事件RF-BN1，和包含赋予雄性不育性的此原种事件的雄性不育植物，在 TO01/41558中详细描述（在此引入作为参考），包括转基因和所插入的转基因紧侧翼的植 物DNA序列的表征。
[0013] 包含原种事件RF-BNl的参考种子以ATCC保藏号PTA-730于1999年9月20日保 藏于 ATCC(10801University Blvd. ,Manassas,VA 20110-2209)。RF-BNl的备选名字为Rf 3〇
[0014] W001/41558还描述了原种事件MS-BN1，包含该事件的雄性不育植物，以及鉴定这 样的植物及其子代的方法。MS-BNl的备选名字为MS 8。
[0015] MS-BNl和RF-BNl事件包含在以商标名InVigor?Canola出售的杂交欧洲油菜 植物中。
[0016] 前述这些文件既未描述芸苔属植物中MS-B2和RF-BNl的具体组合，也未描述其在 杂交种子生产中的用途。迄今也未提及芥菜中的RF-BNl，以及MS-B2增加芸苔属油料种子 植物产量的用途。
[0017] 发明概述
[0018] 在一个实施方案中，本发明提供了从油籽油菜植物，例如欧洲油菜或芥菜生产杂 交种子的方法，包含如下步骤，提供包含原种事件MS-B2的雄性不育的雌性亲本油籽油菜 植物，包含所述原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于 ATCC;提供包含原种事件RF-BNl的雄性不育的雄性亲本油籽油菜植物，优选为纯合形式， 包含所述原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC ;用来自所述雄性亲本 油籽油菜植物的花粉对所述雌性亲本油籽油菜植物进行授粉；并从所述雌性亲本植物收获 杂交种子。
[0019] 在另一实施方案中，本发明提供了油籽油菜植物，例如欧洲油菜或芥菜植物，其 核基因组中包含至少一个拷贝的原种事件MS-B2,包含该原种事件的参考种子以保藏号 ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC，还包含至少一个拷贝的原种事件RF-BN1，包 含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。本发明还提供了这样的油 籽油菜植物的细胞或组织或种子。
[0020] 在本发明的另一实施方案中，提供了一对油籽油菜植物，以用于生产杂交种子，其 中一种植物包含原种事件MS-B2,包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或 ATCC_PTA-850保藏于ATCC，另一种所述油籽油菜植物包含原种事件RF-BNl，包含该原种事 件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。
[0021] 本发明的目的还在于提供油籽油菜植物，例如欧洲油菜或芥菜植物的基因组DNA， 其核基因组中包含至少一个拷贝的原种事件MS-B2,包含该原种事件的参考种子以保藏号 ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC，还包含至少一个拷贝的原种事件RF-BN1，包 含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。
[0022] 本发明还提供了包含原种事件RF-BNl的芥菜，及其细胞和种子，包含该原种事件 的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。这样的植物还可包含原种事件MS-B2,包 含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。
[0023] 本发明还提供了原种事件MS-B2的用途，用于提高转基因油籽油菜植物例如芥菜 植物的种子产量，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保 藏于ATCC。
[0024] 在本发明另一实施方案中，提供了增加油籽油菜植物产量的方法，包含如下步骤， 提供具有原种事件MS-B2的油籽油菜植物，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485 或 ATCC_PTA-850 保藏于 ATCC。
[0025] 附图简述
[0026] 图1 :应用除草剂后MS/RF杂交欧洲油菜种系的活力（vigor)比对。图A :无草铵 膦应用。图B: