签。上表2中示出了嵌合体构建体以及其对应肽序列的编号。
[0395] 酿酒酵母四倍突变体（H1246)中，所有4个中性脂质生物合成基因被干扰 (Sandager等，2002,TheJournalofBiologicalChemistry, 277:6478-6482)，如 Elble(1992,BioTechniques13, 18-20)，转化上述酿酒酵母并且通过其在尿啼啶的缺乏下 能够生长的能力进行筛选。通常，酿酒酵母在含有0. 67%YNB、不含尿嘧啶且含有2%葡萄 糖的合成培养基（SC-U)中需氧过夜生长。将来自过夜培养物的细胞接种在200mL的诱导培 养基（含有2 %半乳糖和1 %棉子糖的SC-U)中，至初始0D_为0. 4。使细胞继续在30 °C、 200rpm转速振动下生长直到稳定期后期，通常是48小时。在1500xg下离心5分钟收获细 胞，然后用蒸馏水洗涤细胞团，可直接用于后续分析或保留在_80°C下备用。用于中性脂质 提取的细胞团经冷冻干燥48小时并储存在-20°C的冰箱内备用。
[0396] 酿酒酵母的脂质分析
[0397] 精确称量大约IOmg的冻干酵母细胞原料，然后用玻璃珠涡旋混合1分钟使其裂 解。在热的氯化氢的甲醇溶液中提取裂解物用于脂肪酸甲酯（FAME)分析（Browse等， 1986,Anal.Biochem. 152, 141-145)〇
[0398] 为了进行FA组成分析，将大约50mg的冻干酵母置于13-mm螺旋盖试管中，加入 等体积的玻璃珠，然后高速涡旋混合3次，每次1分钟。然后加入50yg的19:OTAG内标、 2. 4mL的溶于MeOH的0. 17MNaCl，将所述混合物进行涡旋混合15秒，然后加入4. 8mL的庚 烷，并混合全体内容物。
[0399] 然后在80°C水浴中孵育溶液2小时，期间不晃动。孵育后，使溶液冷却至室温。冷 却后，将上层（脂质层）转移至新的螺旋盖试管中，并在氮蒸汽下蒸发至干燥。然后将经干 燥的残余物溶于Iml庚烷中并彻底混合用于TAG SPE分离，所述分离使用Strata Si-I硅 胶柱（Phenomenwx，8B-S012_EAK)〇
[0400] 用甲醇预处理并用庚烷平衡硅胶柱，使ImLTAG提取物（包括50yg17:0TAG内 标）通过该预平衡的柱子，接着是1.2mL的庚烷，然后是2mL的氯仿：庚烷（l:9v/v)，收集 洗脱液。收集到的全部洗脱液在氮蒸汽下蒸发至干燥，并且残余物用于FAME提取。
[0401]提取的TAG的FAME
[0402] 向上述的TAG残余物中加入10yL的内标15:OFA(4mg/mL溶于庚烷），以及ImL含 有5% 2, 2-二甲氧基丙烷（作为去水剂）的氯化氢的甲醇溶液（IN)。
[0403] 然后用氮气吹扫所述试管，然后直接用聚四氟乙烯内衬盖密封，并在80°C水浴中 加热1小时。冷却后，加入0. 6mL庚烷和I.OmL的0. 9 % (w/v)NaCl，然后以500rpm涡旋混 合所述混合物1分钟。
[0404] 从顶部庚烷层收集100yL，并转移到小瓶中的平底玻璃插瓶，以供FAMESGC/MS 分析。
[0405] 蛋白提取和胰蛋白酶消化
[0406] 用裂解液（50mM磷酸钠、pH7. 4、ImMEDTA、5%甘油、ImMPMSF)洗涤酵母细胞团， 然后重悬于500yL裂解缓冲液中，加入玻璃珠并以中速涡旋混合2次，每次30秒，由此破 坏细胞。细胞碎片在1000 xg下离心5分钟形成小团，将上清液转移到新试管中，并将全部 细胞膜在100,OOOxg下通过超速离心法离心1小时形成小团。用或不用去垢剂（1%十二烷 基麦芽糖苷）将膜蛋白重悬于裂解缓冲液中，并使用QubitIT定量试剂盒在Qubit荧光计 上定量。
[0407] 向50yL的蛋白提取物中加入胰蛋白酶，使酶的终浓度达到25yg/mL，然后所述 混合物在30°C下孵育30分钟。加入来自大豆的胰蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich目录 号#T6414)，直到终浓度达到0. 4yg/yL从而终止反应。加入胰蛋白酶抑制剂后，加入4x SDS上样染料和IOx还原剂（Invitrogen公司），在70°C下孵育所述蛋白质10分钟，然后 进行SDS-PAGE，之后进行免疫印迹。所述印迹用下述两者之一作为探针：以1:2500稀释 的抗V5-HRP抗体（目录号#1?96125,Invitrogen公司）、或在兔（SC-33630,SantaCruz Biotechnology公司）中产生的以1:200稀释的抗Kar2(y-115)抗体。抗Kar2用于检测酵 母蛋白Kar2,该蛋白为内质网腔内定位蛋白（Rose等，1989,Cell57, 1211-1221)，其作为 对照以示出完整微粒体的存在。
[0408] 嵌合体DGATl在甘蓝型油菜中的表达
[0409] 将如上所述的相同的策略用于产生多种嵌合的DGATl构建体，以在甘蓝型油菜 中的种子中表达。这包括优化亲代的旱金莲DGAT1、玉米-LDGATl和玉米-SDGATl(氨 基酸序列分别为表1中的SEQIDN0:34、39和44)以用于在GeneArtAG公司提供的甘 蓝型油菜中表达。旱金莲构建体经工程改造为含有单独的点突变S197A(Xu等，2008,Plant BiotechnologyJournal, 6:799-818)。如下表3所示，所有的构建体都经工程改造使其具有 优化的Kozak，拟南芥UBQlO内含子和四核苷酸终止密码子，如Scott等所述（2010,Plant BiotechnologyJournal, 8:912-917)〇
[0410] 表 3
[0411]
[0412] 对甘蓝型油菜优化的构建体使用与生成在酿酒酵母中表达的嵌合体所用相同的 消化方式以产生嵌合体Tm-ZmL和ZmL-Tm(S189A);得到表4所列出的肽序列。
[0413] 表 4
[0414]
[0415] 将亲代DGAT以及它们的嵌合体转入GatewayK兼容二元载体pMD107(来自Dr MarkSmith的惠赠，NRCSaskatoon，SK，Canada，S7N0W9)，使它们受到种子特异性油菜 籽蛋白启动子（EllerstrdiTi等，1996,PlantMolecularBiology,第 32 卷，第 6 期，第 1019-1027页）的控制。
[0416] 植物转化
[0417] 使用子叶共培养方法（得自Maloney等，1989,PlantCellR印.8, 238-242)，通过 根瘤土壤杆菌（GV3101)转化甘蓝型油菜（cv.DH12075)。对照株系含有空载体，并且在鉴定 时，无姊妹株的株系随后可用作真实对照。
[0418] 可得到大约200种T。转化株系，并且通过GC分析其相应的Ti自交种子中的油含 量。根据油含量或种子重量（8株），可选择大约50种独立的转基因株系（包括对照株系） 用于下一代（10个植物/株系）。
[0419] 培植T1植物，并通过PCR筛选拷贝数和鉴别无姊妹株的株系。通过NMR分析T2种 子中的油含量，每份重复三次。
[0420] 玉米-L和旱金莲DGATl在亚麻荠中的表达
[0421] 上述策略也可用于产生多种嵌合的DGATl构建体以在亚麻荠和其他植物的种子 中表达。
[0422] 通过GENEARTAG(德国）或GeneScript(美国）合成具有修饰的序列。通过 GENEARTAG(德国）或GeneScript(美国）合成具有修饰的序列。为了在芸苔属中表达 而优化所述序列，并且该序列包括来自拟南芥DGATl的内含子（SEQIDN0:102)_内含子 3。每条序列侧翼添加了合适的attL重组位点使其能够克隆入克隆Gateway'<适应载体 (Invitrogen公司）。
[0423]表 5
[0424]
[0425] 将亲代DGAT及其修饰形式转入GatewayK -兼容性二元pRShlGateway适应性 二元载体（Winichayakul等，2009,Biotechnol.Appl.Biochem. 53, 111 - 122)，其中用甘蓝 型油菜油菜籽蛋白启动子（SEQIDNO: 115)置换CaMV35S启动子以修饰所述载体。
[0426] 亚麻荠转化
[0427]使用花序浸渍法（floral-dip)(由CloughandBent,I"8,Plant J. 16(6) :735-745的方法更改），通过根瘤土壤杆菌（GV3101)转化亚麻荠（参照Calena)。 基本上，在受控环境下，将种子播种在IOcm盆的栽培基质中，种植大约6周后，在真空 (70-80英寸Hg)下在合适的农杆菌GV3101细胞的过夜培养物（重悬于花序浸渍缓冲液中） 中浸渍花5-14分钟。真空转化后，通过用黑色塑料膜部分覆盖从而在低光照条件下保留植 物24小时。大约每隔10-12天（对应于开花期）重复进行真空转化三次。在受控环境（日 长16小时、21-24°C、65-70%相对湿度）下，使植物在栽培基质中生长。
[0428] 收集产生的T1种子，并在22°C下用连续光照使其在半强度MS培养基（pH5. 6)筛 选平板（含有1% (w/v)蔗糖、300mg/L特美汀和25mg/LDL-草丁膦）上发芽并使秧苗生 成以筛选抗除草剂的转化株。也可用免疫印迹法筛选T2自交种子中V5表位是否存在。
[0429] 可通过GC分析T2自交种子中的油含量。基于油含量或种子重量选择大约50个 独立的转基因株系（包括对照株系）用于下一代（10个植物/株系）。种植T2植物，并用 PCR筛选拷贝数和鉴定无姊妹株的株系。通过NMR或GC/MS分析1~2种子中的油含量，每份 重复三次。
[0430] 结果
[0431] 在酿酒酵母中，与仅具有其它DGATl序列的情况相比，将本发明的DGATl多肽片段 添加到其它DAGTl序列上增强了脂质产生
[0432] 表8-14示出了各种嵌合体DGATl的脂质产率，其中N端或C端区域来自本发明的 DGATl序列，而该蛋白的其余部分来自另一植物DGATl。脂质产率用每升所产生的脂质的克 数（由此补偿生长速度的任何差异）表示、或是用已经校正处理为对应未修饰的亲代DGATl 的脂质产率的百分比。
[0433] 表5比较了亲代DGATl彼此、以及亲代DGATl与使用一种供体亲代的N端区域以 及不同的供体亲代的C端区域制备的嵌合体DGAT1。亲代DGATl用粗体标示。
[0434] 出乎意料的是，本发明的DGATl序列比任意其它所检测的序列显示出了更高的活 性（以脂质产率表示）。
[0435] 32小时的脂质产率已经针对产脂质最高的亲代（玉米-L)进行了校正处理，并且 以升序排列。
[0436]表6
[0437]
[0438] 结果也示出了在拟南芥DGATl亲代的C端区域添加玉米-L N端区域导致其相对 于全长拟南芥DGATl序列脂质，产率增加（参见SEQ ID NO:84 vs SEQ ID NO: 59)。
[0439] 结果也示出了在旱金莲DGATl序列的C端或N端区域分别添加玉米-L N端或C 端区域导致其相对于全长旱金莲DGATl序列，脂质产率增加（参见SEQ ID N0:88和94 vs SEQ ID NO:89)。
[0440] 结果也示出了在水稻-S DGATl序列的C端或N端区域分别添加玉米-L N端或C 端区域导致其相对于全长水稻-S DGATl序列脂质产率增加（参见SEQ ID NO:85和69 vs SEQ ID NO:65)〇
[0441] 结果也示出了在水稻-L DGATl序列的C端或N端区域分别添加玉米-L N端或C 端区域导致其相对于全长水稻-L DGATl序列，脂质产率增加（参见SEQ ID N0:86和75 vs SEQ ID NO:71)〇
[0442] 结果也示出了在玉米-S DGATl序列的C端或N端区域分别添加玉米-L N端或C 端区域导致其相对于全长玉米-S DGATl序列，脂质产率增加（参见SEQ ID N0:87和81 vs SEQ ID NO:77)。
[0443] 总之，将本发明的玉米-L多肽片段（N端区域或C端区域）添加到另一DGATl序 列，能够通过所述组合序列得到比其它DGATl序列可获得的脂质产率更高的细胞内脂质产 率。
[0444] 在甘蓝型油菜中，与仅具有其它DGATl序列的情况相比，向其它DGATl序列添加本 发明的DGATl多肽的片段能提高脂质产生
[0445] 本发明的玉米-L多肽片段（N端区域或C端区域）也可以与其它植物DGATl的片 段组合提高甘蓝型油菜种子中的油含量。表21-22示出了多种表达嵌合体DGATl的转基因 植物种子的油含量。表6中种子油含量以基于干物质（DM)的％表不、以及以相对于对应未 修饰DGATl亲代的种子油含量的校正百分比表示。
[0446]表7
[0447]
[0448] 在表7中，种子中的油含量用基于干物质（DM)的％、以及相对于对应分离无姊妹 株（NullSib)的种子油含量的校正百分比来表不。
[0449]表 8
[0450]
[0451] 总之，这些结果示出了本发明的玉米DGATl-L多肽的片段（N端区域或C端区域） 可以添加到旱金莲DGATSl序列的多部分中，从而相对于全长旱金莲DGATl提高了油产率。
[0452] 讨论
[0453] 因此，申请人已经示出了本发明的新的玉米DGATl-L蛋白可以用于操纵细胞脂质 积聚。与申请人检测的任意其它DAGTl蛋白相比，本发明的DGATl在提高细胞内脂质含量 方面还具有更高的活性。申请人也示出了本发明的DGATl的亚序列或片段可与其它DGATl 的多个部分组合从而相对于其它DGATl序列所示出的活性提供更高的活性。
【主权项】
1. 一种编码DGATl多肽的分离的多核苷酸，所述DGATl多肽包含序列SEQ ID NO: 39 (ZmDGATl-长）或其变体或其片段。2. 权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述变体与SEQ ID NO: 39有至少70%同 一性。3. 权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中所述变体具有DGATl活性。4. 权利要求1至3中任一项所述的分离的多核苷酸，其中当在细胞中表达时，所述 DGATl多肽具有以下至少一者： a) 比至少一种其它的DGATl蛋白更高的DGATl活性；以及 b) 与至少一种其它的DGATl蛋白相比，底物特异性改变。5. 权利要求4所述的分离的多核苷酸，其中所述至少一种其它的DGATl蛋白具有多肽 SEQ ID NO:44 (ZmDGATl-短）的氨基酸序列。6. 权利要求1至5中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述DGATl多肽具有以下至 少一者： a) 比任意已知的DGATl蛋白更高的DGATl活性；以及 b) 与任意已知的DGATl蛋白相比，底物特异性改变。7. 权利要求1所述的分离的多核苷酸、变体或片段，其中所述片段包含序列SEQ ID NO: 39 (ZmDGATl-长）中的至少50个连续氨基酸。8. -种遗传构建体，包含权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸。9. 一种细胞，包含权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸。10. 权利要求9所述的细胞，其中所述细胞、或其亲代经转化后包含所述多核苷酸。11. 一种细胞，包含权利要求8所述的遗传构建体。12. 权利要求8至11中任一项所述的细胞，其表达权利要求1至7中任一项所述的多 核苷酸。13. 权利要求12所述的细胞，其表达所述DGATl多肽。14. 权利要求12至14中任一项所述的细胞，其中表达的所述DGATl多肽与以下一者或 两者相比具有提尚的DGATl活性： a) 至少一种其它的DGATl蛋白；以及 b) 任意其它已知的DGATl蛋白。15. 权利要求12至14中任一项所述的细胞，其中表达的所述DGATl多肽与以下一者或 两者相比底物特异性改变： a) 至少一种其它的DGATl蛋白；以及 b) 任意其它已知的DGATl蛋白。16. 权利要求8至15中任一项所述的细胞，其比对照细胞产生更多的脂质。17. 权利要求8至16中任一项所述的细胞，与对照细胞相比，该细胞的脂质组成改变。18. 权利要求9至17中任一项所述的细胞，其为植物细胞。19. 权利要求9至18中任一项所述的细胞，该细胞也被转化以表达以下至少一者：油 质蛋白、油体固醇蛋白、油体钙蛋白、聚转化油质蛋白、以及包括至少一个人工引入的半胱 氨酸的油质蛋白。20. -种植物，包含权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸。21. 权利要求20所述的植物，其中所述植物、或其亲代经转化后包含所述多核苷酸。22. -种植物，包含权利要求8所述的遗传构建体。23. -种植物，包含权利要求18所述的植物细胞。24. 权利要求19至23中任一项所述的植物，其中所述植物或其亲代经转化或遗传修饰 从而表达所述多核苷酸或编码的多肽。25. 权利要求19至24中任一项所述的植物，其中表达的所述多肽与至少一种其它的 DGATl蛋白相比具有更高的DGATl活性。26. 权利要求19至25中任一项所述的植物，其中与对照植物相比，所述植物在其组织 或其部分的至少一者中、或作为整体产生更多的脂质。27. 权利要求19至26中任一项所述的植物，其中与对照植物相比，所述植物在其组织 或其部分的至少一者中、或作为整体，脂质组成改变。28. 权利要求19至26中任一项所述的植物，其中所述植物还被转化以表达以下至少一 者：油质蛋白、油体固醇蛋白、油体钙蛋白、聚油质蛋白、以及包括至少一个人工引入的半胱 氨酸的油质蛋白。29. -种多肽，其具有序列SEQ ID NO: 39 (ZmDGATl-长）、或其变体、或其片段。30. 权利要求29所述的多肽变体或片段，其中所述变体与SEQ ID NO:39有至少70% 同一性。31. 权利要求29或30所述的多肽变体或片段，其中所述变体具有DGATl活性。32. 权利要求20至28中任一项所述的植物的部分、繁殖体或子代。33. 权利要求32所述的部分、繁殖体或子代，其中所述部分、繁殖体或子代包含权利要 求1至19和29至31中任一项所述的多核苷酸、构建体、植物细胞或多肽中的至少一者。34. 权利要求32或33所述的部分、繁殖体或子代，其中所述部分、繁殖体或子代、或其 亲代植物已经被转化以包含权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸或构建体。35. 权利要求32或34所述的部分、繁殖体或子代，其中所述部分、繁殖体或子代表达权 利要求1至7和29至31中任一项所述的多核苷酸或多肽。36. 权利要求32或34所述的部分、繁殖体或子代，其中与对照部分、对照繁殖体或对照 子代或对照植物的部分、繁殖体或子代相比，所述部分、繁殖体或子代产生更多的脂质。37. 权利要求32或34中任一项所述的部分、繁殖体或子代，其与对照部分、对照繁殖体 或对照子代或对照植物的部分、繁殖体或子代相比，脂质组成改变。38. -种动物饲料，包含权利要求1至30以及37至40中任一项所述的多核苷酸、多 肽、构建体、细胞、植物细胞、植物、植物部分、繁殖体和子代中的至少一者。39. -种生物燃料原料，其包含权利要求1至30以及37至40中任一项所述的多核苷 酸、多肽、构建体、细胞、植物细胞、植物、植物部分、繁殖体和子代中的至少一者。40. -种制备脂质的方法，所述方法包括培植经转化或遗传修饰的细胞、植物细胞或植 物，从而表达权利要求1至7和29至31中任一项所述的多核苷酸或多肽，其中所述植物通 过所表达多肽的活性产生油。41. 权利要求40所述的方法，其中所述多肽的DGAT1活性使得所述细胞、植物细胞或植 物产生脂质。42. -种制备脂质的方法，所述方法包括从权利要求9至28以及37至40中任一项所 述的细胞、植物细胞、植物、植物部分、繁殖体和子代的至少一者中提取脂质。43. 权利要求40或42所述的方法，其中所述脂质为三酰甘油（TAG)。44. 权利要求40或42所述的方法，其中所述脂质被加工为以下的至少一种： a) 燃料， b) 油化学品， c) 营养油， d) 化妆油， e) 多不饱和脂肪酸（PUFA)，和 f) a)至e)的任意组合。
【专利摘要】本发明提供了一种新的DGAT1蛋白，其与已知DGAT1蛋白相比(特别是来自植物的已知的DGAT1蛋白)具有改善的性能。本发明的新的DGAT1蛋白可以在细胞中表达以提高细胞脂质积聚。本发明的DGAT1蛋白在细胞中的表达使得脂质水平高于申请人检测的任意几种其它的植物DGAT1蛋白。本发明提供了编码新DGAT1蛋白SEQ？ID？NO:39的多核苷酸、包含该多核苷酸的构建体、细胞、植物部分或子代，以及本发明的多核苷酸和多肽的使用方法。
【IPC分类】C12N15/29, C12P7/64
【公开号】CN105121646
【申请号】CN201380069487
【发明人】尼古拉斯·约翰·罗伯茨, 艾米·克里斯蒂娜·柯伦, 宋路泰·威尼查亚库, 玛丽萨·罗丹, 理查德·威廉·斯科特
【申请人】农业研究有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2013年10月22日
【公告号】CA2889980A1, EP2914725A2, US20150252378, WO2014068438A2, WO2014068438A3