一种海蜇足囊石蜡切片前期处理方法
【技术领域】
[0001]本发明属于腔肠动物组织切片制备技术领域，具体的涉及一种海蜇足囊石蜡切片前期处理方法。
【背景技术】
[0002]海蜇是我国沿海特有的大型可食用水母，也是我国水产养殖业中重要的养殖品种之一，其生殖生物学研究一直受到相关科研人员的重视。足囊是海蜇无性繁殖关键生活史阶段，可抵御低氧、饵料匮乏等恶劣环境，并能防止敌害生物捕食及有害微生物侵染，对保持海蜇自然资源和实现人工繁育具有重要意义。
[0003]石蜡切片技术广泛应用于组织形态的观察，在海蜇足囊研究方面具有重要意义。海蜇足囊紧紧附着在附着基表面(人工繁育附着基为聚乙烯波纹板)，在制作海蜇足囊石蜡切片的实验研究过程中，若直接用镊子、解剖针等取样，会直接破坏足囊组织结构，导致切片制作成功率在5%以下；足囊周围包裹一层几丁质外膜，通透性差，不能直接用固定液固定;足囊体积极小(直径200-500μπι，厚度20-50μπι)，采用传统蜡块制备方法，足囊分散于蜡块中，在海蜇足囊组织切片时，难以对足囊位置进行固定。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对海蜇足囊石蜡切片固定过程中存在的技术问题，提供一种适用于海蜇足囊组织结构特点的固定方法。
[0005]本发明要解决的技术问题是克服海蜇足囊难以与附着基剥离、不易固定、体积小操作不方便的缺陷，提供一种海蜇足囊石蜡切片的前期处理方法，既能实现足囊的完整固定，又能对足囊位置进行定位。
[0006]为了达到上述目的，本发明是通过采用如下技术方案实现的:
一种海蜇足囊石蜡切片的前期处理方法，包括如下步骤:
1、取样处理:用海水冲洗带有海蜇足囊的聚乙烯波纹板，选择足囊较多的部位，将带有足囊的波纹板剪成长、宽为l_3cm的小片。
[0007]2、第一次固定:将上述步骤I中带有足囊的波纹板放置于50ml的离心管中，加入Bouin氏固定液固定30_60min。
[0008]3、足囊穿刺:将上述步骤2固定后的足囊用磷酸缓冲液轻轻清洗3-5次，放置于体视镜下，用细针从足囊侧面，斜向下将一侧几丁质外膜刺穿。
[OOO9 ] 4、第二次固定:将上述步骤3处理的足囊再次放入Bouin氏固定液中固定I _2h。
[0010]5、足囊收集:将上述步骤4处理的足囊用磷酸缓冲液清洗2-3次后，放置于体视镜下，用解剖针将波纹板上的足囊小心的铲下，收集。
[0011]6、超声清洗:将上述步骤5收集的足囊置于超声管中，清洗l-3min，之后用磷酸缓冲液清洗3-5次。
[0012]7、琼脂凝集:将上述步骤6清洗的足囊收集到1.5ml离心管中，弃去上清，加入50-150μ1冷却至35-40°C的1.5%低熔点琼脂，混匀静置5-1011^11，冷凝后去除多余琼脂。
[0013]8、第三次固定:将包含有足囊的琼脂块转入Bouin氏固定液中固定10_20h，后续操作与常规石蜡切片相同。
[0014]本发明的有益效果:本发明首次提供了一种海蜇足囊石蜡切片前期处理方法，通过样品处理、足囊穿刺、多次固定、超声清洗及琼脂凝集等步骤，在保证组织形态完整的前提下，使足囊彻底固定，该方法实用性强，操作简单，足囊固定效果好，更利于海蜇足囊的石蜡切片制作等后续研究的开展。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但是这些实例并不限制本发明的范围。此外相关领域的普通技术人员对本发明做的任何改动，只要不脱离本发明的实质，都将等价落在本发明权利要求书所限定的范围内。
[0016]实施例1
1、取样处理:用海水冲洗带有海蜇足囊的聚乙烯波纹板，选择足囊较多的部位，将带有足囊的波纹板剪成长、宽为1.5cm的小片。
[0017]2、第一次固定:将上述步骤I中带有足囊的波纹板放置于50ml的离心管中，加入Bouin氏固定液固定60min。
[0018]3、足囊穿刺:将上述步骤2固定后的足囊用磷酸缓冲液轻轻清洗5次，放置于体视镜下，用细针从足囊侧面，斜向下将一侧几丁质外膜刺穿。
[0019]4、第二次固定:将上述步骤3处理的足囊再次放入Bouin氏固定液中固定lh。
[0020]5、足囊收集:将上述步骤4处理的足囊用磷酸缓冲液清洗2次后，放置于体视镜下，用解剖针将波纹板上的足囊小心的铲下，收集。
[0021]6、超声清洗:将上述步骤5收集的足囊置于超声管中，清洗3min，之后用磷酸缓冲液清洗5次。
[0022]7、琼脂凝集:将上述步骤6清洗的足囊收集到1.5ml离心管中，弃去上清，加入100μI冷却至35-40°C的1.5%低熔点琼脂，混匀静置8min，冷凝后去除多余琼脂。
[0023]8、第三次固定:将包含有足囊的琼脂块转入Bou in氏固定液中固定1h。
[0024]实施例2
1、取样处理:用海水冲洗带有海蜇足囊的聚乙烯波纹板，选择足囊较多的部位，将带有足囊的波纹板剪成长、宽为I Cm的小片。
[0025]2、第一次固定:将上述步骤I中带有足囊的波纹板放置于50ml的离心管中，加入Bouin氏固定液固定30min。
[0026]3、足囊穿刺:将上述步骤2固定后的足囊用磷酸缓冲液轻轻清洗3次，放置于体视镜下，用细针从足囊侧面，斜向下将一侧几丁质外膜刺穿。
[0027 ] 4、第二次固定:将上述步骤3处理的足囊再次放入Bouin氏固定液中固定2h。
[0028]5、足囊收集:将上述步骤4处理的足囊用磷酸缓冲液清洗3次后，放置于体视镜下，用解剖针将波纹板上的足囊小心的铲下，收集。
[0029]6、超声清洗:将上述步骤5收集的足囊置于超声管中，清洗lmin，之后用磷酸缓冲液清洗3次。
[0030]7、琼脂凝集:将上述步骤6清洗的足囊收集到1.5ml离心管中，弃去上清，加入150μI冷却至35-40°C的1.5%低熔点琼脂，混匀静置1min，冷凝后去除多余琼脂。
[0031 ] 8、第三次固定:将包含有足囊的琼脂块转入Bouin氏固定液中固定20h。
【主权项】
1.一种海蜇足囊石蜡切片前期处理方法，其特征在于，包括如下步骤: a、取样处理:将带有足囊的波纹板清洗后，剪成长、宽为l-3cm的小片； b、第一次固定:带有足囊的波纹板小片经Bouin氏固定液固定30min-60min; c、足囊穿刺:固定后的足囊用磷酸缓冲液清洗3-5次，用细针从足囊侧面，斜向下将一侧几丁质外膜刺穿； d、第二次固定:将上述步骤处理的足囊由Bouin氏固定液固定l_2h； e、足囊收集:将上述步骤处理的足囊用磷酸缓冲液清洗2-3次后，用解剖针将波纹板上的足囊小心的铲下，收集； f、超声清洗:将上述步骤收集的足囊置于超声管中，清洗l_3min，之后用磷酸缓冲液清洗3-5次； g、琼脂凝集:将上述步骤清洗的足囊收集到1.5ml离心管中，弃去上清，加入50-150μ1冷却至35-40°C的1.5%低熔点琼脂，混匀静置5-1011^11，冷凝后去除多余琼脂； h、第三次固定:将包含有足囊的琼脂块转入Bouin氏固定液中固定10-20h，后续操作与常规石蜡切片相同。
【专利摘要】一种海蜇足囊石蜡切片前期处理方法，本发明属于腔肠动物组织切片制备技术领域，它的步骤包括取样处理、第一次固定、足囊穿刺、第二次固定、足囊收集、超声清洗、琼脂凝集及第三次固定。本发明在保证组织形态完整的前提下，使海蜇足囊彻底固定，该方法实用性强，操作简单，足囊固定效果好，更利于海蜇足囊的石蜡切片制作等后续研究的开展。
【IPC分类】G01N1/36, G01N1/30
【公开号】CN105510106
【申请号】CN201510905745
【发明人】孙云, 刘春胜, 陈四清, 顾志峰, 王爱民, 陈昭廷
【申请人】海南大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月10日