/04686中描述的化 学交联来进行。另外的氨基酸序列可以优选通过柔性接头，有利地多肽接头来连接，其中所 述多肽接头可包含具有足以横跨由额外序列形成的三级结构的C端末端与微蛋白的N端末 端（或反之亦然）之间的距离的长度的多个亲水性肽键合的氨基酸。融合蛋白可包含用于 蛋白酶的可切割接头或切割位点（例如，CNBr切割位点或胰血酶切割位点；参见实施例4， 同上）。
[0065] 表达载体已在文献中被广泛描述。一般来说，它们不仅含有选择标记基因和确保 在所选定的宿主中复制的选择起始点，而且还含有细菌或病毒启动子，以及在大多数情况 下含有转录终止信号。启动子与终止信号之间一般存在至少一个使得编码DNA序列能够插 入的限制性位点或多接头。
[0066] 可使用确保基因的组成型表达的启动子和允许基因表达的故意控制的诱导型启 动子。具有这些性质的细菌和病毒启动子在文献中已被详细描述。用于在微生物（例如大肠 杆菌（E.coli)、酿酒酵母）中表达的调控序列在文献中被充分描述。允许下游序列特别高 表达的启动子是例如T7 启动子（Studier等，MethodsinEnzymology185(1990)，60_89)、 lacUV5、trp、trp_lacUV5(DeBoer等，inRodriguezandChamberlin(编 辑），Promoters，StructureandFunction；Praeger,NewYork，（1982)，462-481;DeBoer 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)，21-25)、IpUrac(Boros等，Gene42 (1986) ,97-100) 〇 诱导型启动子优选地用于蛋白质的合成。这些启动子通常导致比组成型启动子更高的蛋白 质产量。为了获得最佳量的蛋白质，通常使用两阶段方法。第一，在最适条件下培养宿主细 胞达到相对高的密度。在第二步骤中，取决于所使用的启动子的类型，诱导转录。在这一点 上，tac启动子是特别适合的，其可由乳糖或IPTG(=异丙基-D-硫代半乳糖P比喃糖苷） 诱导（deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80 (1983) ,21-25)。文献中还描述了用于转录 的终止信号。
[0067] 可按照上述方法之一进行适当的宿主细胞的转化或转染。将宿主细胞培养在满足 所使用的特定宿主细胞的要求（特别地在PH值、温度、盐浓度、通风、抗生素、维生素、微量 元素等方面）的营养培养基中。可通过方法从重组细胞培养物回收和纯化微蛋白，所述方 法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互 途径层析、亲和层析、羟基磷灰古和外源凝集素层析。必要时，在完成构蛋白质的构型中可 使用蛋白质折叠步骤。最后，可使用高效液相色谱（HPLC)进行最终的纯化步骤。
[0068] 取决于重组生产方法中使用的宿主，表达的多肽糖基化可以是糖基化的或可以是 非糖基化的。多肽还可包括初始甲硫氨酸氨基酸残基。
[0069] 为了对受试者施用，可将微蛋白配制为药物组合物。此类药物组合物包含治疗有 效量的微蛋白和任选地，药学上可接受的载体。可对受试者施用药物组合物与生理上可接 受的载体，如本文中所描述的。在具体实施方案中，术语"药学上可接受的"意指被监管机 构或其它公认的药典批准用于动物，更具体地用于人中使用。术语"载体"是指与治疗剂 一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包 括石油、动物、植物或或合成来源的液体，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉 内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作 液体载体，特别地用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、 麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙 烯、乙二醇、水、乙醇等。需要时，组合物还可含有少量湿润或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组 合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂，持续释放制剂等的形式。可用常 规粘合剂和载体诸如甘油三酯将该组合物配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体诸如药物 级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于 "Remington'sPharmaceuticalSciences〃byE.W.Martin(参见上文）中。此类组合物将 含有治疗有效量的上述微蛋白（优选以纯化的形式）与合适量的载体，以提供适合给患者 施用的形式。制剂应当适合施用模式。
[0070] 在另一个优选实施方案中，按照常规方法将组合物配制为适于给人类静脉内施用 的药物组合物。通常，用于静脉施用的组合物是在无菌等渗含水缓冲液中的溶液。必要时， 组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因，以在注射部位缓解疼痛。一般地，单独 地提供成分，或在熔封容器诸如指示活性剂的量的安瓿或小袋中以剂量单位形式（例如作 为干燥冻干粉或无水浓缩物）将成分混合在一起。当组合物通过输液施用时，其可用包含 无菌药物级水或盐水的输液瓶来分配。当组合物通过注射施用时，可提供一安瓿的注射用 无菌水或盐水，以使得可在施用前混合成分。结合本发明使用的药物组合物可被配制为中 性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子诸如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等 的阴离子形成的那些盐，以及与阳离子诸如来源于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化 钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的那些盐。
[0071] 体外测定可任选地用于帮助鉴定最佳剂量范围。待用于制剂的精确剂量也将取决 于施用途径和疾病或病症的严重性，并且应根据医生的判断和每一个患者的情况来决定。 有效剂量可以从体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线外推而来。优选地，直接施用药 物组合物或将其与佐剂组合施用。
[0072] 在本发明的说明书中，术语〃受试者〃意指需要抑制matriptase的活性的个体。 优选地，所述受试者是脊椎动物，甚至更优选为哺乳动物，特别优选是人。
[0073] 术语〃施用的〃意指治疗有效剂量的包含微蛋白的上述药物组合物至个体的施 用。"治疗有效量"意指对于其施用产生疗效的剂量。确切剂量将取决于治疗目的，并且可 由本领域普通技术人员使用已知的技术来确定。如本领域中已知和上文中所述的，关于全 身性对局部递送的判断，年龄、体重是、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用 和病况的严重度可以是必需的，并且可由本领域普通技术人员通过常规实验来确定。所述 方法适用于人治疗和兽医学应用。可将本文中描述的具有期望的治疗活性的化合物在生理 上可接受的载体中给患者施用，如本文中描述的。取决于引入的方式，可以以如下论述的多 种方式配制化合物。制剂中治疗活性化合物的浓度可从约〇.Iwt%变化至IOOwt%。药剂 可以单独施用或与其它治疗组合施用。药物组合物的给药可以以如上论述的多种方式来完 成，包括，但不限于，口服、皮下、静脉内、动脉内、结内、髓内、硬膜内、心室内、鼻内、支气管 内、经皮、结内（intranodally)、直肠内、腹膜内、肌内、肺内、阴道、直肠或眼内施用。在一些 情况下，例如，在伤口和炎症的治疗中，药学上有效的试剂可直接用于溶液干燥喷雾。
[0074] 主治医师和临床因素将决定剂量方案。正如在医学领域中公知的，用于任何一个 患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性 另IJ、给药时间和途径、一般健康状况和待同时施用的其它药物。典型的剂量可以是，例如，在 0. 001至1000iig的范围内；然而，可设想低于或高于该示例性范围的剂量，特别是考虑到 前述因素。
[0075] 优选每周一次提供所述剂量，然而，在治疗进展过程中，剂量可以以更长的时间间 隔更长定来提供，并且事实上可以以短得多的时间间隔提供，例如，每天一次。在优选情况 下，使用本领域技术人员公知的那些方法监测免疫应答并使剂量最佳化，例如，在时间、量 和/或组成方面。进展可通过定期评估来监测。可以局部或全身性施用药物组合物。施用 优选是胃肠外地，例如静脉内注射。用于肠胃施用的制剂包括无菌水溶液或非水性溶液、悬 浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油，和可注射有机酯 诸如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃 媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发油。静脉内 媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂（诸如基于林格氏葡萄糖的那些补充剂）等。 防腐剂和其他添加剂也可以存在，诸如，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
[0076] 在优选实施方案中，将药物组合物配制为用于吸入的气溶胶。
[0077] 在其它优选实施方案中，将药物组合物配制用于口服施用途径。
[0078] 在优选实施方案中，本发明涉及上述用途，其中将微蛋白以表达所述微蛋白的基 因递送载体的形式给患者施用。此外优选的是，用载体体外转化细胞，随后将转化的细胞给 患者施用。
[0079] 根据这些实施方案，结合本发明使用的药物组合物是包含并能表达编码上述微蛋 白的多核苷酸的载体。此种载体可以是表达载体和/或基因递送载体。表达载体在本说明 书中意指用于离体基因治疗技术，即在体外转染合适的宿主细胞，随后将其施用给受试者。 基因递送载体在本文中称为适合用于在体内基因治疗应用的载体，即载体被直接施用（全 身性地或局部地）给受试者。本文中提及的载体可仅由核酸组成或可与附加的化合物复 合，所述化合物增强，例如至靶细胞中的转移、靶向、稳定性和/或生物利用度（例如在循环 系统中）。
[0080] 此类附加化合物的例子是脂质物质、聚阳离子、膜破坏性肽或其它化合物、抗体 或其片段或特异性识别靶细胞的受体结合分子等。表达或基因递送载体可优选来源于病 毒，诸如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒，和可以用于递送进 靶细胞群体，例如递送进呼吸道的细胞。对于本领域普通技术人员是公知的方法可用于 构建重组表达或基因递送载体；参见，例如，Sambrook和Russell,MolecularCloning:A LaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory(2001)N.Y.以及Ausubel,Current ProtocolsinMolecularBiology,GreenPublishingAssociatesandWiley Interscience，N.Y. (1989)中描述的技术。或者，可将载体重建入脂质体以用于递送至革巴细 胞。可通过公知的方法将含有微蛋白编码多核苷酸的载体转移进宿主细胞，这取决于细胞 宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞 宿主（参见Sambrook，同上）。
[0081] 用于离体或体内基因治疗的适当的载体和方法描述于文献中，并且对于本领域 普通技术人员来说是已知的；参见，例如，Giordano,NatureMedicine2(1996),534-539; Schaper,Circ.Res. 79 (1996),911-919 ；Anderson,Science256 (1992),808-813 ； Isner,Lancet348 (1996),370-374 ；Muhlhauser,Circ.Res. 77 (1995), 1077-1086 ； Wang，NatureMedicine2(1996)，714-716;W0 94/29469;W0 97/00957 或 Schaper,CurrentOpinioninBiotechnology7(1996)，635-640,以及本文中引用的参考 文献。用于本发明的该实施方案的载体可被设计用来直接引入细胞或用来通过脂质体或病 毒载体（例如腺病毒、逆转录病毒的）引入细胞。优选基因递送载体包括基于杆状病毒的 载体、基于腺病毒的载体和基于牛痘病毒的载体。这些载体优选是非复制组分。
[0082] 本发明的用途优选地涉及选自炎症、骨关节炎、动脉粥样硬化、血管生成、传染病 和癌症的疾病。
[0083] 归因于它们抑制matriptase的能力，可根据本发明利用本文中上述的微蛋白，以 预防或治疗其中matriptase是病理介导剂（pathology-mediatingagent)的疾病或病况。
[0084] 在其它方面，本发明涉及用于治疗需要抑制matriptase的活性的个体的方法，所 述方法包括向所述受试者施用有效量的包含如上定义的微蛋白或编码所述微蛋白的多核 苷酸和任选地药学上可接受的载体的药物组合物。
[0085] 关于本实施方案，同样地应用上述解释，特别地关于药物组合物的配制、施用模式 和疾病的解释。
[0086] 根据上述内容，本发明