一种高分子材料冷冻超薄切片移取液及切片制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种高分子材料冷冻超薄切片移取液，由体积比为6︰1～1︰8的水和有机醇类化合物组成。组成成分简单，配制方法简单易行，使用后无需清洗切片，并可以根据切片材料的冷冻温度简易地调节配比，从而达到最优的移取效果。本发明还提供了一种利用上述移取液来移取切片的高分子材料冷冻超薄切片的制备方法。操作步骤简单，适用于使用玻璃刀或钻石刀的情况，并且对刀刃无损坏，切片移取后的切片无需进行冲洗，可直接进行染色，从而减少了操作步骤。本发明为透射电子显微镜测试提供了高效简易的高分子材料冷冻超薄切片的制备方法。
【专利说明】一种高分子材料冷冻超薄切片移取液及切片制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高分子材料冷冻超薄切片移取液以及使用该移取液的高分子材料冷冻超薄切片制备方法。
【背景技术】
[0002]透射电子显微镜(Transmiss1n Electron Microscope)是研究高分子材料微观结构的重要仪器之一。但是，能够在透射电子显微镜上观察到材料的微观结构的前提是电镜的电子束能够穿透材料样品，并且观察到的图像的质量强烈依赖于样品的厚度。因此，电镜样品必须非常薄，一般厚度需控制在1-1OOnm之间。
[0003]超薄切片是透射电子显微镜高分子样品制备方法中最基本、最重要的制样技术。但是，对于聚烯烃、橡胶等玻璃化温度较低的高分子材料，由于样品较软或具有较大的弹性，常温超薄切片不能得到平整均匀、厚度适合的切片，因而需要进行冷冻超薄切片才能得到理想的样品，从而获得分辨率较高的图像数据。
[0004]冷冻超薄切片制样技术主要是从生物电镜样品制备技术发展起来的，它用快速冷冻取代了常规制样中的化学处理步骤，所制备的样品比采用包埋等方法的结果更加真实可靠。冷冻超薄切片的步骤主要包括:(I)样品粗修；(2)选择温度，冷冻；(3)超薄切片；
[4]样品切片的移取。以往的文献报道中，冷冻超薄切片主要有两种方法:湿刀法和干刀法。湿刀法与常温超薄切片相似，用低温下不冻结的二甲基亚砜溶液作为槽体，切片在溶液上漂浮后展开，用预冷过的有膜铜网移取样品；该方法的缺点是二甲基亚砜溶液具有一定的毒性，而且该方法在极低温度时不适用，现已逐渐被干刀法所替代。目前，高分子材料冷冻超薄切片一般都采用干刀法。干刀法是直接用玻璃刀或钻石刀切片；此法不受槽液冻结温度控制，但是切片不易成带，不易展开，常常粘附在刀刃上，样品的移取困难。
[0005]由于冷冻超薄切片不易得到大块完整的切片，因此要小心收集碎片以便进行观察，所以样品切片的移取非常重要，直接关系到透射电子显微镜能否得到优质的图像。干刀法中，通常是用预冷的睫毛针把切片拨到紧靠刀刃的预冷铜网上，或是直接用铜网平行于玻璃刀沿一个方向刮取切片。然而，这两种方法都极易使刀刃碰撞受损，不适用于使用钻石刀的情况。即使使用玻璃刀，每移取一次样品切片，就需更换一把玻璃刀，而且还不能保证样品移取的稳定性，极易使切片产生皱折。
[0006]20世纪80年代Tokuyasu对于生物冷冻超薄切片样品制备中的干刀法进行了一些完善，在移取切片时，用怕金环廳取庶糖的憐Ife盐溶液，在溶液未完全冻结时粘取切片，从而完成切片的移取工作。此法在生物样品的冷冻切片中广为运用。但是，样品在染色前需用无离子水反复冲洗切片，以除去残留的移取液，并且在冲洗过程中易将已切好的超薄切片样品流失。
[0007]对于高分子材料样品来说，由于材料主要是由碳、氢、氧等轻元素所组成，这些元素的原子序数较低，散射电子的能力较弱，因此一般在进行电镜观察前，需采用铅、锇、钨等重金属盐类对超薄切片进行染色，以增强样品中不同结构部分的反差，从而增强图像的清晰度。然而，当使用蔗糖的磷酸盐作为移取液时，需要在染色前将切片上的移取液进行冲洗，并且在电镜观察时，少许残余的移取液在电子束轰击下容易碳化，导致样品分辨率下降或者无法区分不同的结构形态。此外，染色剂如锇酸等可与糖类中的醛基发生氧化还原作用，使样品的衬度降低，图像的清晰度降低。
[0008]总的来说，上述方法对于高分子样品冷冻超薄切片中切片的移取都有一定的缺陷，例如受温度和制样工具的限制、步骤繁杂、引入了新的化学试剂或引入毒性、降低图像的分辨率和清晰度等等。
【发明内容】
[0009]针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种组成简单、成分无毒并易于配制的高分子材料冷冻超薄切片移取液，还提供了使用该移取液的高分子材料冷冻超薄切片的高效制备方法。
[0010]具体地，根据本发明，提供了一种高分子材料冷冻超薄切片移取液，由体积比为6:1?1: 8，并优选为4:1?1: 6的水和有机醇类化合物组成。水和醇的互溶性好，并且可以通过调整组分和配比来获得不同切片温度下所需的适宜的粘度。若水占的比例太大则粘性不足，若醇的比例太大则容易使移取液粘在刀上，这两种情况都无法移取到切片样品。本发明提供的如上所述的移取液，能够较好地实现高分子材料冷冻超薄切片的移取。
[0011]该移取液主要应用于透射电子显微镜的冷冻超薄切片样品的制备中。所述冷冻超薄切片的冷冻温度通常为O?-140°c。一般情况下，术语“超薄”指能满足透射电子显微镜测试要求的本领域所公知的切片样品的厚度(一般为10-100nm)。
[0012]为了尽量避免带入其他杂质，本发明所提供的移取液中所使用的水优选为纯净水，包括去离子水和/或蒸馏水，还包括其他高纯水。
[0013]本发明所提供的移取液可以根据不同材料所需的冷冻温度来调节配比，以具有适宜的冻结温度和粘度。在本发明的一些优选实施方案中，当冷冻温度为O?-80°c时，移取液中的水与有机醇类化合物的体积比为6:1?1: 1，优选为4:1?1:1;当冷冻温度为-80?-140°C时，移取液中的水与有机醇类化合物的体积比为1:1?1: 8，优选为1:1 ?1: 6。
[0014]在本发明中，上述有机醇类化合物优选选自无水乙醇、丙三醇、季戊四醇、环己醇和聚乙烯醇中的一种或多种。
[0015]本发明还提供了一种高分子材料冷冻超薄切片的制备方法，包括以下步骤:步骤A，将水和有机醇类化合物按比例混合，得到如上所述的移取液；步骤B，用钼金环蘸取经步骤A得到的移取液，放入切片机的冷冻室中冷冻，然后在切片刀的刀刃下方粘取已经切出的切片；步骤C，移出带有切片的钼金环，将其放置于铜网上，其中切片与铜网接触，待移取液液化后，切片贴附在铜网的表面上，移开钼金环，晾干铜网及切片。在一些实施方案中，所述高分子材料冷冻超薄切片的制备方法具体是用于透射电子显微镜测试的高分子材料冷冻超薄切片样品的制备方法。
[0016]在一个具体实施方案中，移取液可通过在干净的硬质支持物(优选为载玻片)上按比例滴加(例如使用移液管滴加)去离子水和醇类化合物来配制。然后将钼金环浸入该移取液中。优选地，将钼金环从支持物上的移取液的侧面浸入，并在孔环中形成一层液膜。在另一个实施方案中，取去离子水和醇类化合物，按比例混合于容器中形成移取液，然后将钼金环放入容器中浸取移取液。
[0017]在一个优选实施方案中，上述步骤C还包括在将钼金环放置于铜网上后，使用滤纸从铜网下方(即与切片接触的铜网一侧的背面)吸走移取液。通过这种方式，一方面能够使切片更加快速、平整地贴附于铜网的上表面上，另一方面加速了晾干的速度。
[0018]优选地，在步骤B中，钼金环在冷冻室中冷冻的时间为10?20s。
[0019]优选地，所述高分子材料的玻璃化温度为O?_160°C，进一步优选为O?_140°C。
[0020]在本发明中，移取液的液化时间可以通过调节水与有机醇类化合物的比例来改变。液化时间太长会增加样品被污染和损坏的可能性。因此，在步骤C中，移取液液化的时间优选为I?3min。
[0021]优选地，在步骤C中，铜网晾干时间为3?5min。
[0022]本发明所提供的高分子材料冷冻超薄切片移取液组成成分简单，配制方法简单易行，使用后无需清洗切片，并可以根据切片材料的冷冻温度简易地调节配比，从而达到最优的移取效果。本发明提供的使用本发明的移取液的高分子材料冷冻超薄切片的制备方法，操作步骤简单，适用于使用玻璃刀或钻石刀的情况，并且对刀刃无损坏，切片移取后的切片无需进行冲洗，可直接进行染色，从而减少了操作步骤。本发明尤其为透射电子显微镜测试提供了一种高效简易的高分子材料冷冻超薄切片的制备方法。此外，本发明的方法适用于多种玻璃化温度的高分子材料的冷冻超薄切片。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1A是实施例1的苯乙烯-丁二烯-异戊二烯三元共聚物切片样品的透射电子显微镜图；
[0024]图1B是对比例I的苯乙烯-丁二烯-异戊二烯三元共聚物切片样品的透射电子显微镜图；
[0025]图2A是实施例2的苯乙烯-丁二烯-丙烯腈三元共聚物切片样品的透射电子显微镜图；
[0026]图2B是对比例2的苯乙烯-丁二烯-丙烯腈三元共聚物切片样品的透射电子显微镜图；
[0027]图3A是实施例3的聚丙烯/S12切片样品的透射电子显微镜图；
[0028]图3B是对比例3的聚丙烯/S12切片样品的透射电子显微镜图。
【具体实施方式】
[0029]下面将结合附图对本发明作进一步地说明，但应该理解，本发明的范围并不限于以下实施例。
[0030]实施例1
[0031]在干净清洁的载玻片上按体积比滴加去离子水、无水乙醇和环己醇(去离子水:无水乙醇:环己醇=1: 1.5: 0.5)配制冷冻超薄切片移取液，然后将钼金环浸入移取液中。将蘸有移取液的钼金环放入切片机的冷冻室内，在_140°C下冷冻20s，然后在切片刀刀刃下方粘取已切好的苯乙烯-丁二烯-异戊二烯三元共聚物(SIBR)切片样品。移出带有切片样品的钼金环，将其水平放置在铜网上，其中钼金环带有切片样品的一侧朝下，与铜网接触，用滤纸从铜网下面吸取移取液，Imin后移开钼金环，使超薄切片样品平整地贴附在铜网的上表面。铜网晾干后，用锇酸将切片染色3h，然后采用透射电子显微镜观察切片，结果如图1A所示。
[0032]对比例I
[0033]操作步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于，将移取液更换为蔗糖的磷酸盐溶液。结果得到的SIBR切片样品的透射电子显微镜图如图1B所示。其中，透射电子显微镜的设定参数如放大倍数与实施例1相同。
[0034]实施例2
[0035]在干净清洁的载玻片上按体积比滴加去离子水、无水乙醇和季戊四醇(去离子水:无水乙醇:季戊四醇=4: I: I)配制冷冻超薄切片移取液，然后将钼金环浸入移取液中。将蘸有移取液的钼金环放入切片机的冷冻室内，在-110°C下冷冻10s，然后在切片刀刀刃下方粘取已切好的苯乙烯-丁二烯-丙烯腈三元共聚物(ABS)切片样品。移出带有切片样品的钼金环，将其水平放置在铜网上，其中钼金环带有切片样品的一侧朝下，与铜网接触，2min后移开钼金环，使超薄切片样品平整地贴附在铜网的上表面。铜网晾干后，用锇酸将切片染色3h，然后采用透射电子显微镜观察切片，结果如图2A所示。
[0036]对比例2
[0037]操作步骤与实施例2基本相同，不同之处仅在于，不使用移取液，而是通过利用预冷的睫毛针将切片拨到紧靠刀刃的预冷铜网上来移取切片样品。结果得到的ABS切片样品的透射电子显微镜图如图2B所示。其中，透射电子显微镜的设定参数如放大倍数与实施例2相同。
[0038]实施例3
[0039]在干净清洁的载玻片上按体积比滴加去离子水、无水乙醇和丙三醇(去离子水:无水乙醇:丙三醇=1: 0.5: 1.5)配制冷冻超薄切片移取液，然后将钼金环浸入移取液中。将蘸有移取液的钼金环放入切片机的冷冻室内，在_30°C下冷冻10s，然后在切片刀刀刃下方粘取已切好的聚丙烯/S12切片样品。移出带有切片样品的钼金环，将其水平放置在铜网上，其中钼金环带有切片样品的一侧朝下，与铜网接触，2min后移开钼金环，使超薄切片样品平整地贴附在铜网的上表面。铜网晾干后，直接用透射电子显微镜观察切片，结果如图3A所示。
[0040]对比例3
[0041]操作步骤与实施例3基本相同，不同之处仅在于，将移取液更换为蔗糖的磷酸盐溶液。结果得到的聚丙烯/S12切片样品的透射电子显微镜图如图3B所示。其中，透射电子显微镜的设定参数如放大倍数与实施例3相同。
[0042]分别比较图1A和1B、图2A和2B以及图3A和3B发现，采用本发明提供的方法制备的切片样品进行透射电子显微镜观察时，得到的图像分辨率更高、对比度更好，观察到的样品的相态结构更加清晰、表面更加平整。由此可见，通过本发明提供的高分子材料冷冻超薄切片制备方法更有利于高分子材料的微观形貌观察。
【权利要求】
1.一种高分子材料冷冻超薄切片移取液，由体积比为6:1?1: 8的水和有机醇类化合物组成。
2.根据权利要求1所述的移取液，其特征在于，所述冷冻超薄切片的冷冻温度为O ?-140。。。
3.根据权利要求2所述的移取液，其特征在于，当冷冻温度为O?_80°C时，移取液中的水与有机醇类化合物的体积比为6:1?1:1 ;当冷冻温度为-80?-140°C时，移取液中的水与有机醇类化合物的体积比为1:1?1: 8。
4.根据权利要求1所述的移取液，其特征在于，所述移取液中水和有机醇类化合物的体积比为4:1?1: 6。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的移取液，其特征在于，所述有机醇类化合物选自无水乙醇、丙三醇、季戊四醇、环己醇和聚乙烯醇中的一种或多种。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的移取液，其特征在于，所述水为去离子水和/或蒸馏水。
7.一种高分子材料冷冻超薄切片的制备方法，包括以下步骤: 步骤A:将水和有机醇类化合物按比例混合，得到如权利要求1-6中任一项所述的移取液； 步骤B:用钼金环蘸取经步骤A得到的移取液，放入切片机的冷冻室中冷冻，然后在切片刀的刀刃下方粘取已经切出的切片； 步骤C:移出带有切片的钼金环，将其放置于铜网上，其中切片与铜网接触，待移取液液化后，切片贴附在铜网的表面上，移开钼金环，晾干铜网及切片。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤C还包括在将钼金环放置于铜网上后，使用滤纸从铜网下方吸走移取液。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在步骤B中，钼金环在冷冻室中冷冻的时间为10?20s。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述高分子材料的玻璃化温度为O?_160°C，优选为O?-140°C。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤C中，移取液液化的时间为I?3min ;铜网晾干时间为3?5min。
【文档编号】G01N1/06GK104458322SQ201310459485
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】杨娟, 刘滢, 郭曦 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司北京化工研究院