减少核酸杂交中C_ot-1DNA畸变的发生的制作方法

专利名称：：减少核酸杂交中C_ot-1DNA畸变的发生的制作方法减少核酸杂交中Cot-lDNA畸变的发生相关申请的交叉参考本申请要求之前于2005年11月18日提交的待批临时申请系列号60/737，986的权益，其内容纳入本文作参考。序列表本申请还附纸件形式的序列表，也纳入本文作为参考，同时以计算机可读的ASCII文件形式在U.S.P.T.O电子提交系统中递交相同内容。发明背景1.发明领域本发明涉及抑制耙基因组或转录基因组中存在的重复元件与核酸探针中对应的重复元件之间非特异性交叉杂交，同时避免探针中单拷贝序列与抑制性DNA中外来单拷贝序列之间偶然杂交的材料和方法。更具体说，本发明涉及开发和应用基本上缺乏重复序列的探针，和开发和应用合成的基本上没有单拷贝元件的抑制性重复DNA。甚至更具体说，这类重复DNA包含的重复序列对应于毗邻一外或多个代表性基因组区域中的单拷贝元件的中至高拷贝重复元件。2.现有技术描述微阵列和阵列为基础的比较基因组杂交研究已促进了对基因表达和基因座拷贝数的广泛基因组研究。不同实验室交互验证研究提出了关于这些技术重复性的持续讨论"5。减少复制研究所得结果差异的策略集中于关注如何使技术因素，如阵列产品、RNA合成、标记、杂交、扫描、和数据分析的标准化6—8。Zakharkin等s提出样品之间的生物学差异是这种差异的最大来源，其它因素的作用程度较弱。当用杂交探针分析DNA时，必须先封闭耙DNA中的重复序列，然后才使探针与靶DNA杂交，以心避免探针中的重复元件与靶DNA中的同源重复元件之间杂交产生高背景噪音。单倍体基因组中常有多个拷贝的重复序列。拷贝数范围从二个到数十万个，其中DNA的A1U家族是后者数目变化的典型例子。多个拷贝的重复序列可聚集成簇或间插在整个基因组中。重复序列可在基因组中一处或多处聚集成簇，例如重复序列可位于各染色体的着丝点处和有各种数目的串联重复序列(VNTR)Nakamura等，Science,235;1616(1987);或重复序列可分布在一个染色体上，如Bardoni等，Cytogenet.CellGenet，46:575(1987)报导只在X染色体裁上发现有重复序列；或重复序列可分布在所有的染色体上，如重复序列的Alu家族。基因中可发现复杂性低的简单重复序列，但在基因组的非编码序列中更常见。这种重复元件由一个、二个、三个、四个、或五个核苷酸核心序列元件组成，排列成串联单元。不同个体基因组中相同位置处包含这些重复序列的串联单元数目常不同。搜寻基因组序列中的核心序列元件的保守性连缀可发现这些重复元件。竞争杂交，也称为抑制杂交提供了封闭可能的压倒性DNA信号的方法。未标记的竞争DNA或抑制DNA含有能结合耙DNA中同源重复元件的高数量重复元件，因此能阻止标记探针的重复部分与靶核酸中这种重复元件结合，从而提高探针主要与非重复性靶序列杂交的几率。大多数微阵列杂交研究共同需要利用富含重复序列(C。t-l)的DNA来抑制或封闭探针中的重复朝花夕拾与基因组(或转录基因组)中其它部位之间的非特异性交叉杂交。现有技术通常在FISH之前山性DNA劝C。t-1与耙DNA的杂交以避免发生背景杂交，即非特异性杂交。在人类中，这种C。t-l组分高度集中于含有间插重复元件，如短和长间插重复元件SINE和LINE^'"的家族中。商品化产生C。t-1DNA制品的方法反复说明基因组DNA的变性和重连接，这可通过Alu元件(三重折叠大大超过正常基因组的相应水平)和Ll元件(四重折叠大大超过正常基因组的相应水平)的丰富程度来监测。目前的质控方法不能测定C。t-1DNA的精确组成或序列。虽然C。t-l组分看来能抑制探针的重复元件与耙DNA的对应或同源重复元件之间的非特异性杂交，但也增加了实验的嗓音12(图1)。因此，研究了C。t-l组成中的差异是否可能是基因组杂交研究结果差异的主要来源。采用序列明确的基因组单拷贝(SC)探针"和由毗邻的SC及重复性基因组序列构成的探针，进行定量微球体杂交试验(QMHf'"阐明了C。t-1在基因组杂交中的作用。确定C。t-1能促进包含毗邻的共生同源重复序列(通常与该探针无关)的稳定双链体(探针中的一拷贝序列与C。t-lDNA中的一拷贝序列杂交)的形成，从而阻止了对一拷贝序列杂交的精确量化。C。t-1中的一拷贝元件与探针中一拷贝的同源元件杂交扭曲了(假扩增)探针信号。图1说明C。t-1105与基因组DNA靶100杂交抑制或阻断了靶100中重复元件115不能被利用与探针110中的共生同源重复元件120杂交。显示重复元件115与C。t-1DNA105中的抑制性重复元件117平行(进化)相关，从而表明元件115与117能杂交。作为现有技术的一种典型，探针110包含一个拷贝元件135及外来的重复元件120，选择和合成一拷贝元件135使之与靶100中的一个同源拷贝元件140选择性杂交。如上所述，将探针110偶联于微球145用于探针的检测和定量。如该研究所预计的那样，显示探针110能与靶110杂交。除与靶115中的重复元件杂交外，C。t-1105中的一拷贝元件130也与探针125中的同源单拷贝元件135杂交，从而提高了该探针的信号3倍。2006年8月16日提交的题为"微球悬液杂交的量化及其应用(QuantificationofMicrosphereSuspensionHybridizationandUsesThereof)"的专禾U申请PCT/US2006/032693采用低或单个拷贝的基因组杂交探针的微球悬液杂交试验，能用流式细胞计数法直接分析整个基因组DNA(或RNA)，此专利内容纳入本文作参考。因此，本领域需要抑制核酸探针与C。t-1DNA中元件杂交时产生信号畸变的方法；抑制探针与耙DNA非特异性杂交的方法；抑制抑制性或竞争性DNA与耙部分以及探针中单个拷贝序列杂交的方法；鉴定和合成抑制性DNA，合成的重复性DNA产物有效作为抑制性DNA的方法；和利用这种合成的抑制性DNA与基本上没有重复元件的单个拷贝探针联合的核酸杂交系统。发明概述本发明通过用合成的富含重复元件但基本上没有单个拷贝元件或很低的9抑制性核酸替代C。t-l，克服了上述问题并提供了抑制C。t-1DNA所致畸变作用的新方法和产品。概括地说，本发明方法包括制备合成的抑制性DNA和使此抑制性DNA与耙基因组DNA杂交以封闭靶部分中重复序列，然后使探针与靶部分杂交的步骤。优选，所述针没有或基本上没有重复元件，所述抑制性DNA没有或基本上没有单或低拷贝的DNA延伸段。在某些优选形式中，所述方法包括的步骤为通过偶联光谱编码(spectrally-encoded)的聚苯乙烯微球与选择的低拷贝合成的DNA序列制备杂交探针；使靶基因组DNA与本发明的合成的抑制性或封闭性DNA预杂交；再使所述探针与靶基因组DNA杂交；和用流式细胞计数法检测杂交产物。杂交试验中出现的C。t-1所导致的信号畸变通过靶部分与合成的重复元件预杂交抑制了交叉杂交而减少，所述的重复元件没有或基本上没有单个拷贝序列，优选没有或基本上没有低拷贝序列。与目前的杂交试验不同，本发明的杂交试验用开发的包含选择的重复元件但不包含竞争性单(或低)拷贝元件的DNA替代C。t-1抑制性DNA。所选的本发明的合成DNA优选是由于其与侧接有单(或低)拷贝感兴趣序列的靶DNA的重复区域同源，所述感兴趣序列对应于所述单(或低)拷贝杂交探针的序列或与之同源，所述杂交探针设计用来与所述感兴趣单(或低)拷贝序列杂交。本发明的方法和产物能有效减少(l)抑制性DNA与探针中同源元件之间，(2)探针中单或低拷贝元件与抑制性DNA中的同源单(或低)拷贝元件之间，和(3)探针中重复元件与靶基因组序列中同源元件之间的额外交叉杂交。本发明的单或低拷贝探针优选基本上，甚至更优选完全没有重复元件，合成的抑制性DNA基本上，甚至更优选完全没有单或低拷贝元件。图2说明合成的抑制性DNA205与基因组DNA靶200杂交能抑制或封闭此耙DNA中的重复元件215。如图所示，合成的抑制性DNA205不提供额外的能与探针210中单或低拷贝元件235，或耙200中单或低拷贝元件240杂交的单或低拷贝元件，从而明显减少了此试验中单或低拷贝元件的交叉杂交。合成的探针210优选包含一个或多个单拷贝或低拷贝元件，但没有可能与抑制性DNA205或靶200中同源重复序列杂交的重复元件。图2中，探针信号与靶200中所含的单拷贝或低拷贝元件240的直接(信号)对比为1:1。因此，本发明一方面提供抑制核酸探针中存在的重复序列与靶核酸基因组中同源重复序列之间非特异性交叉杂交的方法。一般来说，该方法包括鉴定代表性基因组区域中的重复序列，合成衍生自所鉴定的重复序列的抑制性核酸，和使所述抑制性核酸与靶核酸反应。所述抑制性核酸宜含有一个或多个选自短散布元件、长散布元件、长末端重复序列、Alu元件、L1元件和DNA转座子的序列明确的PCR产物。此反应导致所述抑制性核酸中的重复序列与靶核酸中的同源重复序列杂交，从而基本上封闭了靶核酸中的重复序列使其不能与后续的反应性核酸探针中的同源重复序列杂交，结果抑制了探针中重复序列与靶核酸中同源重复序列之间的非特异性交叉杂交。这种抑制作用因所述抑制性核酸基本上由所鉴定的重复序列组成又基本上没有低拷贝序列而大大增强。合成的所述抑制性核酸优选完全没有低拷贝序列。在优选形式中，靶核酸包含低拷贝序列。合成的所述抑制性核酸优选包含选出的与一个或多个代表性基因组区域中的毗邻低拷贝序列的重复序列相对应的多个重复序列。在某些优选形式中，本发明方法还包括使靶核酸与含有与所述靶核酸中的低拷贝序列同源的低拷贝序列的一外或多个探针杂交的步骤。在优选形式中，所述探针基本上，甚至更优选完全没有重复序列。在其它优选形式，本发明方法包括使所述探针与光谱编码的聚苯乙烯微球偶联。此种探针优选用可检测部分标记以提高其可利用性。一些优选的可检测部分包括荧光团、酶偶联物、荧光团标签核苷酸、与携带抗原的核苷酸结合的荧光标记抗体、生物素-dUTP、地高辛(digoxygenin)-dUTP和它们的组合。此法以及本文中其它地方所述的方法可用于任何程序，这些程序中Cot-lDNA已用于或可能用于选自微阵列杂交试验、荧光原位杂交试验和微球体杂交试验等试验。另一方面提供合成抑制性核酸的方法。此方法一般包括鉴定代表性基因组区域中的重复序列；和通过合成能与所鉴定的重复序列杂交但不与所述代表性基因组区域附近或其中的低拷贝序列杂交的核酸序列来合成所述抑制性核酸的步骤。此合成的抑制性核酸优选基本上没有低拷贝序列。在某些优选形式中，本发明方法也包括根据它们与感兴趣低拷贝序列的相邻性(proximity)选择某些经鉴定的重复序列来合成所述抑制核酸。这些经鉴定的重复序列是最靠近感兴趣低拷贝序列的那些序列。此种合成的抑制核酸优选不含有能与该感兴趣低拷贝序列杂交的序列。当然，本发明的合成的抑制性核酸可用于杂交试验，特别是可用于Cot-l或封闭DNA的杂交试验。一些优选的杂交试验包括荧光原位杂交试验，微阵列试验和微球体杂交试验。本发明另一方面提供提高低拷贝数核酸探针与靶核酸中同源区域之间杂交特异性的新型方法。此方法通常包括使靶核酸中的重复元件与抑制性核酸中的同源重复元件杂交的步骤，其中，合成或选择的抑制性核酸包含多个重复元件，且基本上，更优选，完全不含有低拷贝数元件，和使靶核酸中的低拷贝数元件与一个或多个核酸探针中的同源低拷贝数元件杂交。在优选形式中，选出的所述抑制性核酸中的重复元件与一个或多个代表性基因组区域中低拷贝元件侧翼的重复元件基本同源。甚至更优选，此侧翼重复元件是中到高拷贝数，而所述低拷贝元件包括单拷贝元件。还要更优选，所述探针基本上没有重复元件。本发明另一方面提供精确量化核酸序列拷贝数的方法。这种方法通常包括的步骤有制备具有第一光谱地址的第一光谱编码荧光微球，和具有第二光谱地址的第二光谱编码荧光微球，通过确认怀疑含有感兴趣序列的靶核酸序列的核苷酸-核苷酸序列鉴定靶基因组核酸探针的序列，合成由鉴定的耙基因组核酸探针序列衍生的低拷贝靶探针，此靶探针含有至少一个低拷贝元件且基本上没有重复元件，将此耙探针与第一微球偶联，合成所选的与该耙核酸序列的参比核酸序列杂交的参比探针，将所述参比探针与具有第二光谱地址的微球偶联，鉴定代表性基因组区域中的重复序列，合成抑制性核酸，所述抑制性核酸包含与所述鉴定的重复序列杂交的充分同源性序列，所述抑制性核酸基本上含有重复元件且基本上没有低拷贝元件，使抑制性核酸与染色体靶核酸反应，从而导致抑制性核酸中的重复元件与染色体靶序列中的同源重复元件杂交，使靶探针与染色体靶序列反应从而导致靶探针中低拷贝元件与染色体靶序列中的同源低拷贝元件杂交，使抑制性核酸与含有染色体靶序列染色体参比序列反应从而导致抑制性核酸中的重复元件与染色体参比序列中的同源重复元件杂交，使参比探针与染色体参比序列反应从而导致参比探针与参比染色体杂交，通过第一光谱地址检测杂交的靶探针，通过第二光谱地址检测杂交的参比探针，和比较检测到的杂交耙探针的反应与检测到的杂交参比探针的反应来量化检测到的靶探针。在优选形式中，所述抑制性DNA包含的重复元件与耙中低拷贝元件相毗邻的基因组重复元件相对应的重复元件。本发明另一方面，提供抑制核酸探针中存在的重复元件与靶核酸中的同源重复元件之间非特异性交叉杂交的方法。此方法通常包括使抑制性核酸与含有一个或多个低拷贝元件的靶核酸中同源重复元件杂交的步骤。优选地，合成或选择的抑制性核酸含有选出的与含有毗邻中至高拷贝数重复元件的单拷贝区域的一个或多个代表性基因组区域相对应的多个重复元件且基本上不含低拷贝元件。然后，再使所述靶核酸与含有与所述靶中的低拷贝元件同源的低拷贝元件的一个或多个探针杂交，所述探针基本上不含重复序列。本发明另一方面，提供抑制抑制性核酸中存在的低拷贝元件与靶核酸中的同源低拷贝元件之间的非特异性交叉杂交的方法。该方法通常包括鉴定靶核酸中和附近的重复性和低拷贝元件，通过从所述靶核酸中选择重复序列将其包含在所述制性核酸中同时在所述合成中基本上避免包含低拷贝序列来合成抑制性核酸序列，和使合成的抑制性核酸与耙核酸反应，而使各同源性抑制核酸与靶核酸元件互相杂交。本发明也提供利用抑制或封闭DNA(如Cot-lDNA)来提高试验精确度和重复性的方法，包括选择或合成含有多个重复元件但基本上没有低拷贝序列的抑制性核酸，和釆用所选择的或合成的抑制性核酸替代Cot-lDNA的步骤。本发明另一方面，提供抑制基因组靶核酸与核酸探针额外杂交的方法。此方法通常包括选择基因组中对应于感兴趣序列的一条或多条序列来制备用于杂交的基因组靶核酸；鉴定感兴趣靶序列中的低拷贝序列；合成与所鉴定到的低拷贝耙序列同源的低拷贝探针，所述低拷贝探针基本上没有重复序列；鉴定毗邻于靶低拷贝序列的重复序列；合成与靶重复序列同源的抑制性DNA，该抑制性DNA基本上含有重复元件；使耙核酸与该抑制性DNA反应从而该抑制性DNA中的重复元件与靶核酸中的同源重复元件杂交；使靶核酸与所述低拷贝探针反应而使所述探针中的低拷贝元件与所述耙核酸中的同源低拷贝元件杂交；和检测该低拷贝探针以量化探针与靶的杂交，从而确定靶核酸中替代的低拷贝元件。定义除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员共同理解的相同含意。所有专利申请、公开的专利申请和其它公开的专利及本文参考的GenBank与其它数据库的序列它们的内容都纳入本文作参考。如果此节所述的定义与所述专利申请、公开的专利申请和其它公开的专利及纳入本文作参考的GenBank与其它数据库的序列内容相反或不一致，将取此节中所述及的定义而不取纳入本文的参考文献中的定义。如本文所用，"一个"或"一种"指"至少一个"或"一个或多个"。如本文所用，"核酸"指任何形式的脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)，包括单链、双链体、三链体、线性和环形。如本文所用，"序列"指核酸序列。如本文所用，术语"参比探针"指对基因组中某基因座的特异性探针，所述基因座优选常染色体序列中可造成严重损伤和优选致死性的具有拷贝数除2以外的基因座。参比探针可衍生自任何低拷贝或单拷贝染色体基因座，只要它在病人样品中具有正常的染色体组分。在为诊断体质疾病而测定基因组拷贝数时，参比探针通常是常染色体来源的正常发育中需要由二个等位基因表达的一个或多个基因(的探针)。对诊断癌症疾病而测定基因组拷贝数，从含有少量致癌基因的染色体区域选择参比探针，其应含有染色体的正常成分。如本文所用，"标记物"批号具有可检测物理性能的化学基团或部分，或任何能导致化学基团或部分显示楞检测性能的化合物，如能催化底物转变为可检测产物的酶。术语"标记物"也包括能抑制特定物理性能表达的化合物。"标记物"可以是结合对的一成员化合物，另一成员具有可检测的物理性能。示范性标记物包括质量基团、荧光基团、冷光基团、化学发光基团、光学基团、带电基团、极性基团、色素、半抗原、蛋白质结合配体、核苷酸序列、放射基团、酶、特定颗粒和它们的组合。如本文所用，"样品"指可能含有待分析靶核酸的材料。样品可以是生物样品，如生物体液或生物组织。生物体液的例子包括尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰液、脑脊液、眼泪、粘液、羊水等。生物组织是聚集的细胞，常由特定类型细胞与它们的胞间成分一起形成人的结构，动物、植物、细菌、真菌或病毒的结构，包括结缔、上皮、皮肤、肌肉和神经组织。生物组织的例子还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和单细胞集合，例如，分离自血浆、血液或尿液或用胶原酶处理的固体组织。如本文所用，"扩增"指线性倍增样品中的靶核酸分析物以提高试验的灵敏度。如本文所述，本领域已知有许多不同方法可扩增核酸。如本文所用，"微球组"指含有相同的光谱地址与一个lc探针或一组lc探针偶联的微球组。如本文所用，"低拷贝"或"lc"指能与基因组中靶核酸或区域的10个或较少个间隔序列杂交的序列。优选拷贝数为IO或更少，更优选7个或更少，还要优选5个或更少，最优选3个或更少。如本文所用，"单拷贝"或"sc"指能与基因组中靶核酸或区域的3个或较少个间隔序列杂交的核酸序列。因此，此术语包括极严格独特性的序列(即与相应基因组中的一个而且只有一个序列相互补的序列)，及其二链体和三链体。术语"单拷贝元件"和"单拷贝序列"也可用于指这类核酸序列。如本文所用，"高重复性的"指存在1000个以上的拷贝。如本文所用，"序列相同性"指二条或多条多核苷酸序列，即参比序列和与该参比序列作比较的某给定序列之间的关系。可通过将给定序列和参比序列作最佳排列后产生最高程度序列相似性，测定序列串之间的匹配进行序列的比较来测定二序列的相同性。比对时，根据碱基的位置对位置确定序列相同性，如具体位置的核苷酸相同则序列相同。然后将位置相同的总数除以参比序列的核苷酸或残基总数产生序列相同性百分比。用已知方法，包括但不限于《计算机分子生物学》(ComputationalMolecularBiology),Lesk，AN主编，牛津大学出版社，纽约(1988);《生物计算信息学和基因组计划》(Biocomputing:informaticsandGenomeProjects),Smith,DW，主编，学术出版社，纽约(1993);《序歹ll数据的计算机分析》(Computeranaysisofsequencedata),Griffm，AM禾口Griffm，HG主编，人类出版社(HumanaPress),新泽西(1994);《分子生物学中的序歹ll分析》(SequenceAnalysisinMolecularBiology),vonHeinge，G，学术出版社(1987);《序列分析引物》(S叫uenceAnalysisPrimer),geibskov，M和Devereux，J主编，M,斯图克顿出版社(StocktonPress),纽约(1991);Carillo，H和Lipman，D，SIAMJAppliedMath，48:1073(1988)。设计了测定序列相同性的优选方法给出了所测试序列之间的最大匹配。可利用公众可获得的计算机15程序编辑测定序列相同性的方法确定给定序列之间的相同性。这类程序的例子包括但不限于GCG程序包(Devereux，J等，NucleicAcidResearch,12(1):387(1984)、BLASTP、BLASTN禾tlFASTA(Altschul，SF等，JMolBiol，215:403410(1990)。这些程序采用缺口对序列作最佳比对可产生给定序列与参比序列之间最高水平的序列相同性。例如说，某多核苷酸的核苷酸序列与参比核苷酸序列具有至少例如95%的"序列相同性"，这意味该给定的多核苷酸的核苷酸序列与参比序列相同，除了该多核苷酸序列每IOO个核苷酸可包含最多5个与参比核苷酸不同。换言之，在含有与参比核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸中，该参比序列中最多5%的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代，或参比序列中总核苷酸的最多5%可插入到参比序列中。二序列之一中的转化可用这些计算机程序根据参比序列与同源性测试序列的反义链相似性检测。参比序列的这些变异可发生在参比核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间单个散布在参比序列核苷酸中的任何处，或参比序列中一个或多个毗邻基团中。如本文所用，"重复序列"是在基因组中作为靶DNA—部分的反复出现的序列，此重复序列之间的序列相同性至少约60%，更优选至少约80%，这是可能导致干扰探针与靶DNA所需特异性杂交的足够长度，即此时探针可能与多个拷贝重复序列杂交。一般而言，基因组中出现的重复序列至少为10倍，重复序列的大小范围从1个核苷酸至数百个核苷酸，重复单元的长度至少为10个核苷酸到数千个核苷酸。重复序列可以是任何形式，如串联、散布、回文或尖角重复序列(在靶区域中有一些拷贝，在基因组中那处有一些拷贝)，可出现在染色体的着丝点附近，分布在一条染色体全长上，或某些或所有的染色体上。正常时但有少数例外，重复序列不表达物理学上有用的蛋白南。"重复序列"也可称为"重复性序列"或"重复性元件"。如本文所用，"短散布元件"本文也称为SINE，指由RNA聚合酶III转录产生的含75bp-500bp长度重复单元的高度重复性散布性可转座元件。SIME元件中最丰富的一类是Alu家族。Alu序列度约300bp在人基因组中存在约500,000个拷贝。如本文所用，"长散布元件"本文也称为LIME，指由RNA聚合酶I转录产生的含高达7000bp重复单元的高度重复性散布性可转座元件。如本文所用，"长末端重复序列"本文也称为LTR，指含有通常长200-500bp的末端直接重复序列的一大类可转座元件。如本文所用，"MIR"重复序列指哺乳动物的含有长至少260bp重复单元在人基因组中有约105个拷贝的散布性重复元件。如本文所用，"MER"重复序列指起源未知在人基因组中拷贝数为100-1000个的中等散布性重复元件。如本文所用，中等(散布性)DNA指均匀分布在人基因组中存在10-1000个拷贝长度150-300bp的重复序列。一个例子是Alu家族。如本文所用，高度重复性DNA指在人基因组中存在1()S拷贝的长5-300bp的短重复序列。一个卫星DNA。如本文所用，术语"DNA转座子"或"转座子"指基因组中可从一处位置移动到另一处的DNA序列。这些序列也称为"可移动基因元件"。转座子移动通常称为转座。附图简述图1是说明探针与C。t-1DNA中单拷贝元件杂交的示意图。图2是说明抑制DNA与耙核酸中重复序列杂交的示意图。图3是说明在C。t-1DNA中的QMH杂交产生潜在结构的示意图。图4是说明所用的合成重复产品和探针抑制与基因组模板交叉杂交的示意图。优选实施方式的详细描述以下实施例提供了本发明的优选实施方式。这些实施方式显示了，单(或低)拷贝探针能与先前已与含有重复元件但无单拷贝或低拷贝元件的合成的DNA杂交的基因组靶核酸杂交。然而这些实施例目的只说明和公开本文的内容，不应构成对本发明范围的限制。实施例材料和方法定微絲飾,微扁泉合成將,微可检测到以标记的核酸片段形式或标记的核酸片段集合形式与靶序列杂交的探针。标记的探针可用于含有与该探针中序列同源的序列的任何靶核酸。这些靶核酸可包括但不限于含有单拷贝序列作为转录物整合组分的染色体或纯化的核酸DNA、异核RNA或mRNA。为确保详细解译，上述DNA靶序列和DNA探针为常用例子，然而本领域技术人员知道以上所述可等同(所知差异全归于靶序列和探针的性质)应用于其它种类的核酸。本发明优选探针的一个重要特征是它们由"低拷贝"或"单拷贝"或"独特"的DNA序列构成，此种序列均与靶DNA区域的至少感兴趣部分互补而且基本上没有与构成基因组靶区域一部分的重复序列互补的序列。因此，优选由单拷贝或独特序列构成的探针与相应基因组中的三个或多个序列互补，优选只与一个序列互补。低拷贝或混合的低拷贝和重复序列探针的设计或参见以前的报导"'15'16'2G。在优选形式中，本发明采用专门设计的能与单倍体基因组序列中独特基因座高特异性杂交的低拷贝或单拷贝杂交探针。探针选择和合成的方法可参见美国专利6，828,097和7,014，997，它们的内容纳入本文作参考。这些最初的步骤要求了解靶核酸和基因组重复序列二者的序列，其逐渐增多的可利用信息可向人类基因组计划(HumanGenomeProject)和相关生物信息研究(单位)査询。为了开发本发明的探针，必须知道靶DNA区域的序列。靶区域可以是重排已经过鉴定的整个染色体或只是其一部分。知道了这种序列，目标是确定靶区域中单拷贝或独特序列的边界。优选通过参比耙区域中重复序列位置而实现这点。通常将耙区域的序列与相应基因组的已知重复序列作比较，可利用已有的计算机软件。一旦鉴定好耙区域中的重复序列，推导的该间插序列即是低或单拷贝序列(即舭邻重复序列之间的序列)。可利用Smith等，Adv.Appl.Math.，2:482(1981)的局部同源性算法，或Needleman等，J.Mol.Biol.，48:443(1970)的同源性比对算法，最佳排列对比靶序列与重复序列进行比较。宜选择和合成至少二种不同的探针。应选择和合成至少一组能识别特定核酸序列中异常变化(如果存在)的探针(测试探针)，和选择和合成另一组识别参18比序列的探针(参比探针)。探针宜长60-1000碱基对，更优选80-500碱基对，最优选90-110碱基对。发现微球与约100碱基对的低拷贝探针偶联后能产生特性明确的平均荧光分布值和一致的较高次级平均荧光强度值，因而更精确地反映了真正的拷贝数。较短的偶联探针也更稳定，偶联后适当保存，优选在黑暗处4"C保存在杂交反应中可用二个月以上。这可减少标记的贮存微球的批间差异，从而减少偶联、定性和定量偶联探针的微球所需的工作量。其使用期长于偶联后二周内即显示杂交效率降低的偶联探针。此实施例中使用的探针包括含有sc间插物的探针(i)ABLla(2004-5，chr9:130623551-130625854)，其含有多样性的AluJo/Sx/L2重复序列，(ii)ABLlb(chr9:130627353-130628735)，其含有先前设计和经验证的ABL1中的多样性AluJo重复序列13'14,(iii)1823bp染色体9探针，其含有Alu/MER1重复序列，ABLlAluMERl(chr9:130621702-130623525)，(iv)TEKT3内含子的98bpsc区段(chrl7:15149108-15149206)和(v)PMP22内含子的101bpSC区段(chrl7:15073475-15073576)，(vi)H0XB1内含子的93bpsc区段(chrl7:43964237-43964330)。基因组重建实验的探针包括(vii)HOXBlb(chrl7:43963396國43965681)和(viii)C1QTNF7(chr4:15141452-15141500)。探针中所见重复序列定义为多样性，根据(在因特网girinst.org)与家族成员共有序列的差异百分比(>12%)，缺失百分(>4°/。)，和/或插入百分比(>4%)。微与錄,錄凝如前所述合成探针并与微球偶联13'2Q。合成期间根据具体的偶联反应，给探针加上氨基尾以便与不同的微球偶联。优选通过改进的碳二亚胺反应使探针与微球偶联。将各有特定的光谱地址(命名为Ll-L9;加州派罗阿托杜克科技公司(DukeScientific,PaloAlto，CA))和约2000,000个碳大小包衣的荧光微球分别与不同的lc探针偶联。将纯化的氨基修饰的lc探针通过改进的碳二亚胺交连程序与羧基化微球产(Dunbar等，2003;Fulton等，1997)。先加热变性各探针，然后在冰上快速冷却。将具有相同光谱特性的约3.125x105个微球滴入1.5ml微离心管(佛罗里达州奥卡拉的美国科技公司(USAScientific,Ocala，Florida))中，10000g离心2分钟，吸弃上清液。将150微升0.1MMES缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)pH4.5加入各管简单旋涡振荡微球然后lO,OOOg离心2分钟。除去上清液用80微升0.1MMES振荡重悬微球。各管加入单一lc探针(0.5nM)振荡混合。加入1.25微升体积10mg/ml的新制l-乙基-3-3-二甲氨基丙基碳二亚胺盐酸(EDC)，简单振荡反应液，避光培育30分钟偶而搅拌。重复搅拌和培育EDC二次，每次用新配制的1.25微升EDC溶液。加入500微升0.02%吐温(Tween)20停止反应，振荡和10，000g离心2分钟。除去上清液后每管加入250微升0.1%SDS，振荡，然后10，000g离心2分钟。小心除去上清液，加入25微升0.1MMESpH4.5，振荡试管后4"C避光保存。将1微升各微球加入到100微升1xPBS中，在FACSCalibur流式细胞计数仪(加州桑泽斯的BD公司(BectonDickinson,SanJose，Califomia))上采用以下给出的条件进行分析，量化微球浓度。已开发了与上述方法等同的核酸与微球偶联的其它方法。DNA与微球偶联的另一常用方法是使链霉亲和素包被珠与含有5'-末端用生物素修饰的核苷酸的探针结合。美国专利6,361,944已将金米颗粒与巯基修饰的核酸偶联。美国专利6，468，546;6,838，243;6,833,246;6，828,146和6,828,142已将蛋白-核酸与珠偶联。已通过亲电子连接试剂，即N-氯乙酰氨二已基氨基磷酸酯试剂(Guzaev等，BioorgMedChemLett1988-1215;8(24):3671-6)实现了寡核苷酸与微球的偶联。也已将DNA与半导体纳米晶体颗粒偶联(Taylor，J.R.，Fang，M.M.和Nie，S.M."用生物学方法偶联的荧光纳米颗粒检测DNA单部分上的特异性序歹ll"(ProbingspecificsequencesonsingleDNAmoleculeswithbioconjugatedfluorescentnanoparticle)Anal.Chem.，72，1979-1986;2000;W，Z，Guo.，J.J.Li，Y.A.Wang,X.G.Peng."通过树枝状桥制备半导体盒式纳米晶体的偶联化学方法及生物应用"(Conjugationchemistryandbioapplicationsofsemiconductorboxnanocrystalspreparedviadendrimerbridging)Chem.Mater.15，3125-3133(2003)，和美国专利6，630，307)。在一优选的实施方式中，微球本身被染色，将具有不同光谱地址的荧光聚苯乙烯微球与低拷贝探针偶联，得到低拷贝探针-偶联珠的各种组合，其中参比探针按不同的光谱地址命名。流式细胞计数仪能识别不同的光谱地址，允许与结合在不同组微球上的各种低拷贝探针发生多重反应。20麟鄉微吝如前所述13'2G，利用甲醇-乙酸固定的来源于骨髓样品的细胞遗传学制品中的沉淀细胞，制备了基因组模板(靶核酸序列)。不同于其它方法，此靶序列不作预先选择或扩增。因此，在本发明中可杂交基因组(或转录基因组)的整个拷贝作分析。根据样品的来源和状况，抽提细胞DNA(或RNA)，如需要可用常规方法体外复制。宜用GenomiPhi试剂盒(加州巴伦西亚恰根公司(Qiagen，Valencia,CA))体外复制所述核酸，此试剂盒只需用不到1纳克的样品核酸，需要的操作时间不到20分钟。然后用常规方法标记此DNA，优选在体外复制中直接标记，或采用由标记物与对此标记物具有亲和性的报告分子组成的间接标记系统。用可鉴定的标记物如荧光团、酶偶联物、或选自亲和素、链霉亲和素或特异性抗体可识别的生物素或部分来标记靶核酸。有几种类型的可鉴定的非同位素标记物。一类是能化学结合靶核酸可作为直接鉴定工具的标记物。此类的一个例子是荧光染料部分，当用适当波长的射线照射时，此部分被激发至高能态而发射荧光。本领域已知有直接标记荧光的核苷酸如Cy3-dUTP是标记用于本发明耙DNA的合适形式。直接DNA的其它方法可能也适合(例如用于Ulysses方法的市售氨基-烯丙基标记物(荷兰克里太克(Kreatech，Netherlands)),然而此法必须使基因组DNA片段(通过超声、DNA酶、剪切或用其它酶消化)化为适合杂交的大小，然后将标记的靶DNA加入到偶联探针的微球中。在一优选的实施方式中，核酸在体外复制期间用生物素-dUTP或地高辛-dUTP直接标记，超声处理得到的标记样品产生长约300bp-lkbp的片段。也可用切口平移法，利用修饰的、或直接标记的核苷酸来标记靶核酸(Rigby等，J.Mol.Biol.，113:237-251，1977),在常规方法中利用含有可鉴定的选择性标记物的反应试剂(但不限于此)使其偶联于核苷酸如dUTP或dATP。或用含荧光团标签的核苷酸直接标记这些片段，或通过使标记的双链体与能识别如下所述己掺入到这种片段中的核苷酸的荧光标记抗体结合而间接标记这些片段。切口平移(100微升)要用无内切核酸酶的DNA聚合酶I(罗氏分子生物化学公司(RocheMolecularBiochemicals))和DNA酶I(沃生顿化学品公司(WorthingtonChemical))。将各片段与DNA聚合酶1(4单位/mgDNA)、DNA酶(0.01-3mg/100n1反应液)、标记的核苷酸(0.05mM终浓度)和切口平移缓冲液混合。15。C反应60分钟，产生不同量的标记的探针片段，其核苷酸含量不同在约300-1000bp范围。或者，可在体外复制期间掺入生物素-dUTP或地高辛-dUTP，再用DNA酶I处理或用其它一些方法剪切得到的标记样品，产生长约300bp-lkbp的片段。常用的标记和检测核酸的其它方法可应用于检测本发明方法(制备的)低拷贝DNA偶联微球。这些物质包括荧光染料标记物和荧光组合物，如能量转移基团、偶联蛋白质、抗体或抗原。更具体说，切口平移时将1微克基因组DNA和pUC19DNA用生物素-16dUTP标记分别获得长100bp-350bp和50bp-300bp的产物17。将1微克各C。t-1DNA(得自制造商I和R)经切口平移用地高辛-lldUTP标记获得50bp-300bp产物。杂效座,叙潘册箭用含10,000探针偶联微球的40微升1.5xTMAC杂交缓冲液(3-mol/L氯化四甲铵、50mmol/LTris-HCI，pH8.0lg/L肌氨酰(Sarkosyl))稀释标记的DNA(50ng)。反应配制的组分列于表1中。表1微球杂交的量化(平均荧光强度)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*每次反应用生物素-16dUTP进行切口平移并用50ngFL2进行SPE检测。按前人描述进行杂交反应和检测13'，杂交反应的条件取决于具体的核苷酸组成和每条低拷贝探针的长度，这些本领域技术人员不难确定。对于杂交，用含有低拷贝探针偶联微球的杂交缓冲液稀释样品序列。探针偶联微球的用量取决于测试样品的量。每次杂交反应分析优选约5pg对1tig样品，更优选对约25-100ng样品，还要优选对约30-70ng样品，还更优选对约40-60ng样品，最优选对约50ng样品。因此，要杂交的每组缓冲液宜含有约2,000-10,000个探针偶联微球，更优选2,000-6，000个探针偶联微球，还要优选约4,500-5,500个探针偶联微球，最优选约5,000个探针偶联微球。稀释后宜在约95'C加热变性杂交反应物，然后在合适的杂交温度下杂交过夜，温度宜约45-51°C，取决于探针核酸的组成和长度。然后洗涤杂交的微球，离心去除未杂交的靶序列。除去上清液，染色杂交样品，或用一定量的修饰的报告分子或其它合适的标记物，优选可作为次级荧光染料的标记物标记，以检测标记的样品与低拷贝探针偶联微球的杂交。优选的报告分子是藻红素标记的链霉亲和素，或抗-地高辛荧光抗体，分别检测和结合优选的靶序列标记、生物素和地高辛。在杂交反应所用的相同温度下培育杂交的和标记的/染色的样品足够时间使报告分子检测和结合标记的靶序列。然后洗涤样品除去残余染料。离心样品除去上清液，用一定量的杂交缓冲液重悬着色的杂交微球。流式细胞计数分析前，可按流式细胞计数仪操作说明书稀释杂交样品。每次反应每组优选分析约2，000-6，000个微球，更优选约4,500-5,500个微球，最优选每次反应每组分析约5,000个微球。然而，分析的样品量取决于用于的具体流式细胞计数仪。该领域技术人员无须过多实验即可修改确定最佳的流式细胞计数仪校正和操作设置范围，从而测定具体的杂交试验。荧光珠标准品已广泛使用，可用其校正流式细胞计数仪不同荧光检测通道的强度。也可用参比荧光标准品依据分子的等价可溶性荧光染料(MESF)单位校正的表面标记校正此仪器。优选优化光电倍增管(PMT)的电压设置和前向扫描、侧向扫描、流速、和各检测通道的域值以最大程度减少二种不同探针与一份基因型正常病人样品杂交所产生的荧光强度差异。易出现非优化的电压参数导致宽大的荧光峰或非线性数据，而优化的参数当以侧向扫描图观察时偏向导致具有不同光谱地址的微球紧密聚集。这些设置优选依据荧光测定的数学平均值、几何平均值、中位数和峰频道而确定。反应物经5(TC变性3分钟和杂交过夜。洗涤杂交微球用报告分子链霉亲和素藻红素(SPE;分子探针公司(MolecularProbes))和/或抗-地高辛-抗体异硫氰酸荧光黄(FITC，分子探针公司)染色。用流式细胞仪(FACSCalibur，加州桑泽斯的BD公司)分析杂交样品，采用双激光检测，用细胞计数仪共同测定微球的光谱地址和与样品序列结合产生的次级荧光染料以鉴定和定量杂交的探针。通过量化结合样品产生的次级荧光染料的荧光强度，测定每种样品序列与其互补的探针偶联微球杂交产生的信号。选择相容的微球光谱地址以最大程度减少与未结合的次级荧光染料(报告分子)的发射波长相重叠。这可通过与用相同的未偶联和未杂交的微球获得的结果作比较而得到证实。也可采用保留在含有除样品核酸外所有成分的反应管中的阴性对照，测定检测通道次级荧光染料的背景荧光。优选在运作之间用蒸馏水冲洗此系统去除残留的微球。每次反应分析约5,000个微球。用SPE和/或FITC平均荧光强度(分别在通道FL2和/或FL1中检测)定量杂交，此强度对应于探针所结合的基因组靶DNA(FL2)和C。t-1DNA(FL1)的量。用偶联探针和含有相同序列的标记靶DNA进行的校正研究证明，平均荧光强度的变化与杂交的靶DNA量呈线性相关。每次杂交实验用含有除耙DNA以外的所有反应组分的阴性对照分别测定FL1和FL2通道的背景荧光。如前所述设置优化的PMT电压；用厂商提供的CellQuest软件13'2()收集数据进行分析。通过选择能最大程度减少二种不同探针与一份基因型正常病人样品杂交所产生的荧光强度差异的光电倍增管电压设置，确定最优的光电倍增管电压设置。这些设置依据说明书(CellQuest;BD公司)的荧光测定的数学平均值、几何平均值、中位数和峰频道而确定。FACSCalibur仪的典型光电倍增管电压设置是FSC(前向扫描)二EOO(无信号放大)、SSC(侧向扫描"344V、FL1=727V、FL2=640V和FL4=500V。设置的FSC、FL1、FL2和FL3的域值是默认值52V。选择此FSC域值作为主要参数的52V值，设置的SSC次级参数为125V值。对所用的下部护套管液体设置的流速是FACsFlow(BD公司)。在运作之间用2-5ml蒸馏水冲洗此系统去除残留的微球。用CellQuest软件收集数据和分析。也用WinMDI2.8流式细胞仪软件包(WinMDI;J.Trotter.加州索克仪器公司(SalkInstitute,LaJolla，California》进行数据分析。^微伊效游"A^#虔用250ul0.1XSSC1%SDS洗涤等份(35ul)与ABLla(表1:反应9和20)杂交的基因组DNA，离心(13,000xg)沉淀，重复二次。95°。加热变性杂交的基因组序列5分钟，然后4"C离心3分钟快速冷却。回收的序列用作QPCR和与微球偶联的ABLlAluMERl(表1:反应21和22)杂交的靶序列。全慮复丝"A^从根据重复性序列家族选择的基因组区域合成制备了重复性DNA，因为这些重复序列各自在C。t-1制备过程中均富含。然而，可采用包含毗邻中拷贝至高拷贝数重复元件的sc区的代表性基因组区。为了证明基因组探针中的这种重复元件可能在超过所需目标区段的部位受到抑制，制备了包含位于染色体4p中ClQTNF7基因上游二个400bpsc区(chr4:15139704-15141581)之间中央的l.lkbLTR元件的探针(图4A)。然后合成了用于封闭此重复元件的位于ABLla探针中的重复序列；染色体9的ABLla含有280bp的AluJo重复序列、300bp的AluSx重复序列和830bp的L2元件区段(图4C)。也采用染色体17q上位于HOXB15'端含有306bpAluSx重复序列和154bpLl截短序列(chrl7:43963396-3965681)的2286bp区段作为探针9图4B)。开发了PCR扩增各重复序列和靶产物(表2:HOXBlb和ClQTNF7)的引物，扩增了直接侧接这些重复元件(表2:HOXBlAluLl和C1QTNF7LTR)的独特序列。用Pfx(因维曲根公司(Invitrogen》扩增基因组DNA(帕玛咖公司(Promega))。然后电泳扩增产物用微离心柱离心抽提。如前人所述通过改进的碳二亚胺反应使探针偶联于微球13'2()。在存在和缺乏C。t-lDNA时，此杂交反应(表l:反应23-33)均提高了合成的重复性PCR产物与同源性PCE产物和/或基因组DNA杂交的效力。使反应物杂交，洗涤，用SPE染色，然后用流式细胞计数分析。用Chromo4定量PCR系统(加州赫尔克里斯的BR实验室公司(Bio-RadLaboratories,Hercules,California))进行QPCR和数据分析。引物和扩增区段用BLAT"(见英特网genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlast)和BLAST(表2)验证独特的基因组表示。BLAT是一种计算机软件工具，包含序列比对算法，和鉴定人26基因组中可能与査询序列同源的区域的脊椎动物序列索引。BLAT是与BLAST类似的比对工具，只是结构上有所不同，因为BLAT工作时能将整个基因组的索引保存在存贮器中，而BLAST的靶数据库包括GenBank收集的序歹ij。每50微升反应液含有各引物0.5PM、50ngC。t-1模板或阳性对照人基因组DNA(帕玛咖公司)、25n12xQTSybrG主混合物(恰根公司)。用DNA酶在基因组DNA上形成缺口以产生50bp-300bp的片段，阴性对照含有除DNA以外的所有反应组分。热循环条件是95°C15分钟后，45轮扩增(94'C15秒、61°C30秒(获取数据)、72°C30秒)然后72r5秒，温度递降每秒20'C产生解链曲线。利用校正曲线测定采用不同量的正常基因组模板(lng、2ng、4ng、lOng和20ng)回收的基因组模板中输入的靶序列量，和测定各反应的Ct値。用QPCR测定从ABLla杂交产物(lul;表1:反应21和22)回收的序列组成。引物组采用几个从ABL1区扩增的不一定与此探针同源的序列，包括ABLla和ABLlc(chr9:130709665-130711469)、ABLld(chr9:130699324-130700596)以及其它未连接的基因组区如DNJA3Alu(chrl6:4421138-4421200)的特异性引物，它含有位于DA^/基因5'端的Alu重复序列、7^《73和T/OiB7(表2)。如上所述进行反应。每组引物运作阳性对照(人基因组DNA)以提供原先加入QMH反应中的基因组DNA的初始量(50ng)。在存在和缺乏C。t-1DNA时从测试样品中初始模板量确定从QMH回收的靶序列摩尔比(从针对标准校正曲线的交互参考Ct信内推)。表2.此项研究所用的探针和引物<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>原位荧光杂交(FISH)本发明方法也可用于原位荧光杂交(FISH)实验。FISH探针的靶区域可以是整条染色体或其一部分。探针合成后进行标记15'16，FISH杂交探针可与合成的重复性DNA—起培育代替Cot-lDNA进行重复抑制，然后与固定在载玻片上的染色体杂交。采用Cot-lDNA的比较性实验用或不用探针预杂交常呈现不同的探针杂交信号14。与不用Cot-lDNA预杂交的FISH实验相比，不用Cot-lDNA探针的FISH预杂交显示染色体上探针信号微弱14。此微弱信号来源于探针中的单拷贝序列与Cot-lDNA中的单拷贝序列杂交。这样就减少了与染色体中靶序列杂交所需的探针用量因此信号较弱。然而作为结果，不用Cot-lDNA预杂交的实验虽然探针信号强度明亮，但通常呈现更多的假阳性探针杂交，而导致背景荧光水平较高使分析更加费力。通过探针与不包含店拷贝序列的合成的纯重复性DNA组分预杂交，能有效抑制探针中的任何重复序列，留下的单拷贝序列可用于与染色体杂交。因此不会损伤染色体上的探针信号强度并且有效地最大程度地减少了背景(假阳性杂交信号)。结果与C。"ZW4游定量徵承效使FISH-验证的混合的sc和重复序列的探针、包含多样性AluJo/Sx/L2重复序列(chr9:130623551-130625854)的ABLl基因IVSlb5，端的ABLla与生物素标记的基因组DNA杂交13'2、虽然在复制ABLla与生物素标记的基因组DNA杂交中，预计购得的C。t-1DNA能抑制重复序列的杂交，但当C。t-1用复制ABLla与切口平移的基因组DNA杂交时，标记的基因组耙部分的平均荧光强度一致地和显著地增强了2.2倍(表1:反应1和2)。衍生自染色体17基因的sc探针PMP22(Chrl7:15073475-15073576)和TEKT3(Chr17:15149108-15149206)在存在C。t-lDNA时显示较小但可重复的1.08禾P1.14倍增长(表l:反应l-6)。这些实验提示C。t-l的效力与围绕这些sc间区的重复序列组成相关。来自HOXB1的sc探针(Chrl7:43964237-43964330)—致性显示了加入C。t-lDNA导致杂交强度的小降低(表1:反应7-12)，测试的基因组样品杂交强度降低了0.84-0.92倍。HOXB1间区特点是无重复序列(UCSC基因组浏览器(UCSCGenomeBrowser),2004-5)。环绕ABLla的区域含有丰富的高密度保守和散布的SINE(AluJo，AluSx)和LINE(L2)元件。TEKT3和PMP22间区含有较短较不丰富和更多样性种类的重复元件(MIR、MER和L2)。通过比较生物素标记的耙DNA(在FL2通道中用链霉亲和素藻红素[SPE]检测)、生物素标记的阴性靶对照(Puc19质粒)各与地高辛标记的C。t-1DNA(在FL1通道中用FITC-偶联的抗-地高辛抗体)杂交来测定加入C。t-1DNA改变靶DNA与ABLla探针杂交的程度。存在C。t-1导致ABLla与生物素标记的同源基因组耙序列杂交产生的荧光平均强度提高了2倍，然而，结合的标记C。t-1序列量大大超过抑制ABLla中重复序列所需，与其中删除了C。t-1序列的反应相比，强度提高了50倍(表1:反应13和14)。C。t-1结合看来有特异性，因为不论C。t-1是否存在ABLla与pUC19杂交显示有背景信号水平(〈101)(表1:反应15)。这些发现提示C。t-l中的同源序列直接与ABLla探针结合。因为推测ABLla序列只代表了C。t-1靶部分的一小部分，它单独不能解释所见的杂交强度提高。为确定信号提高是否与C。t-1DNA的量有关，在固定量(50ng)的生物素标记的基因组耙DNA中加入不同量的地高辛标记的C。t-1DNA与ABLlb杂交，ABLlb是混合的sc和重复性探针，含有二种多样性的AluJo重复序列(chr9:130627353-130628735)。将反应中的C。t-1量从50ng倍增到100ng探针与C。t-1的杂交提高了1.8倍，与同源序列的杂交提高了1.3(表1:反应16和17)。类似地，150ng标记的C。t-1DNA与ABLla杂交比50ngC。t-l提高了3倍，与靶DNA杂交提高了1.5倍(表1:反应17和18)。虽然加入C。t-1DNA稀释了同源的生物素化靶DNA,但仍提高了2-4倍，对应的杂交强度出乎意料地提高了1.5倍。C。t-1浓度与杂交强度的相关性提示此反应成分促进了含有除探针和所需的基因组耙DNA以外的其它序列的双链体形成。为测定结合探针的C。t-1衍生序列的组成，变性这些产物，与ABLla偶联微球杂交后回收(表l:反应19和20)。将这些产物用作耙序列，随后与非重叠sc和重复性微球偶联探针ABLlAluMERl杂交，ABLlAluMERl含Alu元件(AluJb、AluSq、Charlie1禾口AluSx)和位于距ABLla2.3kb着丝点的MER1序列。鉴于ABLlAluMERl在基因组中的此位置，预计它不存在于切口平移回收的基因组产物中。然而，发现标记的C。t-1组分是回收ABLlAluMERl序列的来源，依据是FL1通道中平均荧光强度提高了11倍(表1:反应21和22).C。t-1中毗邻杂交的ABLla的重复序列看来通过形成重复和单拷贝序列元件的网络而聚集在一起与基因组序列杂交(图3:分图1和2)。通过定量PCR(QPCR)分析回收的杂交产物中存在的序列评价了这种可能性。微量尸C及藩效柳用QPCR测定了C。t-1中与我们探针同源的sc序列成分。表2鉴定了此项研究所用的探针和引物。表3显示了此项分析的结果。表3.回收的杂交耙DNA量化<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>扩增C。t-1DNA和对照基因组DNA的500ng样品中ABLla的100bpsc区段(表2)。根据它们各自的Ct信，厂商I和R的C。t-1组分显示与正常基因组成相比，杂交的ABLla量分别提高了14和2倍(或提高了2.5和1.7摩尔)(表1:反应l-3)。杂交后回收ABLla序列测定与此探针杂交的基因组和C。t-1衍生序列的组成(表1:反应21和22)。在含耙和C。t-1DNA二者的杂交样品中ABLla序列提高了128倍(表3:反应13和14)。从杂交液回收的与ABLlAluMERl相同序列包含的C。t-1比缺乏C。t-1的一式二份反应中的高139倍(表3:反应15和16)。在回收的杂交产物中还检测到与ABLlAluMERl密切相关的重复序列。在杂交反应物中测到的具有92%相似性的Alu元件DNJA3Alu(5，连接于DNJA3基因；chrl6:4421138-4421200)含有C。t-1，但在缺乏C。t-1的反应物中没有，表明C。t-1是此污染序列的来源(表3:反应17和18)。与ABLla探针杂交的回收产物中没检测到其它sc基因组区段(即来自CMTlA、H0XB1和其它ABL1区域(ABLlc和ABLld))。与连接ABL1的RRP4-1.6a序列杂交的C。t-1衍生序列(表2)含有同源sc和重复序列，尽管此单拷贝探针已经FISH验证14。基因组中中等和高度丰富的MIR、L2和Ll重复元件围绕此序列。QPCR证明相对于从sc间区内衍生的短RRP4-1.6a产物，从上游(5，)和下游(3，)扩增子回收的重复序列浓度较高(表3:反应4-12)。Cr值的比较表明，拓宽基因组重复序列(RRP4-1.6a5'和RRP4-1.6a3，)的厂商R的sc序列是基因组DNA中唯一比C。t-1组分丰富6.8倍的序列(厂商I的也类似)。如预计的那样，基因组中内部scRRP4-1.6a序列比C。t-1丰富得多(24倍)，但在C。t-l中仍可检测到(表3:反应7-9)。C。t-1制品中SINE和LINE丰富导致杂交时连接lc或sc序列加速，有可能与标记的基因组DNA中的偶联探针或真正的sc耙序列退火相连。微始成舰复腦在基因组的三个不同基因座通过替代专门从与sc序列毗邻的重复元件制备的过量纯化的DNA，逆转了C。t-lDNA的杂交效果(图4)。合成的1.9kb扩增产物含有LTR-样重复元件和染色体4中C1QTNF7上游的单拷贝序列。除纯化的合成的LTR-样元件外，C1QTNF7LTR对此产品自身与偶联微球的杂交没有作用，而加入C。t-lDNA提高了平均荧光强度1.2倍(表l:反应23-25)。在存在和缺乏C。t-1DNA时用C1QTNF7LTR阻断重复序列与切口平移的基因组DNA杂交获得了类似结果(表1:反应26-28)。用含有这些序列的合成的PCR产物HOXBlAluLl抑制了AluSx与染色体17的H0XB1基因座(HOXBlb)上游约2.3kb区域中的Ll重复序列杂交。在存在HOXBlAluLl时HOXBlb的PCR产物与对应的微球偶联探针杂交有效封闭了扩增靶DNA中的重复序列，降低了杂交产生的荧光强度0.3倍，推测是由于靶DNA长度减少(表1:反应32和33)。在比较基因组与偶联ABLla探针的微球杂交中，在此靶区域中加入合成的Alu和L2元件，也有效地抑制了重复序列的杂交(表l:反应29-31)。C。"微厚麟妙游縛在已发表的杂交研究中对于抑制重复序列的杂交几乎都包括c。t-i，提出的问题是此试剂如何影响表达和/或基因组拷贝数的定量测定？在采用C。t-l的研究中，评价了一组复制的靶样品与克隆探针阵列的杂交的双标记杂交荧光强度的变异(数据来源于GEO数据库http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo)。分析用于微球杂交试验的基因的cDNA探针试验结果(包括ABLla、HOXB1和TEKT3)，然后通过它们的重复序列组成，鉴别位于基因组环境中的几个基因序列的杂交模式，即重复序列群集的密度(表4下部)或稀疏度(表4上部)。表4不同基因复制微阵列研究中的变异<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>与衍生自含有较少但多态性更大重复序列的因组区域的探针相比，重复序列致密的基因组间区中的序列复制Cy3/Cy5的强度比率变异更显著。例如，发现采用相同的测试样品在不同的复制实验中ABL1显示了提高和降低的表达(如数据库记录GDS751/20213显示样品方差为0.3，p=0.18;表4)，与我们用偶联-ABLla的微球在杂交中观察到的扭曲相似。相反，采用相同的测试样品在复制表达阵列研究中H0XB1的荧光强度对数比率显示几乎没有差异(GDS223/31555，样品方差=0.001，pO.OOOl)，与此基因座我们的结果相符。这提示，C。t-1中的单拷贝序列与探针杂交，使形成的混合sc与重复序列网络聚集而捕获靶cDNA中的标记的重复序列。在微阵列研究中，C。t-1就如此以类似于QMH中所见方式通过形成复杂的杂交网络而扭曲了富集的克隆探针与散布的重复序列的杂交。讨论上述分析证明，C。t-1DNA中存在的非重复序列能显著改变用同源探针检测杂交反应时标记的基因组靶DNA的量。C。t-1并非抑制交叉杂交，而是使与含重复序列探针的杂交提高了3倍多。此结果提示，未标记的C。t-1DNA序列能桥连序列特异性探针中的lc和重复序列与互补的耙序列。重复序列与C。t-1组分中的同源lc序列连接可能使基因组靶DNA中标记的重复序列随后杂交而聚集。将C。t-1DNA加入到与标记的基因组模板杂交的探针中可催化形成与该探针和基因组某处同源的异质双链体网络(图3，实施例2)。将C。t-lDNA通过标记的lc基因组靶DNA加到连接的重复元件上(图3,实施例4)促进了含有lc和重复序列(图3，实施例3)的"偏爱(partial)"双链体的形成。标记的重复序列与lc基因组靶DNA连接也可能改变杂交强度，但程度与C。t-1不同，这是由于C。t-l同时富含lc和散布的重复序列。随着微阵列技术的进展，许多研究人员关注上述实验的可重复性4—5。也许，交叉杂交有关差异的最大来源来自重复序列7。然而，许多学者认为解决此差异的方法是用C。t-lDNA封闭重复元件，然后使cDNA与阵列杂交6—7。Dong等人19发现"某些无重复序列的区域与能与人C。t-1DNA组分杂交的重复序列充分同源"，提出是它们歪曲了微阵列结果的杂交信号强度。C。t-1通过促进探针与无关的标记基因组耙DNA之间重复性序列桥连的形成，影响了杂交试验的重复性，C。t-1所含的1C和SC序列能与标记的靶DNA竞争探针(结合)位点。有理由进行更广泛的大基因组分析以鉴定更可能对此种系统误差来源敏感的其它基因组区域。C。t-1DNA中的重复组分根据合理的动力学而非序列的组成制备。由于lc序列中不含重复序列，这种序列明确的合成的DNA能更有效阻断探针中重复序列与共生同源基因组耙重复DNA的杂交。合成的基因座特异性试剂的另一优点是在C。t-lDNA中不能充分提呈重复(序列)家族，或由于重复序列的多态性而不能提呈，可合成这些序列提供更精确更综合性的无sc序列的基因组重复序列库。然而，基于此产品本身的成本和逻辑挑战，应防止C。t-1被合成的广泛代表了整个基因组中所有已知重复元件的重复性DNA试剂取代。可进一步加工C。t-1以限制其所含的sc序列的量。将含有C。t-l中大部分双链DNA的重复序列重新退火连接于本身含单拷贝无重叠重复组分的单链序列。用专性持续推进的核酸外切酶如绿豆核酸酶，或A核酸内切酶处理这些混合的双链体和单链结构，将修剪从双链体DNA上凸出的单链序列。这些酶应不会在错配核苷酸处切割，错配核苷酸常见于同一重复序列家族的相关成员，其中单链缺口间隔序列被配对的碱基序列间隔开或位于双链体的切口处。此方法将消化单链重复序列和单拷贝间区。这将特别影响到通常显示基因组5'(或3')端截断的例如在Ll逆转座子[11]中所见的重复元件的提呈。可加入相应的合成的DNA试剂来缓解这些序列的丢失。应注意C。t-1DNA的这种处理不能完全消除所有的sc序列，因为sc序列可能重退火连接，然而形成这类双链体是反应动力学不喜爱的。鉴于以上所述，用部分或完全合成的由明确的重复序列组成的阻断试剂替代C。t-1DNA应能改善微阵列和基因组杂交比较阵列表达的可重复性。这应最终导致这些应用广泛的方法实验条件的标准化。参考文献l.Oostlander.A.，Mcijer.G.和Ylstra，B{2004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与所述鉴定的重复序列杂交的充分同源性序列，所述抑制性核酸基本上含有重复元件且基本上没有低拷贝元件；使所述抑制性核酸与染色体靶核酸反应，从而导致所述抑制性核酸中的重复元件与所述染色体靶序列中的同源重复元件杂交；使所述耙探针与所述染色体靶序列反应从而导致所述靶探针中的低拷贝元件与所述染色体靶序列中的同源低拷贝元件杂交；使所述抑制性核酸与含有所述染色体靶序列的染色体参比序列反应从而导致所述抑制性核酸中的重复元件与所述染色体参比序列中的同源重复元件杂交；使所述参比探针与所述染色体参比序列反应从而导致所述参比探针与所述染色体参比序列杂交；通过所述第一光谱地址检测杂交的靶探针；通过所述第二光谱地址检测杂交的参比探针；和比较检测到的杂交靶探针的反应与检测到的杂交参比探针的反应来量化检测到的耙探针。26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述抑制性DNA包含重复元件，所述重复元件与所述靶中低拷贝元件相毗邻的基因组重复元件相对应。27.—种抑制核酸探针中存在的重复元件与靶核酸中的同源重复元件之间的非特异性交叉杂交的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤使抑制性核酸与含有一个或多个低拷贝元件的靶核酸中的同源重复元件杂交，合成的所述抑制性核酸含有选出的与含有毗邻中至高拷贝数重复元件的单拷贝区域的一个或多个代表性基因组区域相对应的多个重复元件且基本上不含低拷贝元件，再使所述靶核酸与含有与所述靶中的低拷贝元件同源的低拷贝元件的一个或多个探针杂交，所述探针基本上不含重复序列。28.—种抑制抑制性核酸中存在的低拷贝元件与核酸探针中或靶核酸中的同源低拷贝元件之间的非特异性交叉杂交的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤鉴定所述靶核酸中和附近的重复性和低拷贝元件，通过从所述靶核酸中选择重复序列将其包含在所述制性核酸中同时在所述合成中基本上避免包含低拷贝序列来合成抑制性核酸序列，和使所述合成的抑制性核酸与所述靶核酸反应，而使各同源性抑制核酸与耙核酸元件互相杂交。29.—种利用Cot-lDNA来提高试验精确度和重复性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤选择或合成含有多个重复元件但基本上没有低拷贝序列的抑制性核酸，和用所述选择的或合成的抑制性核酸替代Cot-lDNA。30.—种抑制基因组靶核酸与核酸探针额外杂交的方法，其^P征在于，所述方法包括以下步骤选择基因组中对应于感兴趣序列的一条或多条序列来制备用于杂交的基因组靶核酸；鉴定所述感兴趣靶序列中的低拷贝序列；合成与所述鉴定到的低拷贝靶序列同源的低拷贝探针，所述低拷贝探针基本上没有重复序列；鉴定毗邻于所述靶低拷贝序列的重复序列；合成与所述耙重复序列同源的抑制性DNA，该抑制性DNA基本上含有重复元件；使所述靶核酸与所述抑制性DNA反应从而该抑制性DNA中的所述重复元件与靶核酸中的同源重复元件杂交；使靶核酸与所述低拷贝探针反应而使所述探针中的低拷贝元件与所述靶核酸中的同源低拷贝元件杂交；和检测所述低拷贝探针以量化探针与靶的杂交，从而确定所述靶核酸中替代的低拷贝元件。全文摘要本发明提供了抑制核酸探针中存在的重复元件与靶核酸中对应的重复元件之间非特异性交叉杂交的新型方法，该方法所用合成的DNA含有多个重复元件，同时能避免产生低拷贝的单拷贝序列。文档编号C12Q1/68GK101405407SQ200680049039公开日2009年4月8日申请日期2006年11月17日优先权日2005年11月18日发明者H·L·纽科克申请人:儿童慈善医院