衍生自MCoTI-II变体的人matriptase的高效力抑制剂的制作方法
【专利说明】衍生自MCoTMI变体的人matriptase的高效力抑制剂
[0001] 本发明涉及胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶matriptase的新型高效力肽类抑制剂。
[0002] 胰蛋白酶是在脊椎动物的小肠中普遍发现的最突出的消化酶之一。其耐人寻味的 分子结构包括著名的催化三联ASP-His-Ser作为核心特征实施其蛋白水解活性。该原型架 构和切割碱性残基之后的肽键的能力构成了被称为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的整类的生 物催化剂的结构和功能基础。该酶家族的成员参与多种生物过程和以可溶形式或作为膜锚 定实体存在。II型跨膜丝氨酸蛋白酶（TTSP)，例如，也通过N-末端结合于细胞表面，并已 被表征为各种效应分子的细胞外周行进和活化的重要调节子。[Antalis, Prog. Mol. Biol. Transl. Sci.,99(2011),l-50 ； Antal is, Biochem. J. , 428 (2010), 325 - 346 ；Bugge, J. Biol. Chem.，284(2009)23177-23181]。通过经由特定TTSP的内切蛋白酶切割从无活性前 体通过产生肽类激素、生长和分化因子、受体、酶和粘附分子的活性形式。因此，它们在细胞 发育和动态平衡的维持中起着关键作用。
[0003] 具有药学相关性的膜-锚定的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的充分研究的实例是 matriptase。它在健康组织中的上皮细胞表面上广泛表达，其中其蛋白水解活性受天然蛋 白酶抑制剂如肝细胞生长因子抑制剂-1和2 (HAI-1、HAI-2)精确调控。然而，该生理抑制 剂-蛋白酶平衡的失调被认为会促进病理进程。实际上，许多研究将matriptase的过表达 与上皮肿瘤以及骨关节炎和动脉粥样硬化的发生和进展联系起来。此外，Napp等人在鼠常 位胰腺肿瘤模型中观察到显著的体内matriptase活性，并显示活性位点抑制剂的施用显 著减少了底物分析物的蛋白水解。因此，强效和选择性的matriptase抑制剂具有巨大的治 疗意义，并且其开发是一项具有挑战性的任务。迄今为止，已经报道了许多呈现个位数纳摩 尔至亚纳摩尔抑制常数的小的合成的有机化合物以及大的抗体片段。
[0004] 本申请涉及微蛋白（microprotein)，优选形成胱氨酸结的微蛋白（即属于抑制剂 胱氨酸结（ICK)多肽的家族），或者编码所述微蛋白的多核苷酸用于制备药物组合物的用 途以及相应的治疗方法，所述药物组合物用于治疗或预防可通过抑制matriptase的活性 来治疗或预防的疾病。本发明还涉及微蛋白用于抑制matriptase活性，用于纯化微蛋白， 作为matriptase的载体分子和用于检测或定量样品中的matriptase的用途，包括相应的 诊断应用。
[0005] 本发明的化合物作为matriptase的抑制剂是有活性的并且特异性结合 matriptase。
[0006] 相信这些化合物可用于预防或治疗癌性病况，其中matriptase的活性恶化所述 癌性病况。
[0007] 本发明的化合物的另一种用途是减缓癌性病况的进展和细胞基质的伴随降解。
[0008] 本发明的化合物作为matriptase的丝氨酸蛋白酶活性的抑制剂是有活性的。 因此，含有适合于连接于固体/凝胶载体的位点的这些化合物可在体外用于亲和层析， 以使用常规亲和层析法从样品纯化matriptase或从样品除去matriptase。使用常规方 法将这些化合物直接或通过适当的连接载体附着或偶联于亲和层析。见，例如，Current Protocols in Protein Science, John Wiley&Sons(J.E. Coligan 等，编辑，1997)和 ProteinPurificationProtocols,HumanaPress(S.Doonan，编辑，1966)和其中的参考文 献。
[0009] 具有matriptase或MTSPl丝氨酸蛋白酶抑制性活性的本发明的化合物用于体外 测定来测量样品中的matriptase或MTSPl活性和复合的与非复合的matriptase或MTSPl 的比率。这些测定还可用于监测组织样品（诸如来自活组织检查）中的matriptase或 MTSPl活性水平，或监测其中matriptase或MTSPl活性测量是有帮助的任何临床状况的 matriptase活性和复合的与未复合的matriptase的比率。可将测定样品中的丝氨酸蛋白 酶活性的测定与ELISA组合使用，所述ELISA测定matriptase或MTSPl(无论是复合的还 是非复合的）的总量以测定复合的与非复合的matriptase的比率。
[0010] 各种动物模型可用于评价本发明的化合物减少原发性肿瘤生长或减少转移的发 生的能力。
[0011] 这些模型可包括基因改变的啮齿类动物（转基因动物）、最初来源于啮齿类动物 或人的和移植至同基因或免疫受损的宿主的可移植肿瘤细胞，或它们可包括专门的模型， 诸如下述被设计来评价化合物抑制据信是肿瘤生长所必需的血管生长（血管生成）的能力 的CAM模型。
[0012] 还可使用其它模型。
[0013] 适当的动物模型被选择来基于一组相关标准评价本发明中描述的化合物的体内 抗肿瘤活性。例如，一个标准可能是待检查的特定肿瘤的matriptase或MTSPl和/或 matriptase或MTSPlmRNA的表达。满足该标准的两个人前列腺源性肿瘤是LnCap和PC-3 细胞系。另一个标准可能是肿瘤来源于通常表达高水平的matriptase或MTSPl的组织。
[0014] 人结肠癌满足该标准。第三标准同能是肿瘤的生长和/或进展依赖于matriptase 或MTSPl对底物（例如，sc-u-PA)的加工。人表皮样癌H印-3满足该标准。另一个标准可 能是肿瘤的生长和/或进展依赖于需要matriptase或MTSPl活性的生物学或病理学过程。 另一个标准可能是特定肿瘤诱导周围组织的matriptase或MTSPl表达。
[0015] 其它标准也可用于选择特定的动物模型。
[0016] -旦选择适当的肿瘤细胞，就可向具有选定的肿瘤细胞的动物施用待测试的化合 物，并随后在对于选择的模型是特异的确定的生长期后测量肿瘤尺寸和/或转移扩散。
[0017] 首先由Ossowski,L.，J.CellBiol.，107:2437-2445(1988)描述的CAM模型（鸡 胚尿囊绒膜模型）提供了用于评价化合物的抗肿瘤和抗血管发生活性的另一种方法。
[0018] 可将不同来源的肿瘤细胞置于10日龄CAM上，并让其静置过夜。随后如由Brooks 等人，MethodsinMolecularBiology, 129:257-269，（1999)所述，静脉内注射待测试的化 合物。在化合物施用后7天测量化合物抑制肿瘤生长或至CAM中的侵入的能力。
[0019] 当用作用于测量化合物抑制血管生成的能力的模型时，将含有血管生成因子诸如 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)或血管内皮细胞生长因子（VEGF)的滤片置于10日龄CAM 上，如由Brooks等人，MethodsinMolecularBiology, 129:257-269, (1999)描述的。在 过夜温育后，随后静脉内施用待测试的化合物。通过在施用化合物后48小时计数血管分枝 的量来测量血管生成的量（MethodsinMolecularBiology, 129:257-269, (1999))。
[0020] 本发明的化合物在体内用于治疗可通过降低的matriptase的丝氨酸蛋白酶活性 改善的病理状态。
[0021] 据信这些化合物在减少或抑制转移以及降解肿瘤和其它赘生物中的细胞外基质 中是有用的。这些化合物可在治疗特征在于细胞外基质的病理性降解的病况、包括在本发 明的背景和引言中的上述疾病中用作治疗剂。
[0022] 本发明包括用于预防或治疗怀疑具有可通过抑制matriptase或MTSPl的丝氨酸 蛋白酶活性来减弱的病况的哺乳动物的病况的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治 疗有效量的选择性抑制matriptase的丝氨酸蛋白酶活性的化合物或本发明的药物组合 物。
[0023] 通常地在哺乳动物中，优选在人中体内施用本发明的化合物。在体内使用它们中， 可以以多种方式，包括口服、胃肠外、静脉内、皮下、肌内、经结肠、经直肠、经鼻或腹膜内，使 用多种剂型向哺乳动物施用化合物。
[0024] 在实施本发明的方法中，将本发明的化合物单独地施用或彼此组合地，或与其它 治疗剂或体内诊断剂组合地施用。
[0025] 如对于医学领域中的技术人员是显而易见的，〃治疗有效量〃的本发明的化合物 可视年龄、体重和待治疗的哺乳动物物种、待治疗的疾病或病理状况的阶段、所使用的具体 化合物、具体施用模式和期望的效果和治疗适应症而变化。因为这些因素和它们与测定该 量的相关系在医学领域是公知的，因此治疗有效剂量水平、实现抑制matriptase或MTSPl 丝氨酸蛋白酶活性的期望的结果所必需的量的测定在这些领域中的技术人员的能力范围 内。
[0026] 通常地，以较低剂量水平开始本发明的化合物的施用，逐渐增升高剂量水平直至 实现抑制matriptase活性至所需程度的期望的效果，这可确定治疗有效量。对于本发明的 化合物，这样的剂量为约0. 〇lmg/kg至约100mg/kg体重，优选为约0. 01至约10mg/kg体重。
[0027] 鉴于上述解释，清楚的是：仍然存在对matriptase的有效抑制剂的持续需要。因 此，本发明背后的技术问题是使得可获得可用于预防或治疗可通过抑制matriptase活性 来预防或治疗的疾病的其它matriptase抑制剂。优选地，此类抑制剂应当克服与现有技 术的matriptase抑制相关的缺点，诸如不期望的副反应、不充足的选择性、高毒性、低稳定 性、低生物利用度和/或不充足的结合亲和力。
[0028] 该技术问题通过提供在权利要求中表征的实施方案来解决。
[0029] 因此，本发明涉及微蛋白或编码所述微蛋白的多核苷酸用于制备药物组合物的用 途，所述药物组合物用于治疗或预防可通过抑制matriptase的活性来治疗或预防的疾病。
[0030] 本发明基于微蛋白能够高效力地结合matriptase的令人惊讶的发现。因此，本发 明的用途是指能够显著抑制matriptase的活性的微蛋白的用途。
[0031] 术语〃微蛋白〃通常是指具有不超过50个氨基酸的相对小的尺寸和基于 分子内的二硫键的确定的结构的多肽。微蛋白通常是高度稳定的并且对热、PH和蛋 白水解降解具有抗性。目前关于微蛋白，特别地关于它们的结构和发生的知识，例如 综述于Craik,Toxicon, 39 (2001) 43-60 ;Pallaghy,ProteinSci. 10 (1994) 1833-9; Reinwarth,Molecules17(2012), 12533-52 中。
[0032] 在优选实施方案中，用于本发明的微蛋白包含至少6个半胱氨酸残基，其中6个半 胱氨酸残基通过二硫键连接以形成胱氨酸结。
[0033] 此类微蛋白也称为抑制剂胱氨酸结（ICK)多肽，并且也如在下列解释中那样称 谓。
[0034] 术语"胱氨酸结"是指由ICK多肽形成的三维结构，其特征在于通过三_二硫键 框架稳定的小的三重P折叠，其包括由两个二硫键和其连接主链区段形成的嵌入环，第 三二硫键穿过该环。优选地，胱氨酸结由六个保守的半胱氨酸残基与所述连接主链区段 形成，其中第一二硫键在第一与第四半胱氨酸残基之间，第二二硫键在第二与第五半胱氨 酸残基之间，第三二硫键在第三与第六半胱氨酸残基之间，第三二硫键穿过由其它两个 二硫键与其连接主链区段形成的环。如果认为合适，则二硫键可被其化学等同物替代， 所述化学等同物同样地确保胱氨酸结的整体拓扑结构的形成。用于测试给定的微蛋白是 否已形成了正确的胱氨酸结，本领域普通技术人员可确定哪些胱氨酸残基彼此相连。这 可以，例如，根据Goransson(J.Biol.Chem. 278 (2003) ,48188-48196)和11〇?1〇.81〇1. Chem. 279(2004)，35867-35878)中描述的技术来进行。具有胱氨酸结的微蛋白例如描述于 Craik(2001);Pallaghy(1994)和Craik(J.Mol.Biol. 294 (1999) ,1327-1336)中。
[0035] 结合本发明使用的微蛋白可具有拥有开放或环状构象的肽主链。开放构象优选 指在N末端上具有氨基并且在C末端上具有羧基的微蛋白。然而，末端的任何