真核生物中的靶向基因组工程的制作方法
【专利说明】真核生物中的靶向基因组工程 发明领域
[0001] 本发明涉及农学领域。更具体地，本发明提供在真核细胞，例如植物细胞的基因组 中的精确定位的核苷酸序列处引入靶向修饰的方法和手段，该靶向修饰包括插入、缺失或 取代。该修饰通过在第一步中使用双链DNA断裂诱导酶例如TALEN在识别核苷酸序列处诱 导双链断裂而触发，随后使用修复核酸分子作为模板通过同源重组在断裂位点或靠近断裂 位点的位置引入基因组修饰。当设计修复DNA的序列，使其介导同源重组以在断裂和识别 位点外实现靶向插入时，相比于精确地在断裂位点处的插入，靶向插入事件的频率增加。
【背景技术】
[0002] 在基因组例如植物基因组中引入靶向修饰，包括控制外源DNA的整合位置，已经 成为日益重要的需要，并且已经尝试开发了几种方法以满足该需要（综述参见Kumar and Fladung, 2001，Trends in Plant Science, 6, ppl55_159)。这些方法大多数依赖于，最初通 过表达双链断裂诱导（DSBI)酶在靶向位置引入双链DNA断裂。
[0003] 通过切点罕见核酸内切酶，例如I-Scel，诱导双链DNA断裂（DSB)以激活靶位 点和/或修复或供体DNA，已经被证实可以使同源重组频率增加几个数量级。（Puchta et al. , 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 93, pp5055-5060 ；Chilton and Que1Plant Physiol.，2003 ;D'Halluin et al.2008Plant Biotechnol.J. 6, 93-102) 〇
[0004] WO 2005/049842描述，使用切点罕见"双链断裂"诱导（DSBI)酶、以及改进的 I-SceI编码核苷酸序列、在植物中改进靶向DNA插入的方法和手段。
[0005] W02006/105946描述，用于在植物细胞和植物中使靶DNA序列与目的DNA序列通过 同源重组精确交换的方法，其中，使用该文献中描述的通过小孢子特异性表达DSBI切点罕 见核酸内切酶而除去选定DNA的方法，可以将在该同源重组阶段用于暂时选择基因置换事 件的可选择或可筛选标记随后除去而不留下足迹，而且在该除去步骤中不依赖体外培养。
[0006] W02008/037436描述W02006/105946的方法和手段的变体，其中由双链断裂诱导 性切点罕见核酸内切酶诱导的选定DNA片段去除步骤，在种系特异性启动子控制下进行。 该方法的其它实施方案依赖于在修复DNA的一端的非同源性末端接合和在另一端的同源 重组。W008/148559描述W02008/037436的方法的变体，即，用于在真核细胞例如植物细胞 中使靶DNA序列与目的DNA序列通过同源重组精确交换的方法，其中，通过去除侧翼具有同 向重复的二核苷酸序列的选定DNA的方法，将在该同源重组阶段用于暂时选择基因置换事 件的可选择或可筛选标记随后除去而不留下足迹。
[0007] 此外，已经描述允许设计切点罕见核酸内切酶以改变该酶的底物或序列特异性的 方法，由此允许在目的座位诱导双链断裂而不依赖于存在任何天然切点罕见核酸内切酶的 识别位点。简言之，可以使用杂合体制备嵌合限制性酶，该杂合体是在设计用于识别特异核 苷酸序列的锌指结构域和来自天然限制性酶（例如FokI)的非特异性DNA-切割结构域之 间的杂合体。这些方法已经描述在例如WO 03/080809, W094/18313或W095/09233中以及 Isalan et al. , 2001, Nature Biotechnology 19, 656-660 ；Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530中。通过从变体文库中进行选择来产生定制的大范围核酸酶 的另一方法，描述于W02004/067736中。具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的定制 大范围核酸酶或重新设计的大范围核酸酶也可以通过描述于W02007/047859中的合理设 计来获得。此外，W010/079430和W011/072246描述了，具有可定制的DNA结合特异性的转 录激活物样效应物（TALEs)蛋白的设计、以及如何能够将这些蛋白与核酸酶结构域（例如 FOKI)融合以产生具有针对基本上任何DNA序列的序列特异性的嵌合限制性酶，即TALE核 酸酶（TALENs)。
[0008]Bedell et al.，2012(Nature 491:pi14-118)和 Chen et al.，2011(Nature Methods 8:p753-755)描述了，分别使用TALENs或ZFNs在哺乳动物细胞中由寡聚物介导的 基因组编辑。
[0009] Elliot 等人（1998, Mol Cel Biol 18:p93-101)描述同源物介导的DSB修复试验， 其中发现掺入突变的频率与距切割位点的距离反相关。
[0010] W011/154158和W011/154159描述，以靶向方式修饰包含嵌合基因的转基因植物 的植物基因组的方法和手段，其中嵌合基因具有通常用于植物分子生物学的DNA元件；以 及重新设计以切割通常用于植物分子生物学的此类元件的大范围核酸酶。
[0011] PCT/EP12/065867描述，使用双链DNA断裂诱导酶在紧靠已有原种事件的位置、以 靶向方式修饰植物基因组的方法和手段。
[0012] 然而，仍然存在优化这些酶和修复分子以及将其用于增强靶向基因组工程的效 率、精确性和特异性的需要。本发明提供用于实现靶向序列修饰例如插入、缺失和置换的改 进方法，以下将在详述、实施例和权利要求书中描述该方法。
[0013] 发明概述
[0014] 在第一实施方案中，本发明提供一种用于在预选位点修饰真核细胞的基因组的方 法，该方法包括步骤：
[0015] a.通过如下方式在所述细胞的基因组中在双链DNA断裂诱导（DSBI)酶的识别位 点处或附近的切割位点处诱导双链DNA断裂（DSB)，其中所述方式为：在所述细胞中表达识 别所述识别位点并在所述切割位点诱导DSB的DSBI酶；
[0016] b.在所述细胞中引入修复核酸分子，其中所述修复核酸分子包含与所述预选位点 上游的区域具有同源性的上游侧翼区和/或与所述预选位点下游的DNA区域具有同源性的 下游侧翼区，以允许在所述侧翼区（一个或两个）和位于所述预选位点侧翼的所述DNA区 (一个或两个）之间同源重组；
[0017] c.选择所述基因组在所述预选位点具有修饰的细胞，其中所述修饰选自：
[0018] i?至少一个核苷酸的替代；
[0019] ii?至少一个核苷酸的缺失；
[0020] iii.至少一个核苷酸的插入；或
[0021] iv. i.-iii.的任何组合，
[0022] 该方法的特征在于，所述预选位点位于所述切割和/或识别位点之外。
[0023] 预选位点应不与切割和/或识别位点重叠。因此，预选位点，或其最接近的核苷 酸，可以距离切割位点至少25bp,例如距离切割位点至少28bp,至少30bp,至少35bp,至少 40bp,至少 43bp,至少 50bp,至少 75bp,至少 IOObp,至少 150bp,至少 200bp,至少 250bp 至少300bp,至少400bp,至少500bp,至少750bp,至少lkb,至少I. 5kb,至少2kb,至少 3kb，至少4kb，至少5kb，或至少10kb。换言之，上游侧翼区的3'末端应对齐在距离切割 位点至少25bp,至少28bp,至少30bp,至少35bp,至少40bp,至少43bp,至少50bp,至 少75bp,至少IOObp,至少150bp,至少200bp,至少250bp至少300bp,至少400bp或至少 500bp的位置，和/或下游侧翼区的5'末端应对齐在距离切割位点至少25bp，至少28bp，至 少30bp,至少35bp,至少40bp,至少43bp,至少50bp,至少75bp,至少IOObp,至少150bp, 至少200bp,至少250bp至少300bp,至少400bp,至少500bp,至少750bp,至少lkb,至少 I. 5kb,至少2kb,至少3kb,至少4kb,至少5kb,或至少IOkb的位置。
[0024] 在一个甚至进一步的实施方案中，DSBI酶在诱导所述DSB时产生5'突出端，例如 具有FOKI催化结构域的DSBI酶（例如TALEN或ZFN)。另一实施方案中，DSBI酶以二聚体 形式发挥功能，其中两个单体与总的识别序列内的不同结构域结合，例如TALEN或ZFN。另 一实施方案中，DSBI酶可以是TALEN，例如具有FOKI催化结构域的TALEN。
[0025] 再一实施方案中，修复分子也包含DSBI酶的识别和切割位点，优选地在侧翼区之 一中。修复分子可以是双链DNA分子。修复分子也可以包含目的核酸分子，其中所述目的 核酸分子将通过侧翼DNA区（一个或多个）和位于预选位点侧翼的所述DNA区（一个或多 个）之间的同源重组，任选地组合非同源性末端接合，插至预选位点。目的核酸分子可以包 含一个或多个可表达的目的基因，例如除草剂耐受性基因、昆虫抗性基因、疾病抗性基因、 非生物胁迫抗性基因、涉及油类生物合成或碳水化合物生物合成的酶、涉及纤维强度或纤 维长度的酶、涉及次生代谢物的生物合成的酶。目的核酸分子也可以包含可选择或可筛选 的标记基因。
[0026] 基因组在预选位点的修饰可以是置换或插入，例如至少43个核苷酸的置换或插 入。
[0027] 可以通过向细胞中引入编码DSBI酶的核酸分子，在所述细胞表达该DSBI酶。
[0028] 在一个实施方案中，真核细胞是植物细胞。
[0029] 预选位点可以位于原种事件的侧翼区中。
[0030] 真核细胞，例如植物细胞，可以进一步生长成真核生物，例如植物。
[0031] 本发明还提供DSBI酶（与包含至少一个侧翼区的修复核酸分子组合）的应用，例 如在切割后产生5'突出端的DSBI酶、或TALEN或ZFN的应用，用于在位于所述DSBI酶的 切割和/或识别位点之外的预选位点处修饰基因组。
[0032] 另一方面，本发明提供一种用于增加在真核细胞基因组的预选位点处的突变频率 的方法，该方法包括步骤：
[0033] a.通过如下方式在所述细胞的基因组中在双链DNA断裂诱导（DSBI)酶的识别位 点处或附近的切割位点处诱导双链DNA断裂（DSB)，其中所述方式为在所述细胞中表达识 别所述识别位点并在所述切割位点诱导DSB的DSBI酶；
[0034] b.向细胞中引入外源核酸分子；
[0035] c?选择其中DSB已经被修复的细胞；
[0036] DSB的修复导致所述基因组在所述预选位点的修饰，其中所述修饰选自：
[0037] i?至少一个核苷酸的替代；
[0038] ii?至少一个核苷酸的缺失；
[0039] iii.至少一个核苷酸的插入；或
[0040] iv. i.-iii.的任何组合，
[0041] 特征在于，该外源核酸分子也包含DSBI酶的识别位点和切割位点。
[0042] 在此方面，外源核酸分子可以包含与所述识别和切割位点5000bp内的基因组DNA 区具有至少80%序列同一性的长至少20nt的核苷酸序列。
[0043] 本发明还提供，可以通过任何前述方法获得的、在基因组的预定位点包含修饰的 真核细胞或真核生物，例如植物细胞或植物。
[0044] 本发明还提供，用于产生在基因组的预定位点处包含修饰的植物的方法，包括步 骤：使可以通过以上任何方法获得的植物与另一植物或其自身杂交，和任选地收获种子。[0045] 本发明还提供，种植可以根据以上任何方法获得的植物的方法，该方法包括向所 述植物或生长所述植物的基质施用化学品的步骤；
[0046] 在大田中种植植物的方法，该方法包括向可以根据以上任何方法获得的植物施用 化学化合物的步骤；
[0047] 产生经处理的种子的方法，该方法包括向可以根据以上任何方法获得的植物的种 子施用化学化合物的步骤；和
[0048] 用于生产饲料、食物或纤维的方法，该方法包括提供可以根据以上任何方法获得 的植物的群体和收获种子的步骤。
【附图说明】
[0049] 图1:示意性显示在外源DNA分子存在下在TALEN切割位点处的突变诱导，所述外 源DNA分子具有或不具有包含该TALEN的识别和切割位点的侧翼区域，见实施例3描述。 剪刀指示分别在bar编码区（带横纹的框）的核苷酸位置86和334的TALEN切割。外源 DNA分子（在此用于选择转化事件）包含潮霉素表达盒，该表达盒的侧翼具有与位于位置 140 (pTCV224)或479 (PTCV225)侧的bar基因同源的序列，或该表达盒的侧翼没有同源序列 (PTIB235)。选择hyg抗性转化体，随后筛选PPT敏感性一一指示bar基因的失活突变。
[0050] 图2:示意性显示，修复DNA分子在TALEN切割位点处或TALEN识别位点内的靶向 序列插入（TSI)，其中侧翼区包含或不包含一半TALEN识别位点（之部分），见实施例4描 述（第一部分）。剪刀指示在bar编码区（带横纹的框）的核苷酸位置334的TALEN切割， 其中TALEN识别位点放大，由两半结合位点（白色框）和一个间隔区（带点框）组成。所 有三个修复DNA载体都包含与所示bar基因（带横纹的框）位置334侧的区域相应的侧翼 区，PJR21精确地位于334位置侧翼并因此含有与两半结合位点（白框）和间隔区（带点 框）相应的序列，PJR23缺少与间隔区相应的序列但含有与结合位点区（白框）相应的序 列，PJR25缺少整个TALEN识别位点。用于鉴定TSI事件的引物的位置由深黑色箭头指出， 下方的双向箭头指示相应PCR片段的长度。修复DNA载体上的星号指示35S启动子的截短， 由此该启动子不再被引物IB448识别，从而允许明确鉴定在靶座位处的hyg盒插入。
[0051] 图3:示意性显示，远离TALEN切割位点的、修复DNA分子的靶向序列插入（TSI)， 其中修复DNA的侧翼区使hyg盒在切割位点的上游或下游靶向插入，见实施例4描述（第 二部分）。剪刀指示分别在bar编码区（带横纹的框）的核苷酸位置86和334的TALEN切 害J。修复DNApTCV224包含与bar基因的nt 1-144和141-552分别相应的侧翼区，导致hyg 盒插在位置144处，而修复DNA pTCV225包含与bar基因的nt 1-479和476-552分别相应 的侧翼区，导致hyg盒插在位置479处。用于鉴定TSI事件的引物的位置由深黑色箭头指 出，下方的双向箭头指示相应PCR片段的长度。修复DNA载体上的星号指示35S启动子的 截短，由此该启动子不再被引物IB448识别，从而允许明确鉴定在靶座位处的hyg盒插入。
[0052] 图4 :TALEN识别位点上的足迹：TALENbar334-pTCV225 TSI事件在切割位点的比 对。上方序列是未修饰的PTCV225序列，下方是鉴定的各种TSI事件（也参见表5)。间隔 区加框显示，TALENbar334的两半结合位点（BS1和BS2)以下划线指出。
[0053] 图5:示意性显示，使用修复DNA在远离TALEN切割位点的位置的等位基因手术， 其中侧翼区使GA二核苷酸靶向插入bar基因的位置169处，见实施例5描述。剪刀指示分 别在bar编码区（带横纹的框）的核苷酸位置86和334的TALEN切割。修复DNA pJR19包 含与bar基因的nt 1-169和170-552分别相应的侧翼区，导致GA插在位置169处。该插 入导致形成成熟前终止密码子和EcoRV位点。用于鉴定重组事件的引物的位置由深黑色箭 头指出，下方的双向箭头指示相应PCR片段的长度。引物AR35特异于在靶系的基因组和修 复DNA两者中均存在的nos终止序列。由于pJR19质粒含有完整的35S启动子，故使用特 异于基因组靶的引物（AR32)从非靶向插入事件中鉴定靶向插入事件。随后使用EcoRV切 割获得的PCR产物以确定GA的正确插入。
[0054] 发明详述
[0055] 本发明人发现，当以如下方式设计修复DNA分子用于TALEN诱导的基因组双链DNA 断裂（DSB)的同源物介导的修复时，可以增强靶向序列插入（TSI)，所述方式为侧翼区不对 应于基因组切割位点紧侧翼的DNA区域，例如当侧翼区不包含与切割位点和识别位点相应 的序列时。第二，本发明人发现，当设计修复DNA分子的侧翼区以进一步远离切割位点而非 在切割位点处或周围实现靶向插入时，可以使同源物介导的靶向序列插入（TSI)出乎意料 地进一步增加2-4倍。这减少了针对待评价其在特定座位处的切割的每个DSBI酶特异设 计修复分子的需要，同时另一方面允许使用仅一种酶组合各种修复分子实现在特定位点的 多重修饰。此外，常常可以被NHEJ修复的基因组DSB基本上导致唯一的足迹，从而允许区 分和跟踪产生的每个事件。最后，本发明人证实，DSBI酶介导的在基因组预选位点的突变 诱导在如下外源DNA分子存在时被显著地增加，其中所述外源DNA分子也含有该DSBI酶的 识别位点（并由此也可以被该DSBI酶切割）。
[0056] 因此，第一方面，本发明涉及一种用于在预选位点处修饰真核细胞的基因组（优 选地细胞核基因组）的方法，该方法包括步骤：
[0057] a.通过