C0113基本上衍生自中间载体pGSVl。载体pGSVl自身衍生自 PGSC1700 (Cornelissen 和 Vandewielle, 1989)，但包含由 pTiB6S3 的 TL-DNA 之左和右边 界序列组成的人工T-区、和允许在T-DNA边界重复序列之间插入嵌合基因的多接头克隆位 点。pGSVl载体在质粒的主框架上提供芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因并提供用于在大肠杆菌 (E. coli)中表达的调节信号。
[0088] 表1对包含在pTC0113边界重复序列之间的DNA进行了充分描述（SEQ ID No. 10):
[0089]表1.包含在pTCOl 13的T-DNA边界重复之间的DNA的核苷酸位置
[0090]
[0092] 如TO 01/31042中所述分离侧翼序列。
[0093] 右（5'）侧翼区
[0094] 5'侧翼区作为约415bp的片段扩增，其全序列已测定（SEQ ID No. 1)。在核苷酸 1和234之间的序列对应于植物DNA，而核苷酸235和415之间的序列对应于T-DNA。
[0095]左（3'）侧翼区
[0096] 3'侧翼区作为约416bp的片段扩增，其全序列已测定（SEQ ID No. 2)。在核苷酸 1和193之间的序列对应于T-DNA，而核苷酸194和416之间的序列对应于植物DNA。
[0097] PCR鉴定MS-B2
[0098] 如WO01/31042中所述，包含生物材料的MS-B2可使用其中描述的PCR鉴定程序 鉴定。
[0099] 可以使用下列特异识别MS-B2的外源DNA和侧翼序列的引物：
[0100] BOl: 5' -gAA. ATC. CAT. gTA. AAg. CAg. CAg. gg-3'（SEQ ID No. 3)(靶向：植物 DNA)
[0101] B02:5' -gCT. Tgg. ACT. ATA. ATA. CTT. gAC-3'（SEQ ID No. 4)(靶向：T-DNA)
[0102] PCR反应中预期的扩增片段为：
[0103]对引物对 B01-B02 :183bp(MS-B2 原种事件）
[0104] 1. 2?原种事件 RF-BNl
[0105] 原种事件RF-BNl通过对欧洲油菜植物进行农杆菌介导的转化产生，其中使用嵌 合DNA，其包含在TA29启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶抑制剂（PTHW118)。
[0106] 质粒pTHff 118也基本上衍生自中间载体pGSVl (描述见上）。表2对包含在pTHff 118 的边界重复序列之间的DNA进行了充分描述（SEQ ID No. 9):
[0107]表 2:质粒 pTHff 118 的 T-DNA
[0108]
[0109] 如WO 01/41558中所述分离侧翼序列。
[0110] 右（5'）侧翼区
[0111] 5'侧翼区作为约1077bp的片段扩增，其全序列已测定（SEQID No.5)。在核苷酸 1和881之间的序列对应于植物DNA。，而核苷酸882和1077之间的序列对应于T-DNA。
[0112] 左（3，）侧翼区
[0113] 3'侧翼区作为约1500bp的片段扩增，其全序列已测定（SEQIDNo.6)。在核苷酸 1和166之间的序列对应于T-DNA，而核苷酸167和1441之间的序列对应于植物DNA。
[0114] PCR鉴定RF-BNl
[0115] 如WO 01/41558中所述，包含生物材料的RF-BNl可使用其中描述的PCR鉴定程序 鉴定。
[0116] 为鉴定包含RF-BNl的植物材料，使用特异识别RF-BNl的转基因和侧翼序列的下 列引物：
[0117] BNA03:5' -TCA.TCT.ACg.gCA.ATg.TAC.CAg-3'（SEQID7)(靶向：转基因）
[0118] BNA04:5' -Tgg. ACC. CCT. Agg. TAA. ATg. CC-3'（SEQ ID 8)(靶向：植物 DNA)
[0119] PCR反应中预期的扩增片段为：
[0120] 对引物对 BNA03-BNA04 :215bp (RF-BN1 原种事件）
[0121] 实施例2.鉴定RF-BNl基因座所在的基因组以及引入芥菜
[0122] 为确定RF-BNl基因座是位于欧洲油菜的A基因组还是C基因组，在4种不同 的欧洲油菜BCl分离群中分析RF-BNl与该芸苔属植物基因组上已知标记的共遗传性 (co-heritage)或连锁，所述分离群源自以纯合状态包含RF-BNl转基因的供体系和不含转 基因的轮回亲本（recurrent parent)之间的杂交。使用AFLP方法产生遗传标记。适应性 修改应用 Vos 等（1995, NAR 23:4407-4414, EP0534858 和 US 6,045,994)中的 AFLP 分析。 为鉴定与 RF-BNl 连锁的 AFLP 标记，根据 Michelmore 等（1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9828-9823)，进行分离群体分组分析（bulked segregant analysis，BSA) 〇
[0123] 在BCl群的至少46份个体样品上分析在RF-BNl阳性植物（包含可见AFLP标 记）和RF-BNl阴性植物（其中该同一标记不可见）集合之间显示差异扩增的所有AFLP 遗传标记，其中AFLP标记在BSA分析中已显示潜在连锁。只保留显示与RF-BN1PCR标记 显著共分离的标记，不满足这一标准的其他潜在标记作为来自BSA分析的假阳性排除。对 于每一个BCl群，分别使用在个体植物上产生的所保留的AFLP标记和RF-BN1PCR标记的 数据，进行连锁分析，其中使用JoinMap 3. 0版（Van Ooijen和Vorrips (2001) JoinMap 3.0 片反，Software for the calculation of genetic linkage maps, Plant Research International, Wageningen, The Netherlands)。由于 4 份单独图谱围绕 RF-BN1 基因座显 示相当的一致性，这4份BCl图谱可以使用同一软件整合为一份BCl图谱，代表RF-BNl周 围的区域，从而允许进行RF-BNl基因座的局部作图。
[0124] 随后，将所得的RF-BNl区的局部图谱与代表所有欧洲油菜染色体的遗传参考图 谱相比较。对于此参考图谱，已根据Sharpe等（1995, Genome 38:112-1121)和Parkin等 (1995, Genome 38:1122-1131)指定染色体号。NOl至NlO为A-基因组染色体，而Nll至 N19为C-基因组染色体。RF-BNl区图谱和来自参考图谱的N07染色体之间存在非常清楚 的相关性，后者已知为A-基因组染色体。RF-BNl位于欧洲油菜的A-基因组上。
[0125] 通过从包含事件RF-BNl的Drakkar品种植物重复回交，将事件RF-BNl引入芥菜 栽培品种。在至少4个世代的加速回交之后，检验芥菜植物，并确立：
[0126] a)外源DNA的存在并不降低其它所期望有的植物特性，例如那些与农学特性或商 业价值相关的特性；
[0127] b)事件的特征在于稳定遗传的、充分确定的分子构型；
[0128] c)在事件的杂合（或半合子）和纯合的情况下，外源DNA中的目的基因均在一系 列的环境条件下以商业可接受水平显示出了正确、合适且稳定的空间和时间表型表达，其 中所述环境条件是携带该事件的植物在正常农业应用中可能遇到的环境条件。此外，与野 生型芥菜物种相比，评估了这些植物的农学特性和性能。
[0129] 田间的大量测试证明，芥菜中的RF-BNl导致，该植物显示了外源DNA中目的基因 的足够表达，即雄性不育表型，以及最佳农艺学性能。因此，尽管最初在欧洲油菜中开发，但 令人意外的是，RF-BNl也是芥菜中的原种事件。因此，RF-BNl可有效用于在包含MS-B2的 芥菜中恢复育性。
[0130] 实施例3. MS-B2/RF-BN1植物的农艺学性能
[0131] 田间检测包含MS-B2/RF-BN1事件的芸苔属油籽油菜植物、以及等基因非转基因 对照植株（checks)以及包含其他育性恢复事件的MS-B2植物。相关产量数据总结在下表 中。
[0132] 需注意，在分析中包括了其他植物系的田间试验数据，用于计算均值、显著性等。
[0133] 清楚地，包含MS-B2和RF-BNl的植物系产量始终高于包含MS-B2和其他雄性恢复 事件例如RF-BN2的植物系。
[0134] 同时清楚地，包含MS-B2的植物系产量高于等基因非转基因植物系。
[0135] 表3.地理位置1处的田间试验
[0136]
[0137] 表4.地理位置2处的田间试验
[0138]
[0143] 实施例4. MS-B2/RF-BN1欧洲油菜植物与MS-BN1/RF-BN1欧洲油菜植物的农艺学 性能比较
[0144] 在5个地点（4个重复/所有样地）进行田间试验，以与相同遗传背景的MS-BNl/ RF-BNl杂种相比，确认MS-B2/RF-BN1欧洲油菜杂种的育性恢复，并评估除草剂耐受和农艺 学性能。
[0145] 在没有草铵膦喷雾（A)或以草铵膦(Liberty?