新的酰基转移酶多核苷酸、多肽、及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及操纵细胞脂质产生和/或细胞脂质组成的组合物和方法。
【背景技术】
[0002] 植物油不仅能广泛用于食品工业以及作为饲料成分的一部分，还广泛地用作生物 燃料或用于各种保健食品和工业产品的制备中，因此，植物油是一种经济上重要的产品。在 植物自身内部，油是对于进行生长发育（特别是在种子萌发和早期植物生长阶段）至关重 要的一系列新陈代谢所必需的。考虑到其价值，生物技术领域对提高植物油产生并使其供 应更加可持续的研究兴趣愈加增长。
[0003] 植物油的主要成分为三酰甘油（TAG)。其为油料种子中储存脂质的主要形式以及 种子萌发和幼苗发育所需能量的主要来源。通过Kennedy途径的TAG生物合成包括从前体 sn-甘油-3-磷酸（G3P)开始的连续酰基化步骤。首先，G3P在由3-磷酸甘油酰基转移酶 (GPAT，EC2. 3. 1. 15)催化的反应中被乙酰CoA酯化形成溶血磷脂酸（LPA)。然后由溶血磷 脂酸酰基转移酶（LPAT;EC2. 3. 1. 51)催化第二酰基化步骤形成磷脂酸（PA)，其为甘油脂 生物合成的关键中间体。然后PA由磷脂酸磷酸酶（PAP;EC3. 1. 3. 4)脱磷酸化释放TAG的 中间前体sn-l，2-二酰基甘油（DAG)。最后DAG的sn-3位被二酰基甘油酰基转移酶（DGAT: EC2. 3. 1. 20)酰基化形成TAG。
[0004] 由于最后的催化作用是TAG生物合成中唯一的特有步骤，DGAT被称为指定用于三 酰甘油形成的酶。由于DAG位于TAG和膜磷脂生物合成之间的分支点，DGAT可能在调节甘 油脂合成途径中TAG的形成起到了决定性作用（Lung和Weselake, 2006,Lipids.Dec2006; 41 (12): 1073-88)。DGAT蛋白有两个不同家族。DGAT蛋白的第一家族（"DGAT1"）与乙酰 辅酶A:胆固醇酰基转移酶（"ACAT"）有关，并且在美国申请Nos. 6, 100, 077和6, 344, 548 中有所描述。DGAT蛋白的第二家族（"DGAT2"）与DGATl无关，并且在2004年2月5日公 开的PCT专利公开WO2004/011671中有描述。DGAT基因及其在植物中的用途的其他参考 文献包括PCT公开Nos.W02004/011, 671、W01998/055, 631 和W02000/001, 713,以及US专 利公开No. 20030115632。
[0005]DGATl通常是种子和衰老叶片中主要的TAG合成酶（Kaup等，2002,Plant Physiol. 129(4) :1616-26 ;综述参见Lung和Weselake2006,Lipids. ;41 (12) :1073-88 ; Cahoon等，2007,CurrentOpinioninPlantBiology. 10:236-244 ;以及Li等， 2010,Lipids. 45:145-157)。
[0006] 几十年来，提高油料作物（油菜、向日葵、红花、大豆、玉米、棉花、亚麻子、亚麻等） 的产量已经成为农业产业的主要目标。人们已经尝试了许多方法（包括传统育种和突变育 种以及遗传工程），通常收效甚微（Xu等，2008,PlantBiotechnolJ. ,6:799-818及其参考 文献）。
[0007] 尽管液态型生物燃料提供了很大的前景，但是利用生物原料的现实受到竞争用 途和可用量的限制。因此，对植物和微生物进行基因改造以克服上述缺陷成为众多研究 小组的重点；特别是三酰甘油（TAG)在植物组织、产油酵母和细菌中的积聚（Fortman等， 2008，TrendsBiotechnol26,375-381;0hlrogge等，2009,Science324，1019_1020)〇 TAG是纤维素能量密度的两倍的中性脂质并且能用于生产生物柴油。所述生物柴油是一 种具有最简单和最有效的制备工艺之一的高能量密度的理想生物燃料。目前已经通过 各种策略改造叶子中TAG的积聚使得其积聚量比野生型提高5-20倍，这些策略包括：过 表达种子发育转录基因（LECULEC2和WRIl) ;APS沉默（涉及淀粉生物合成的关键基 因）；CGI-58突变（中性脂质积聚的调节子）；以及在植物也在酵母中上调TAG合成酶 DGAT(二酰基甘油-0-酰基转移酶，EC2. 3.I. 20)(Andrianov等，2009,PlantBiotechJ 8,1-11;Mu等，2008，PlantPhysiol148,1042-1054;Sanjaya等，2011，PlantBiotechJ 9, 874-883 ;Santos_Mendoza等，2008,PlantJ54, 608-620;James等，2010,ProcNatl AcadSciUSA107, 17833 - 17838;Beopoulos等，2011，ApplMicrobiolBiotechnol 90, 1193-1206 ;Bouvier_Nav6等，2000，EurJBiochem267,85-96 ;Durrett等，2008，Plant J54,593-607)。然而，人们普遍认为要进一步提高TAG，抑制其在非产油组织以及一系 列发育阶段中的分解代谢可能是至关重要的（Yang和Ohlrogge, 2009,PlantPhysiol 150, 1981 - 1989)。
[0008] 在真核生物中上调三酰甘油（TAG)的产量和品质是很难实现的。在Kennedy途径 的酶中，二酰基甘油-0-酰基转務酶(DGAT)的比活性最低，并且它被认为是TAG合成中的 "瓶颈"。
[0009] 人们已经试图通过生物技术方法提高DGAT1，但收效甚微。例如Nykiforuk 等（2002,BiochimicaetBiophysicaActa1580:95-109)报导 了甘蓝型油菜 (Brassicanapus)DGATl的N端截短体，但是报导了大约50 %的低活性。McFie等 (2010,JBC.，285:37377-37387)报导了小鼠DGATl的N端截断使酶的比活性升高，但是也报 导了蛋白积聚水平大幅度降低。
[0010]近来，Xu等（2008,PlantBiotechnologyJournal, 6:799-818)在旱金 莲（Tropaeolummajus)(园艺旱金莲）DGAT1 (TmDGATl)序列内鉴别出共有序列 (X-Leu-X-Lys-X-X-Ser-X-X-X-Val)，作为SNFl相关蛋白激酶-I(SnRKl)的成员特有的靶 向基序，其中Ser为用于磷酸化的残基。SnRKl蛋白为一类Ser/Thr蛋白激酶，其已经日益 参与到植物的碳代谢的全面调节中，例如通过磷酸化作用使磷酸蔗糖合酶灭活（Halford &Hardie1998,PlantMolBiol. 37:735-48?综述）。Xu等（2008,PlantBiotechnology Journal，6:799-818)在TmDGATl酶的六个推定的功能区/基序进行了定向位点突变。在推 定的SnRKl靶点的丝氨酸残基（S197)的突变使得DGATl活性提高38% -80%，并且拟南 芥（Arabidopsis)中突变的TmDGATl的过表达使得油含量以每一种子计增加20-50%。 [0011]提供DGATl的改良形式是有益的，这能够克服现有技术中的一个或多个缺陷，并 且也可用于提高细胞内的油产量。
[0012] 本发明的一个目的在于提供改良的DGATl蛋白，以及利用其提高细胞脂质产生的 方法，并且/或是至少为公众提供有益的选择。
【发明内容】
[0013] 本发明的发明人提供了一种相比已知DGATl分子（特别是来自植物的已知DGAT1) 具有改善性能的新DGATl蛋白。本发明的新DGATl蛋白可以在细胞中表达以提尚细胞脂质 积聚。本发明的DGATl蛋白在细胞中的表达使得脂质水平高于申请人检测的任意几种其他 植物DGATl蛋白。
[0014] 编码多肽的多核苷酸
[0015] 在第一方面，本发明提供了编码DGATl多肽的分离的多核苷酸，所述DGATl多肽包 含序列SEQIDN0:39(ZmDGATl-长）或其变体或其片段。
[0016] 在一个实施方案中，所述变体与SEQIDN0:39具有至少70%同一性。在另一个实 施方案中，所述变体具有DGATl活性。
[0017] 在另一个实施方案中，所述DGATl多肽的DGATl活性高于至少一种其它的DGATl 蛋白。
[0018] 在一个实施方案中，与至少一种其它的DGATl蛋白相比，所述DGATl多肽的DGATl 活性至少高5%、更优选至少高10%、更优选至少高15%、更优选至少高20%、更优选至少 高25 %、更优选至少高30 %、更优选至少高35 %、更优选至少高40 %、更优选至少高45 %、 更优选至少高50%。
[0019] 优选地，所述至少一种其它的DGATl蛋白具有多肽SEQIDN0:44的氨基酸序列 (ZmDGATl-短）。
[0020] 在一个实施方案中，当在细胞中表达时，所述DGATl多肽具有更高的DGATl活性。
[0021 ] 在另一个实施方案中，所述DGAT1多肽具有比任意已知的DGAT1蛋白更高的DGAT1 活性。
[0022] 在一个实施方案中，当在细胞中表达时，所述DGATl多肽具有更高的DGATl活性。
[0023] 在一个实施方案中，与任意已知的DGATl蛋白相比，所述DGATl多肽的DGATl活 性至少高5%、更优选至少高10%、更优选至少高15%、更优选至少高20%、更优选至少高 25 %、更优选至少高30 %、更优选至少高35 %、更优选至少高40 %、更优选至少高45 %、更 优选至少高50%。
[0024] 在一个实施方案中，当在细胞中表达时，所述DGATl多肽具有更高的DGATl活性。
[0025] 在另一个实施方案中，与至少一种其它的DGATl蛋白相比，本发明的多肽的底物 特异性改变。
[0026] 在一个实施方案中，当在细胞中表达时，所述DGATl多肽的底物特异性改变。
[0027] 优选地，所述至少一种DGATl蛋白具有多肽SEQIDN0:44的氨基酸序列 (ZmDGATl-短）。
[0028] 在另一个实施方案中，当在细胞中表达时，与任意已知的植物DGATl蛋白相比，本 发明的多肽的底物特异性改变。
[0029] 在一个实施方案中，当在细胞中表达时，本发明的DGATl多肽的底物特异性改变。
[0030] 在另一个实施方案中，本发明的DGATl蛋白不在自然存在的植物中表达。
[0031] 多肽片段
[0032]优选地，所述片段包含本发明多肽中的至少50个连续氨基酸、更优选至少100个 连续氨基酸、更优选至少150个连续氨基酸、更优选至少200个连续氨基酸、更优选至少250 个连续氨基酸、更优选至少300个连续氨基酸、更优选至少350个连续氨基酸、更优选至少 400个连续氨基酸、更优选至少450个连续氨基酸.
[0033] 在一个实施方案中，在加入到另一DGATl多肽的至少部分中时，本发明的DGATl多 肽片段能赋予升高的DGATl活性。
[0034] 多核苷酸
[0035] 在另一个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含SEQID NO: 10 (ZmDGATl-长）或其变体或其片段的序列。
[0036] 在一个实施方案中，所述变体与SEQIDNO: 10具有至少70%同一性。在另一个实 施方案中，所述变体编码具有DGATl活性的多肽。
[0037] 多核苷酸片段
[0038] 在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸片段编码本发明多肽的片段。
[0039] 多肽
[0040] 在一个方面，本发明提供了一种多肽，其具有SEQIDNO: 39 (ZmDGATl-长）或其变 体或其片段的序列。
[0041] 在一个实施方案中，所述变体与SEQIDN0:39具有至少70%同一性。在另一个实 施方案中，所述变体具有DGATl活性。
[0042] 在另一个实施方案中，所述DGATl多肽比至少一种其它的DGATl蛋白有更高的 DGATl活性。
[0043] 在一个实施方案中，与至少一种其它的DGATl蛋白相比，所述DGATl多肽的DGATl 活性至少高5%、更优选至少高10%、更优选至少高15%、更优选至少高20%、更优选至少 高25 %、更优选至少高30 %、更优选至少高35 %、更优选至少高40 %、更优选至少高45 %、 更优选至少高50%。
[0044] 优选地，所述至少一种DGATl蛋白具有所述多肽SEQIDN0:44的氨基酸序列 (ZmDGATl-短）。
[0045] 在另一个实施方案中，所述DGAT1多肽具有比任意已知的DGAT1蛋白更高的DGAT1 活性。
[0046] 在另一个实施方案中，当在细胞中表达时，与至少一种其它的DGATl蛋白相比，本 发明的多肽的底物特异性改变。
[0047] 优选地，所述至少一种DGATl蛋白具有所述多肽SEQIDN0:44的氨基酸序列 (ZmDGATl-短）。
[0048] 在另一个实施方案中，当在细胞中表达时，与任意已知的植物DGATl蛋白相比，本 发明的多肽的底物特异性改变。
[0049] 优选地，所述片段包含本发明多肽中的至少50个连续氨基酸、更优选至少100个 连续氨基酸、更优选至少150个连续氨基酸、更优选至少200个连续氨基酸、更优选至少250 个连续氨基酸、更优选至少300个连续氨基酸、更优选至少350个连续氨基酸、更优选至少 400个连续氨基酸、更优选至少450个连续氨基酸.
[0050] 在一个实施方案中，在加入到另一DGATl多肽的至少部分中时，本发明的DGATl多 肽能赋予升高的DGATl活性。
[0051] 构建体
[0052] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种遗传构建体，其包含本发明的多核苷酸。
[0053] 细胞
[0054] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种细胞，其包含本发明的多核苷酸。优选 地，所述细胞、或其亲代经转化包含本发明的多核苷酸。
[0055] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种细胞，其包含本发明的遗传构建体。
[0056] 在一个优选的实施方案中，所述细胞表达本发明的多核苷酸。
[0057] 在一个优选的实施方案中，所述细胞表达本发明的多肽。
[0058] 在一个优选的实施方案中，所述细胞、或其亲代经转化或遗传修饰表达本发明的 多核苷酸或多肽。
[0059] 在一个实施方案中，当在细胞中表达时，与至少一种其它的DGATl蛋白相比，本发 明的多肽具有升高的DGATl活性。
[0060] 在一个实施方案中，与至少一种其它的DGATl蛋白相比，所述DGATl多肽的DGATl 活性至少高5%、更优选至少高10%、更优选至少高15%、更优选至少高20%、更优选至少 高25 %、更优选至少高30 %、更优选至少高35 %、更优选至少高40 %、更优选至少高45 %、 更优选至少高50%。
[0061] 优选地，所述至少一种DGATl蛋白具有多肽SEQ ID N0:44的氨基酸序列 (ZmDGATl-短）。
[0062] 在另一个实施方案中，当在细胞中表达时，与任意已知的植物DGATl蛋白相比，本 发明的多肽具有升高的DGATl活性。
[0063] 在另一个实施方案中，与对照细胞相比，所述细胞产生更多的脂质。
[0064] 在一个实施方案中，与对照细胞相比，所述细胞产生至少多5%、优选至少多 10%、优选至少多15%、优选至少多20%、优选至少多25%、优选至少多30%、优选至少多 35%、优选至少多40%、优选至少多45%、优选至少多50%、优选至少多55%、优选至少多 60%、优选至少多65%、优选至少多70%、优选至少多75%、优选至少多80%、优选至少多 85%、优选至少多90%、优选至少多95%、优选至少多100%、优选至少多105%、优选至少 多110 %、优选至少多115 %、优选至少多120 %、优选至少多125 %、优选至少多130 %、优选 至少多135%、优选至少多140%、优选至少多145%、优选至少多150 %的脂质。
[0065] 在另一个实施方案中，当在细胞中表达时，与至少一种其它的DGATl蛋白相比，本 发明的DGATl多肽的底物特异性改变。
[0066] 优选地，所述至少一种DGATl蛋白具有多肽SEQ ID N0:44的氨基酸序列 (ZmDGATl-短）。
[0067] 在另一个实施方案中，当在细胞中表达时，与任意已知的植物DGATl蛋白相比，本 发明的DGATl多肽的底物特异性改变。
[0068] 在另一个实施方案中，与对照细胞相比，所述细胞的脂质组成改变。
[0069] 在一个实施方案中，与对照细胞相比，三酰甘油中16:0的比例改变。
[0070]在一个实施方案中，与对照细胞相比，三酰甘油中16:0的比例改变至少1 %、优 选至少2 %、更优选至少3 %、更优选至少4 %、更优选至少5 %、更优选至少6 %、更优选至 少7 %、更优选至少8 %、更优选至少9 %、更优选至少10 %、更优选至少11 %、更优选至少 12 %、更优选至少13 %、更优选至少14 %、更优选至少15 %、更优选至少16 %、更优选至少 17%、更优选至少18%、更优选至少19%、更优选至少20%。
[0071]在另一个实施方案中，改变的脂质组成中三酰甘油中16:0的比例在6%至16%的 范围内。在该实施方案中，三酰甘油中16:0的比例的改变在6%至16%的范围内。
[0072] 在另一个实施方案中，相比于对照细胞，三酰甘油中18:0的比例改变。
[0073] 在一个实施方案中，相比于对照细胞，所述细胞中三酰甘油中18:0的比例改变至 少1 %、优选至少2 %、更优选至少3 %、更优选至少4 %、更优选至少5 %、更优选至少6 %、 更优选至少7 %、更优选至少8 %、更优选至少9 %、更优选至少10 %、更优选至少11 %、更优 选至少12 %、更优选至少13 %、更优选至少14 %、更优选至少15 %、更优选至少16 %、更优 选至少17%、更优选至少18%、更优选至少19%、更优选至少20%。
[0074] 在另一个实施方案中，改变的脂质组成中三酰甘油中18:0的比例在7%至15%的 范围内。在该实施方案中，三酰甘油中18:0的比例的改变在7%至15%的范围内。
[0075] 在另一个实施方案中，相比于对照细胞，所述细胞中三酰甘油中18:1的比例改 变。
[0076] 在一个实施方案中，相比于对照细胞，所述细胞中三酰甘油中18:1的比例改变至 少1 %、优选至少2 %、更优选至少3 %、更优选至少4 %、更优选至少5 %、更优选至少6 %、 更优选至少7 %、更优选至少8 %、更优选至少9 %、更优选至少10 %、更优选至少11 %、更优 选至少12 %、更优选至少13 %、更优选至少14 %、更优选至少15 %、更优选至少16 %、更优 选至少17%、更优选至少18%、更优选至少19%、更优选至少20%。
[0077] 在另一个实施方案中，改变的脂质表达中三酰甘油中18:1的比例在39%至55% 的范围内。在该实施方案中，三酰甘油中18:1的比例的改变在39%至55%的范围内。
[0078] 对照细胞可以为未用本发明的多核苷酸或构建体转化以表达本发明的多肽的相 同类型的任意细胞。所述对照细胞也可用"空"载体转化，其中所述空载体不包含对应于本 发明的多核苷酸或表达本发明多肽的插入序列。
[0079] 在一个实施方案中，所述对照细胞为未转化细胞。在另一个实施方案中，所述对照 细胞为表达SEQIDNO:44(ZmDGATl-短）多肽的转化细胞。在另一个实施方案中，所述对 照细胞为表达任意已知植物DGATl蛋白的转化细胞。
[0080] 细胞也被转化以表达油质蛋白
[0081] 在一个实施方案中，所述细胞也被转化以表达以下至少一者：油质蛋白、油体 固醇蛋白、油体钙蛋白、聚油质蛋白、以及包括至少一个人工引入的半胱氨酸的油质蛋白 (W02011/053169)。
[0082] 在一个实施方案中，所述细胞为植物细胞。
[0083] 植物
[0084] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种植物，其包含本发明的多核苷酸。优选 地，所述植物、或其亲代经转化包含本发明的多核苷酸。
[0085] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种植物，其包含本发明的遗传构建体。
[0086] 在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种植物，其包含本发明的植物细胞。 [0087] 在一个优选的实施方案中，所述植物表达本发明的多核苷酸。
[0088] 在一个优选的实施方案中，所述植物表达本发明的多肽。
[0089] 在一个优选的实施方案中，所述植物、或其亲代经转化或遗传修饰后表达本发明 的多核苷酸或多肽。
[0090] 在一个实施方案中，当在植物中表达时，与至少一种其它的DGATl蛋白相比，本发