一种适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法
【专利摘要】本发明涉及一种适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法，首先对冷冻切片机的冷冻箱、样品头设定温度，制作包埋纸盒并将其固定在样品盘中；选取油棕叶片材料，修剪成样品；在包埋纸盒中加入OCT冷冻包埋剂，然后将样品垂直放入包埋剂中，在-20℃条件下冷冻至冷冻包埋剂完全凝固，快速修剪包埋块后进行切片、封片，得到用于观察油棕叶片解剖结构的切片，将完成的切片在显微镜上观测，获得所需图像。本发明采用冷冻切片技术可快速获得油棕叶片结构完整的冷冻切片，切片平整、无皱褶、厚度均匀，显微结果清晰，有利于开展油棕叶片解剖结构的观察和研究，在培育适合我国栽培的品种或筛选优良种质资源类型的工作中具有重要的意义。
【专利说明】一种适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法
【技术领域】
[0001]本发明属于显微观察样品【技术领域】，涉及一种植物组织冷冻切片的制备方法，具体是一种基于冷冻切片技术的适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法，包括适合油棕叶片组织冷冻切片的冷冻切片机的参数设定和包埋纸盒的制作、样品固定、切片、封片和观察等。
【背景技术】
[0002]油棕(Elaeis guineensis Jacq.)是世界上生产效率最高的产油植物，具有广阔的开发利用前景，但是我国油棕产业起步较晚，品种主要从国外引进，尚无具有自主知识产权的油棕新品种，而从国外引进油棕品种需要经过长期的引种、试种观察，才能确定能否在生产上应用，因此，有必要对油棕种质资源进行鉴定评价，从而择优利用种质资源。
[0003]叶片解剖结构研究作为鉴定种质资源的重要依据之一，常作为评价植物适应性强弱的重要手段，主要是通过利用植物组织切片在显微镜下观察其结构的特征而得以实现，因此，探索快速获得切片的方法在鉴定评价大量油棕种质时有重要的应用价值，有利于缩短油棕种质资源的鉴定周期。
[0004]作为植物组织切片的主要方式，石蜡切片技术存在前处理时间长、操作繁琐等缺点，不利于对油棕种质资源进行大量快速的鉴定。冷冻切片技术弥补了这些缺点，制片周期较短，观察效果好，适合工作量较大的种质资源鉴定工作。探索适合的冷冻切片技术应用于油棕组织解剖结构及细胞学研究中是一个重要问题，以前虽有其它植物组织冷冻切片的报道，但是，不同种类的植物组织有不同的特性，相关结果虽然有借鉴意义，却不能完全应用于油棕组织切片研究，目前，尚未见将冷冻切片技术应用于油棕叶片解剖结构研究的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法，采用冷冻切片技术可快速获得结构清晰、完整的冷冻切片，有利于根据叶片的解剖结构开展油棕种质资源的鉴定和评价工作，对于培育或筛选适合我国栽培的油棕品种或种质资源具有重要的意义。
[0006]本发明所采用的技术方案:
[0007]一种适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法，其步骤如下:
[0008]1、冷冻切片机预冷:启动冷冻切片机，冷冻箱设定温度为-20°C，样品头温度设定为-10°c，待仪器各部位达到设定温度后开始后续操作。
[0009]2、材料固定:选用硬质白纸，裁剪折叠成长、宽、高均为5mm的纸框作为包埋纸盒，用于放置待切油棕叶片组织及冷冻包埋剂；在样品盘中加入少量包埋剂，然后垂直将包埋纸盒放在样品盘上，再置于冷冻切片机中的冷冻台上，待包埋剂在低温条件下冷冻凝固后完成对包埋纸盒的固定；选取油棕叶片材料，修剪成2_X 2mm大小的方形样品；取出固定好包埋纸盒的样品盘，在包埋纸盒中加入OCT冷冻包埋剂，然后将修剪好的样品垂直放入包埋剂中，将样品盘放入冷冻切片机的箱体中，在-20°C条件下冷冻至冷冻包埋剂完全凝固(约5分钟)，完成待切材料的包埋与固定。
[0010]所述油棕叶片材料是指叶片的叶缘、叶尖或叶中部。
[0011]3、修剪包埋块:从冷冻切片机的冷冻箱中取出已经冷冻固定的包埋块，快速用手术刀片修剪包埋块，切除包埋块四周的纸壁和多余的包埋剂。修剪过程应该迅速，防止包埋剂融化。
[0012]4、切片:这个过程分为三步，首先是样品初切，将样品盘装入样品头，安装刀片，将切片厚度调整至50 μ m-60 μ m处，开始初切包埋块，直至除去样品组织边缘(这一步骤是为了修整待切面，为下面获得效果较好的切片做准备，一般在切到待切组织后，再连续切除5-10片可以除去待切叶片组织边缘)；第二步是切取目的厚度的切片，调整切片厚度至5 μ m,开始切第一片仍为50 μ m-60 μ m厚度的切片，切下后清除，再切片即为目前所选5 μ m厚度，控制样品头匀速运动，可获得所需厚度的连续切片；第三步是观片的获取，将切片吸附到载玻片上，然后快速滴加甘油并盖上盖玻片(由于切片组织较薄，切片粘到载玻片上后很快融化，叶片内部各个结构很容易因脱水而萎缩，使观片时得到的为失真的图像)，得到用于观察油棕叶片解剖结构的切片。
[0013]5、观片:将完成的切片在显微镜上观测，获得所需图像。
[0014]本发明采用冷冻切片技术可快速获得油棕叶片结构完整的冷冻切片，切片平整、无皱褶、厚度均匀，显微结果清晰，具有时间短、结果清晰等优点，有利于开展油棕叶片解剖结构的观察和研究，在培育适合我国栽培的品种或筛选优良种质资源类型的工作中具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是不同厚度的冷冻切片比较。
[0016]图2是不同条件下显微图像结果比较。A、立即滴加甘油并用盖玻片封片；B、延迟滴加甘油并用盖玻片封片；C、不滴加甘油并用盖玻片封片。
[0017]图3是油棕叶片的石蜡切片与冷冻切片效果比较。A、厚度为8μπι的石蜡切片的显微图像；Β、厚度为5μπι的冷冻切片的显微图像。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0019]实施例一
[0020]在开始切片以前先将莱卡冷冻切片机(型号LEICA CM1900)预冷，冷冻箱设定温度为-20°C，样品头温度设定为-10°C。这一过程根据不同的外界环境温度而需要不同的时间来完成，一般可在I?2个小时后达到设定条件，待仪器各部位达到设定温度后开始如下操作。
[0021 ] 1、选用质地较厚的白色A4打印纸，折叠裁剪成约长、宽、高均为5mm的小纸框作为包埋纸盒，用于放置待切样品组织及包埋剂。[0022]2、在样品盘中加入少量包埋剂，然后垂直放上包埋纸盒，再将样品盘放入已经预冷的切片机箱体中，在_20°C的条件下冷冻，OCT冷冻包埋剂快速凝固成白色固体物质，达到将包埋纸盒固定在样品盘上的目的。
[0023]3、选取油棕叶片材料，初切成为5mmX 5mm大小的方块，再修剪成2mmX 2mm的片状
方形样品。
[0024]4、取出带有包埋纸盒的冷冻好的样品盘，在包埋纸盒中加入OCT冷冻包埋剂，然后用镊子尖端蘸取少量包埋剂，将待切组织粘起垂直放入包埋剂中。
[0025]5、将样品盘放入冷冻切片机的箱体中，在_20°C条件下冷冻，约5分钟后冷冻包埋剂完全凝固，完成待切材料的包埋与固定。
[0026]6、从冷冻切片机的冷冻箱中取出已经冷冻固定的包埋块，快速用手术刀片修剪包埋块，切除包埋块四周的纸壁和多余的包埋剂。
[0027]7、将样品盘装入样品头，安装刀片，将切片厚度调整至50 μ m-60 μ m处，开始初切包埋块，直至除去样品组织边缘。这一步骤是为了修整待切面，为下面获得效果较好的切片做准备，一般在切到待切组织后，再连续切除5-10片可以除去待切叶片组织边缘。
[0028]8、清除切下的包埋块屑，调整切片厚度至5 μ m，侧滑刀片至未使用处以保持刀片锋利，开始切第一片仍为前一次所选50 μ m-60 μ m厚度的切片，切下后清除，再切片为目前所选厚度。
[0029]9、控制样品头匀速运动，可获得所需厚度的连续切片。
[0030]10、将放在室温条件下的载玻片靠近切片，切片可自动吸附到载玻片上，然后快速滴加甘油并盖上盖玻片。
[0031]11、将得到切片置于显微镜(型号Leica DM2500)下观察油棕叶片解剖结构，拍照获取所需图像，结果如图3B。
[0032]重复上述步骤，分别调整切片厚度至20μπι、40μπι、60μπι，置于显微镜(型号Leica DM2500)下拍照获取所需显微图像，结果见图1。结果表明在相同放大倍数条件下，切片厚度越薄，获得视野越清晰，观察结构越明显。
[0033]将实施例一所得切片采用三种方式进行封片:1、立即滴加甘油并用盖玻片封片；
2、延迟滴加甘油并用盖玻片封片；3、不滴加甘油并用盖玻片封片。所获得的显微图像结果见图2，立即滴加甘油的封片可以获得较好的观测视野和真实的叶片解剖结构(图2Α)，延迟滴加甘油易导致产生气泡(图2Β)，而不滴加甘油会导致切片组织迅速失水萎缩，叶片内部组织失去真实结构而无法达到观测效果(图2C)。
[0034]对照:采用传统石蜡切片法制备油棕叶片厚度为8μπι的切片样品，在LeicaDMILLED倒置生物显微镜下观察拍照。结果如图3Α。
[0035]由图3可以看出，本发明所采用的冷冻切片法得到油棕叶片的切片平整、无皱褶、厚度均匀，其显微结果结构完整、排列整齐，清晰，与石蜡技术相比，具有时间短、结果清晰等优点，有利于开展油棕叶片解剖结构的观察和研究，在培育适合我国栽培的品种或筛选优良种质资源类型的工作中具有重要的意义。
[0036]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法，其特征在于，其步骤如下: 1)、冷冻切片机预冷:启动冷冻切片机，冷冻箱设定温度为-20°C，样品头温度设定为-1o°c，待仪器各部位达到设定温度后开始后续操作； 2)、材料固定:选用硬质白纸，裁剪折叠成长、宽、高均为5_的纸框作为包埋纸盒；在样品盘中加入少量包埋剂，然后垂直将包埋纸盒放在样品盘上，再置于冷冻切片机中的冷冻台上，待包埋剂在低温条件下冷冻凝固后完成对包埋纸盒的固定；选取油棕叶片材料，修剪成2_X 2mm大小的方形样品；取出固定好包埋纸盒的样品盘,在包埋纸盒中加入OCT冷冻包埋剂，然后将修剪好的样品垂直放入包埋剂中，将样品盘放入冷冻切片机的箱体中，在_20°C条件下冷冻至冷冻包埋剂完全凝固，完成待切材料的包埋与固定； 3)、修剪包埋块:从冷冻切片机的冷冻箱中取出已经冷冻固定的包埋块，快速用手术刀片修剪包埋块，切除包埋块四周的纸壁和多余的包埋剂； 4)、切片:这个过程分为三步，首先是样品初切，将样品盘装入样品头，安装刀片，将切片厚度调整至50 μ m-60 μ m处，开始初切包埋块，直至除去样品组织边缘；第二步是切取目的厚度的切片，调整切片厚度至5 μ m，开始切第一片仍为50 μ m-60 μ m厚度的切片，切下后清除，再切片即为目前所选5μπι厚度，控制样品头匀速运动，可获得所需厚度的连续切片；第三步是观片的获取，将切片吸附到载玻片上，然后快速滴加甘油并盖上盖玻片，得到用于观察油棕叶片解剖结构的切片； 5)、观片:将完成的切片在显微镜上观测，获得所需图像。
2.根据权利要求1所述的冷冻切片方法，其特征在于:所述油棕叶片材料是指叶片的叶缘、叶尖或叶中部。
【文档编号】G01N1/06GK103926109SQ201410170900
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月26日 优先权日:2014年4月26日
【发明者】张大鹏, 曹红星 申请人:中国热带农业科学院椰子研究所