专利名称：喜树碱及其衍生物的自乳化药物前体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种喜树碱及其衍生物的自 乳化药物前体及其应用。
背景技术：
喜树碱(筒称CPT)及其衍生物作用于拓朴异构酶，是一种潜在的抗 癌药物。目前，托泊替康和盐酸伊立替康(7-乙基-10-哌啶子基羰氧基喜 树碱，CPT-ll)已经通过FDA批准，同时一些其它衍生物也进入了临床 前试验和临床试验阶段(Hausheer Frederick H, Haridas Kochat. 11 ，7-Substituted camptothecin derivatives and formulations of 11,7-substituted camptothecin derivatives and methods for uses thereof; US5633260 )。但是, 由于CPT及其衍生物在水中的溶解性差，而且其内酯环在血液中易水解， 临床应用受到纟艮大限制。
药物缓释技术是解决CPT及其衍生物水溶性差、在血液中易水解这 些问题的方法之一。通过将CPT及其衍生物包埋在疏水的脂质双分子层 或高分子微胶嚢中，或将其20-羟基酯化，可以提高其内酯环的稳定性。 申请号为200410022041.7的中国专利中公开了 一种提高喜树碱或其衍生 物的脂质体包封率的方法，申请号为200410024795.6的中国专利中公开了 一种羟基喜树碱脂质体及其制备方法，均表明制备具有高包埋率的喜树 碱或其衍生物的脂质体，能使羟基喜树碱不发生在碱性条件下内酯的开环 反应，从而降低羟基喜树碱的毒性，也能使抗癌活性成分结构稳定。
同时，药物緩释载体还能增加CPT及其衍生物的水溶性，延长其血 液半衰期，并能通过肿瘤组织的EPR效应提高其在肿瘤部位的聚集，最 终导致更高的药物疗效和更低的机体毒性。 一些药物緩释载体已经进入了 临床试验，如聚乙二醇喜树碱治疗局部晚期和转移性胃癌和胃食管交界处 腺癌已进入临床二期(Scott LC， Yao JC, III ABB, W A phase-II study of pegylated-camptothecin (pegamotecan) in the treatment of locally advanced and metastatic gastric and gastro-oesophageal junction adenocarcinoma;CancerChemother Pharmacol 2009;63:363-70 )。
但是，现有的这些CPT及其衍生物药物传输体系的载药能力太低， 在纳米载体或脂质体内，CPT及其衍生物的载药量不超过10。/。，而且载药 体系不稳定，CPT及其衍生物在血液中的释放速度太快，导致非靶向药物 释放，使得它们的药物效率低且生物毒性高。在聚合物-CPT及其衍生物 的键合物中，只有当CPT及其衍生物量很少时才能保证药物的水溶性。 例如，分子量为40千道尔顿(Kda)的PEG能携带CPT的量仅为0.86% (即一个CPT分子)或者1,76% (即两个CPT分子)(Greenwald RB， Choe YH， McGuire J, Conover CD; Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates; Adv Drug Delivery Rev 2003;55(2):217-50 )。为了达到一定的 CPT及其衍生物所需要的剂量，现有的CPT及其衍生物的药物传输体系 需要使用大量的载体，但是，反复使用大剂量的载体给药会使系统毒性大 大增加。因此，亟需一种载药量高且系统毒性小的药物传输体系。
发明内容
本发明提供了一种基于喜树碱及其衍生物的自乳化药物前体，以喜树 碱及其衍生物作为疏水部分来合成自乳化药物前体，即一个或者多个喜树 碱或其衍生物分子共价结合到一个或者多个亲水的基团或者聚合物短链 上，形成含有亲水部分和疏水部分的类脂质体(即与脂质体的结构相似) 或类表面活性剂(即与表面活性剂的结构相似)自乳化药物前体。
一种喜树碱及其衍生物的自乳化药物前体，是由喜树碱分子或喜树碱
衍生物分子与亲水基团共价结合而成的。
所述的自乳化药物前体可以由一个喜树碱分子或喜树碱衍生物分子 通过其20位的羟基与一个或者多个亲水基团共价结合而成；也可以由多 个喜树碱分子或喜树碱衍生物分子通过其20位的羟基与一个或者多个亲 水基团共价结合而成的。
具体地讲，喜树碱或者其衍生物通过其20位的羟基与羧酸或酸酐反 应形成羧酸酯，或与取代磷^应形成磷酸酯，或者与引入水溶性的链段 或聚合物短链段的亲水基团反应，来制备得到喜树碱及其衍生物的自乳化 药物前体。
作为优选，所述的自乳化药物前体可以具有如下结构式其中，R为亲水基团，可选用磷酸基、2-氨基乙基磷酸酯基、2(N,N,N-三甲基乙基磷酸酯基)、磷脂酰丝氨酸基、单糖残基、多糖残基、聚乙二 醇链段、聚(曱基)丙烯酸链段、聚曱基丙烯酸p羟丙酯链段、聚乙烯醇 链段等中的一种；为了使药物前体能形成稳定的自乳化纳米结构， 一般优 选聚合物短链段。上述亲水基团具有良好的生物相容性、无毒或低毒，适 于引入到药物前体中。
Ri为氢、羟基或幾基的衍生物，羟基的衍生物为本领域常用的羟基衍 生物基团，如酯基、醚基等。
喜树碱或者其衍生物通过其20位的羟基与引入水溶性的链段或聚合 物短链段的亲水基团反应时，所述的自乳化药物前体可以具有如下结构 式其中，Ri为氢、羟基或羟基的衍生物；n=3~30。
所述的自乳化药物前体也可以具有如下结构式:
其中，&为氢、羟基或轻基的衍生物。
所述的自乳化药物前体在水中能形成纳米尺寸胶束或者嚢泡，利用本 领域常用的透析等方法即可得到纳米尺寸胶束或者嚢泡。
所述的纳米尺寸胶束或者嚢泡可以作为药物载体，用于负载其它抗癌 药物如CPT衍生物(7-乙基-10-羟基喜树碱，SN-38)、紫杉醇、姜黄素、 甲氨蝶呤、伊立替康、丹酚酸、苦参碱、阿霉素(DOX)等中的一种或多 种，形成携带多种药物的纳米药物。负载药物的方法可以是通过疏水相互 作用，也可以是本领域常用的其他相互作用，如静电作用等。
本发明的自乳化药物前体选用本领域常规的化学合成方法合成即可。
本发明具有如下有益效果
本发明通过在疏水药物中引入亲水基团或在亲水药物中引入疏水基 团制备以药物分子为结构单元的自乳化药物前体，该药物前体具有双亲类 脂质体或类表面活性剂结构，亲水部分和疏水部分之间通过特定条件下可 断裂的化学键连接，从而可在特定条件下释放药物分子。例如，酯键可在 细胞内溶酶体的酸性pH下水解，也可在细胞中被酯分解酶降解。
本发明的自乳化药物前体同时具有两种功能 一、自乳化药物前体自 身可作为一种前体药物， 一旦进入癌细胞，在细胞内酶的作用下导致CPT及其衍生物的快速释放，且载药量高(CPT的负载量一般可超过50%(重 量百分比))、药物输送能力好、血液半衰期较长、生物相容性和生物可降 解性较好、生物利用度高、毒性低，可以明显提高药物的药学作用。二、 该自乳化药物前体能在水溶液中通过自乳化形成纳米尺寸的胶束或者嚢 泡(见图1)，这种纳米尺寸的胶束或者嚢泡可通过肿瘤组织的超通透和蓄 积作用(EPR effect)而有效地在肿瘤组织中积累，而使药物耙向肿瘤组 织。三、该纳米胶束或者嚢泡可以作为其他抗癌药物如CPT衍生物(7-乙基-10-羟基喜树碱，SN-38)、紫杉醇、姜黄素、曱氨蝶呤、伊立替康、 丹酚酸、苦参^ 咸、阿霉素等的载体，从而达到两种或两种以上抗癌药物协 同治疗的目的。
本发明的自乳化药物前体的制备方法操作简单，采用本领域常规的合 成方法即可。
图1为本发明自乳化药物前体形成纳米胶束或嚢泡的示意图2为应用例1中制备的PEG-diCPT嚢泡状纳米颗粒的动态光散射
图3为实施例1制备的自乳化CPT药物前体PEG-diCPT与小分子 CPT对SKOV-3卵巢癌细胞的毒性效果图4为实施例1制备的自乳化CPT药物前体PEG-diCPT与小分子 CPT对MCF-7乳腺癌细胞的毒性效果图5为没有经过治疗的SKOV-3卵巢癌细胞分布图6为经浓度为0.5ng/ml实施例1制备的PEG-diCPT治疗的SKOV-3 卵巢癌细胞凋亡的实验结果；
图7为经浓度为2fig/ml实施例1制备的PEG-diCPT治疗的SKOV-3 卵巢癌细胞凋亡的实验结果；
图8为实施例1制备的PEG-diCPT负载抗癌药物DOX后对MCF乳 腺癌细胞的毒性效果图9为实施例1制备的PEG-diCPT对SKOV-3人卵巢癌细胞荷瘤棵 鼠肿瘤的抑制作用效果图。
具体实施例方式
实施例1 一个PEG连接两个CPT的自乳化药物前体(PEG-diCPT)的合 成
(1) PEG-SH的合成
将4.54g( 10mmol)聚(乙二醇)曱醚丙烯酸酯(PEGMEA)溶解于20mL 干燥的二氯甲烷中，加入1.92g (2mmo1)质量百分浓度为98%的1，2-巯基 乙醇，以O.lmL (0.72mmo1)三乙胺作为催化剂，室温下搅4半反应24h。 反应结束后将反应物用水透析除去小分子和有机溶剂，水相用二氯曱烷洗 涤，有机相用无水硫酸钠干燥后真空干燥，得到4.61g产物PEG-SH,产 率为83.64%。 PEG-SH的结构式如下
其中，n=3~30。 (2 )末端带二酸的PEG的合成
将2.2g ( 4mmo1) PEG-SH和0.52g (4.5mmol)富马酸溶于5mL干燥 的N,N-二曱基曱酰胺(DMF)中，以O.OlmL ( 0.36mmol)三乙胺作为催 化剂，7(TC反应12h后，将反应物透析除去未反应的富马酸、三乙胺和 DMF，经真空干燥得到2.1g末端带二酸的PEG,产率为77%。末端带二 酸的PEG的结构式如下
其中，n=3~30。
(3 )末端带二酰氯的PEG的合成 取1.32g ( 2mmo1)末端带二酸的PEG溶于5mL干燥的二氯甲烷中， 加入0.47g (4mmo1)亚碌u酰二氯和一滴DMF作为催4t剂，室温下反应过 夜，真空除去溶剂和亚辟b酰二氯，得到1.27 g末端带二酰氯的PEG,产率 91%。末端带二酰氯的PEG的结构式如下
9<formula>formula see original document page 10</formula>
其中，n=3~30。 (4) PEG-diCPT的合成
将87mg ( 0.25mmol) CPT悬浮于5mL干燥的氯仿并冷却到0°C 。将 70mg (O.lmmol)末端带二酰氯的PEG和16mg ( 0.2mmol)吡咬溶于2mL 干燥的氯仿中并逐滴加入到含CPT的氯仿溶液中，混合溶液于室温下搅 拌反应24h。将反应物过滤除去未反应的CPT，再用无水乙醚沉淀，经真 空干燥得到产物PEG-diCPT 98mg，产率71%，该类脂质体自乳化药物前 体PEG-diCPT中CPT的携带量为50% (重量百分比)。PEG-diCPT的结 构式如下
其中，n=3~30。
实施例2 基于聚丙烯酸短链的自乳化药物前体的合成
(1 )取1 g (2.87 mmol)CPT和0.34 g(3.44 mmol)丁二酸酐溶于5 mL DMSO中，加热至60°C,反应6小时，反应结束后，将反应溶液倒入50 mL 丙酮中沉淀，通过过滤收集固体产物，干燥后4寻到1.09 g产物I ，产率为 85%。
产物I的结构式如下<formula>formula see original document page 11</formula>
(2)将0.5g ( l.llmmol)上述产物I和0,154 g ( 1.34 mmol) N-羟 基琥珀酰亚胺溶于在DMSO中，加入0.276 g ( 1.34 mmol) N，N' -二环己 基碳二亚胺(DCC )和0.163 g (1.34 mmol)4-二曱氨基必定(DMAP，反应 过夜，过滤除去副产物。滤液在乙醚中沉淀，得到0.56g产物I1，产率为 89%。产物II的结构式如下
<formula>formula see original document page 11</formula>
(3)将0.5g(0.89 mmol)上述产物II和与氨基封端的聚丙烯酸0.5 g(0.89mmol)在DMSO中室温下反应3小时，然后将反应液倒入丙酮中沉 淀，得到0.9g基于聚丙烯酸短链的自乳化药物前体(即产物III ),产率为 90%。产物III的结构式如下<formula>formula see original document page 11</formula>
其中，n=2~20。 上述反应的合成路线如下所示其中，n=2~20。
实施例3葡萄糖CPT自乳化药物前体的合成。
(1) 取lg (5.12mrno1)葡萄酸和3.7g (61.6mmol)乙二胺溶于 10 mL水中，加入0.99 g ( 5.12 mmol) l-乙基-(3-二曱基氨基丙基)-碳二 亚胺(EDC)催化反应12小时，反应结束后，将反应溶液倒入100 mL丙 酮中沉淀，通过过滤收集固体产物，干燥后，得到1.11 g产物IV，产率为 85%。
(2 )将0.3 g ( 1.17 mmol)上述产物IV、 0.66 g ( 1.17 mmol)实施例 2第二步中的产物II与10mlDMSO混合，反应3 h，反应结束后将反应液 倒入丙酮中沉淀，过滤收集固体产物V。
12Ol OH
ohonh 0
产物v
应用例1PEG-diCPT嚢泡状纳米颗粒的制备
将5mg实施例1制备的PEG-diCPT溶解于lmL 二曱基亚砜 (DMSO),并在室温下搅拌lh制成溶液，在搅拌状态下将上述溶液逐 滴加入到5mL pH7.4的PBS緩冲液或水中，透析除去DMSO，得到 PEG-diCPT嚢泡状纳米颗粒。
应用例2PEG-diCPT脂质体载药体系的制备
将0.5mg DOX和2.5mg实施例1制备的PEG-diCPT溶于lmL DMSO
中，并于黑暗条件下搅拌2h制成溶液，再将该溶液逐滴加入到5mL去离 子水中，黑暗条件下搅拌过夜，用去离子水透析除去DMSO和过量的 DOX，即制得PEG-diCPT脂质体载药体系。
以实施例1制备的自乳化药物前体PEG-diCPT为例进行检测，检测 方法均采用本领域的常规方法。
自乳化CPT药物前体PEG-diCPT在水中形成平均尺寸为132 nm的纳 米颗粒，其动态光散射图如图2所示。
将自乳化CPT药物前体PEG-diCPT与小分子CPT进4亍体外抗肺瘤效果的对比实验，其体外抗肿瘤效果分别如图3和图4所示。从图3和图4 中可以看出，PEG-diCPT与CPT具有相同的细胞毒性，PEG-diCPT对 SKOV-3卵巢癌细胞的半致死量为0.1微克/毫升，对MCF-7乳腺癌细胞的 半致死量为0.8微克/毫升，这一结果表明，自乳化CPT前体药物 PEG-diCPT可以用来做为抗癌药物。
考察不同剂量的自乳化CPT前体药物PEG-diCPT引起SKOV-3卵 巢癌细胞凋亡的情况，并采用未经过任何治疗的SKOV-3卵巢癌细胞作为 对照组，实验结果如图5、图6和图7所示。经过72h的治疗，SKOV-3卵 巢癌细胞细胞核的形状发现明显的变化，如图6和图7所示；另外，与未 使用药物治疗的对照组相比(图5),经PEG-diCPT治疗后的SKOV-3卵 巢癌细胞的数量大大减少，表明自乳化CPT前体药物PEG-diCPT能引起 癌细胞的明显凋亡。
负载抗癌药物DOX的自乳化CPT药物前体PEG-diCPT对MCF乳腺 癌细胞的细胞毒性实验结果(如图8所示)表明负载抗癌药物DOX的 自乳化CPT药物前体PEG-diCPT对MCF乳腺癌细胞，具有比单纯的CPT 和DOX更高的细月包毒性。
考察自乳化CPT药物前体PEG-diCPT对SKOV-3人卵巢癌细胞荷瘤 棵鼠肿瘤的抑制作用，BALB/c-nu/nu棵鼠腹腔移植肿瘤细胞4星期后尾 静脉注射O.lmL含PEG-diCPT的磷酸盐緩沖溶液(PBS ),其等同CPT-剂量为lmg/mL溶液，并用尾静脉注射O.lmL磷酸盐緩冲溶液的 BALB/c-nu/nu棵鼠作为对照；48小时后处死棵鼠，分离所有的肿瘤后得 到每只棵鼠的平均肿瘤的总湿重，实验结果如图9所示。
权利要求
1、一种喜树碱及其衍生物的自乳化药物前体，是由喜树碱分子或喜树碱衍生物分子与亲水基团共价结合而成的。
2、 如权利要求1所述的自乳化药物前体，其特征在于所述的自乳 化药物前体是由一个喜树碱分子或喜树碱衍生物分子通过其20位的羟基 与一个或多个亲水基团共价结合而成的。
3、 如权利要求1所述的自乳化药物前体，其特征在于所述的自乳 化药物前体是由多个喜树碱分子或喜树碱衍生物分子通过其20位的羟基 与一个或者多个亲水基团共价结合而成的。
4、 如权利要求1所述的自乳化药物前体，其特征在于具有如下结 构式0— .其中，R为亲水基团；R,为氢、羟基或羟基的衍生物。
5、 如权利要求2所述的自乳化药物前体，其特征在于所述的R为 磷酸基、2-氨基乙基磷酸酯基、2 (N,N,N-三曱基乙基磷酸酯基)、磷脂酰 丝氨酸基、单糖残基、多糖残基、聚乙二醇链段、聚丙烯酸链段、聚曱基 丙烯酸链段、聚曱基丙烯酸p羟丙酯链段或聚乙烯醇链段。
6、 如权利要求1所述的自乳化药物前体，其特征在于具有如下结构式:<formula>formula see original document page 3</formula>其中，&为氢、羟基或羟基的衍生物；n=3~30。
7、如权利要求1所述的自乳化药物前体，其特征在于具有如下结 构式
8.其中，R!为氢、羟基或羟基的衍生物。
9、 一种用如权利要求1 ~ 8任一所述的自乳化药物前体制备的纳米尺 寸胶束或者嚢泡。
10、 如权利要求9所述的纳米尺寸胶束或者嚢泡在作为药物载体中的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种喜树碱及其衍生物的自乳化药物前体，其是由药物分子与亲水基团共价结合而成的；其中，所述的药物分子为喜树碱分子或喜树碱衍生物分子，该前体的携药量可高达50％以上。本发明还公开了该自乳化药物前体的应用，其在水中能形成纳米尺寸胶束或者囊泡，可以作为药物载体，用于负载其它抗癌药物如CPT衍生物、紫杉醇、姜黄素、甲氨蝶呤、伊立替康、丹酚酸、苦参碱、阿霉素等中的一种或多种，形成携带多种药物的纳米药物，实现了药物的协同治疗。
文档编号C07F9/00GK101628919SQ20091010214
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月20日 优先权日2009年8月20日
发明者唐建斌, 徐春红, 申有青, 隋梅花 申请人:浙江大学