用于质地紧密坚硬植物材料的石蜡切片制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物样本组织石蜡切片技术领域，尤其是一种用于质地紧密坚硬的稻麦等植物材料，如小麦发育后期籽粒的石蜡切片制作方法。
【背景技术】
[0002]石蜡切片技术是从事发育生物学和组织化学研究的基础试验技术方法，也是显微观察植物组织结构常用技术。植物学研究领域该技术在研究植物形态建成、植物杂交育种、珍稀植物的培育和鉴别等方面有着广泛应用。此外，对于动、植物样本进行组织化学染色、开展免疫组化研究及进行原位杂交等研究，都离不开对动、植物样本组织进行石蜡切片的制作，并且石蜡切片制作的优良程度关系到相关研究试验结果的准确程度。因此，石蜡切片技术是在生命科学领域进行动、植物发育生物学和组织化学研究的基础试验技术。
[0003]小麦籽粒发育从开花受精开始大体经历籽粒灌浆初期、乳熟期、腊熟期、黄熟期和完熟期。随着籽粒灌浆进程延续，小麦籽粒形态上由小变大，随着籽粒中淀粉和蛋白逐渐积累，小麦籽粒由灌浆初期的液态胚乳逐渐发育成质地紧密坚硬固态胚乳。对于稻麦等籽粒石蜡切片的制作方法，经文献检索(康海歧等，2010)已查询到的方法大多是按照以往常规植物石蜡切片制作通用方法，并且已报道相关研究使用的石蜡切片方法只能切出灌浆早期籽粒石蜡切片。由于小麦籽粒灌浆初期，籽粒质地相对松软较容易切出完整石蜡切片，而小麦籽粒发育后期籽粒质地紧密坚硬，切片时易碎较难切出完整籽粒石蜡切片。小麦发育后期籽粒切片困难的主要原因有两个方面:一方面从籽粒材料而言，由于小麦籽粒发育中后期淀粉和蛋白质的大量积累以及籽粒含水量降低，造成籽粒材料变硬，胚乳组织质地变得致密。另一方面就切片方法而论，常规石蜡切片方法概括为酒精脱水，二甲苯透明，然后逐级浸蜡的方法。由于二甲苯会使组织材料收缩变硬，因而造成本就致密的籽粒材料浸蜡会更加困难，并且常规石蜡切片方法浸蜡时间过短，这就造成石蜡未完全浸入籽粒组织细胞内部，因此在做籽粒切片时材料非常易碎，很难切出完整籽粒的石蜡切片。在水稻籽粒石蜡切片制作上于晓刚等(2010)尝试对籽粒材料进行软化处理，S卩1/2甘油+ 1/2无水乙醇混合代替二甲苯，透明时间为一周，结果籽粒能够变得透明，但还是不易切片，其方法无法切出授粉后12d以上的完整籽粒石蜡切片。康海歧等使用0.5%?15%的氢氟酸溶液软化籽粒，时间从30min到30 d，但材料仍不易切片;若将稻米煮沸使之软化，胚乳淀粉将变成糊化状，这种方法也只能切至授粉后第Ild的籽粒。
[0004]因此，小麦发育后期籽粒切片易碎、研究人员不容易切出小麦发育后期籽粒的完整石蜡切片是一个急待解决的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种可操作性强、方法简便、经济实用，能够解决发育后期籽粒切片易碎问题，容易切出发育后期籽粒的完整石蜡切片的用于质地紧密坚硬植物材料的石蜡切片制作方法。
[0006]本发明公开了一种用于质地紧密坚硬植物材料的石蜡切片制作方法，其特征在于包括以下步骤:
(一)、固定:
取授粉后不同时期的植物籽粒材料进行纵切或横切，放入容器中的固定液中，使用真空干燥器抽真空，至所有籽粒材料都沉入容器底部，室温固定3?5h;
本步骤注意事项:
(I)、由于制作切片后期使用的透明剂是可以腐蚀塑料的氯仿，因而从材料固定开始应使用玻璃瓶，而不宜用塑料离心管。
[0007](2)、应根据后续实验具体要求来选用适合的固定液，若制作用于原位杂交的石蜡切片，需使用(4%多聚甲醛+ 0.1%(v/v)DEPC)作为固定液成分。另外，根据实验需要选用合适的固定液，比如制作用于原位杂交的石錯切片，需使用4%多聚甲醛固定，并加入0.1%( V:V)的DEPC;如需染色观察植物组织细胞，并需长期保存植物组织，可以使用FAA固定液;如需进行DAPI染色(DAPI是一种荧光染料，可以特异性地对DNA进行染色，在荧光下可以观察组织内的细胞核)，可使用卡诺固定液。
[0008](3)、籽粒必须进行纵切或横切，否则固定液难以进入，会造成籽粒外部过度固定而内部还未固定，同时也影响之后的脱水透明等步骤。
[0009](二)、脱水:
利用移液枪将上述固定液吸出，先后依次加入梯度为30%、50%、75%、95%和100%浓度的酒精进行脱水:30%酒精脱水3?5次，每隔20?30min更换一次酒精;50%酒精脱水3?5次，每隔20?30min更换一次酒精;之后将样品转移至摇床上或者每隔8?12min晃一下容器，75%酒精脱水3?5次，每隔40?50min更换一次酒精;95%酒精脱水3?5次，每隔40?50min更换一次酒精；100%纯酒精脱水3?5次，每隔40?50min更换一次酒精；
本步骤注意事项:
(1)、换75%酒精后可以发现灌浆初期籽粒果种皮中的叶绿素逐渐被酒精萃取出来，靠近瓶底的酒精变绿，因此使用摇床摇晃，以保持酒精均匀，使籽粒脱水过程顺利进行。
[0010](2)、此步也可以不使用摇床，但需要每隔1min左右晃一下容器即可。至最后数次更换酒精时已没有叶绿素被萃取出来，表明籽粒脱水完全。
[0011]常规方法每步脱水时间一般为I?2h，该步骤与常规方法相比延长了脱水时间，同时使用摇床使脱水过程更加顺畅，并且容易判断籽粒脱水是否完成。
[0012](三)、透明:
利用吸液枪将上述酒精吸出后，使用氯仿做透明剂，加入体积比为酒精:氯仿=3:1溶液静置3?4h，抽真空至所有材料沉底;之后利用吸液枪将溶液吸出，加入体积比为酒精:氯仿=1:1溶液，静置3?4h，抽真空至所有材料沉底;再次利用吸液枪将溶液吸出，加入体积比为酒精:氯仿=1: 3溶液，静置3?4h，抽真空至所有材料沉底;再次利用吸液枪将溶液吸出，加入纯氯仿静置2?3d，抽真空至所有材料沉底；
本步骤注意事项:
(I)、氯仿不会使材料收缩变硬，因此改用氯仿作透明剂。但氯仿渗透速度较慢，由于小麦籽粒灌浆后期材料自身较硬、含水量较低，因此本步透明时间远比常规方法时间要长。
[0013](2)、由于氯仿密度较大，每次提高氯仿比例时，材料都会漂浮至液面，所以每次都需要抽真空以促进透明剂进入材料组织内部。
[0014](3)、透明步骤结束时，可以发现灌浆后期(如授粉后35d)的材料对着光源也可以透光，表明籽粒该步骤透明良好。
[0015]该步骤改用氯仿做透明剂，且大幅延长了透明时间，可以做到不使材料收缩变硬且透明完全。
[0016](四)、浸蜡:
利用吸液枪将所述上述纯氯仿吸出后，加入体积比为氯仿:石蜡=3: I的混合液，在40?42 °C下保温4?5h;之后，利用吸液枪将上述氯仿与石蜡混合液吸出后，加入体积比为氯仿:石蜡=1: I，在40?42 0C下保温4?5h;之后，利用吸液枪将上述氯仿与石蜡混合液吸出后，加入体积比为氯仿:石蜡=1: 3的混合液，在45?47°C下保温4?5h;针对授粉后21d之前的材料，利用纯石蜡在55?57°C下保温3?4d;针对授粉后21d以后的材料，利用纯石蜡在55?57°C保温3?5d，浸蜡期间更换一次纯石蜡；
本步骤注意事项:
(I)、小麦籽粒本身淀粉和蛋白含量较高，尤其到籽粒发育后期更是如此，导致浸蜡十分困难。因此必须延长浸蜡时间，而且浸蜡时必须保持合适的温度，温度过高不仅破坏籽粒内部的结构，而且高于60°C时不利于保存组织内部的生物活性物质，影响免疫组化的结果，也会使组织变硬、变脆，还会导致籽粒整体松散、解体，因此，保持55°C浸蜡，使石蜡处于半融化状态即可。
[0017]( 2)、浸蜡完全后，可以发现材料变成微绿或白色半透明的玉石状。
[0018]该步骤保持相对较低的浸蜡温度，但大幅延长浸蜡时间，能够使籽粒组织细胞内完全浸蜡，同时可以保证材料完整且不破坏内部结构，还能保存组织内部的生物活性物质。
[0019]如图2所示，是本发明方法与传统方法浸蜡后的小麦籽粒横切面对比图，图中A、B分别表示为小麦花后21d和28d的籽粒使用本方法浸蜡后的效果，C、D分别为小麦花后21d和28d的籽粒使用传统方法浸蜡后的效果。如图2所示，使用本方法浸蜡后的小麦籽粒浸蜡完全，呈半透明状，切片时不会有淀粉掉落，而使用传统方法浸蜡后小麦籽粒浸蜡不充分，切片时会有淀粉掉落。
[0020](五)、包埋与切片:
所使用的籽粒材料用纸盒或石蜡包埋盒按常规方法包埋，针对授粉后21d之前的材料可以直接按常规方法在石蜡切片机上切片，授粉后21d以后的材料石蜡包埋后须使用刀片切出材料横截面，然后将蜡块倒扣于DEPC水中4?6 °C软化过夜，然后再进行切片，上述所有籽粒材料均可以切成厚度范围8?25μπι的切片。
[0021]本步骤对于籽粒发育后期材料增加了DEPC水软化步骤，使籽粒发育后期已经基本成熟的籽粒也能切出完整切片。
[0022]经此方法制成的石蜡切片经烤片、脱蜡和复水后，可以根据后续研究实验目的，进入接下来的实验操作。
[0023]如图3所示，是利用本发明方法与传统方法切出的小麦籽粒石蜡切片的对比图片，图中所示:A、B、C分别为小麦花后21、28、35d的籽粒使用本方法切出的石蜡切片，D、E、F分别为小麦花后21、28、35d的籽粒使用传统方法切出的石蜡切片。