分离的肝脏干细胞的制作方法

专利名称：分离的肝脏干细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自成体肝脏的分离的肝脏祖细胞或干细胞，及其在医 学、肝病学、肝脏代谢出生缺陷、移植、传染性疾病、肝脏衰竭中的用 途。本发明还涉及分离这些细胞的方法、其培养物、分化前后表征、及 其在移植、人类疾病的动物模型、人造器官装置、毒理学和药理学中的 用途。
背景技术：
肝脏是重要器官，其发挥很多重要的功能，如葡萄糖的体内平衡、
异型生物质的(xenobiotic)脱毒或大分子合成。因此，多种肝脏功能 之一受损能够对健康产生显著影响。根据世界卫生组织(WHO),全球 急或慢性肝病的发病率使这些疾病成为第五至第九位的致死原因。目前 为止，对晚期肝脏疾病的根治方法只有肝脏移植术。经历外科肝脏移植 的患者的结局很好，95%以上得以康复。然而，即使有包括肝脏分割和 活体肝移植供体在内的新型外科技术，器官的日益紧缺使得等待治疗名 单中的死亡率不断攀升。因此，在移植医学研究中的重要目标就是证明 肝脏细胞(liver cell)在肝脏再生和肝病治疗中的潜在用途。
肝脏细胞移植(liver cell transplantation, LCT )是一种新兴方法， 涉及在受体肝门系统中输注肝脏细胞悬液。作为移植结果其目的在于恢 复受体肝脏功能以及重建(repopulation )患病的肝实质(liver parenchymal LCT首先被证实在动物模型中有效，其中已经表明同源 肝细胞(hepatocyte)能够长期存活并纠正各种酶缺陷(综述参见Najimi 和Sokal. 2005. Minerva Pediatr 57(5): 243-57 )。
人类当中，早期研究专门用于治疗急性肝脏衰竭。这些研究促使临 床工作者将LCT扩展用于其他适应症，目前为止，全球已经报道有各 种缺陷的至少30个案例(Strom等人1997. Transplant Proc 29(4): 2103-6)。在代谢疾病的具体领域中，十三个案例中l艮告了肝脏细胞用于治疗 I型Crigler-Najjar综合征、尿素循环缺陷或罕见疾病如嬰儿Refsum病 的用途。这些研究证明了肝细胞在肝实质中的植入以及随后在移植后长
达18月患者状况的改善。
然而，由于用于移植的成熟人类肝脏细胞仍然有限，实际上或多或 少和全肝可用性一样受限，研究还意图从其他来源获得可移植的细胞， 如来自胚胎或成体来源的祖细胞和干细胞，这些细胞例如可在体外扩
增，并且能够尤其是在移植后体内分化成有功能的成熟肝细胞。因此， 迫切需要开发出新的在治疗肝脏相关疾病相关的各种疾病或病况中有 用的方法，尤其是考虑到目前大多数这些疾病的可用治疗不足时。
历史上，由于观察到胚胎干(ES)细胞无限克隆分裂以及多能分化 成整个组织的子细胞(daughter cell)的能力，其曾被认为仅参与器官 发生。另一方面，成体器官中的再生过程典型情况下归因于成体祖细胞。 然而，考虑到在成体器官中发现了表达胚胎标志物的干细胞，该理论已 被修正。因此，现在描述干细胞和祖细胞特征时不仅基于发育过程(胚 胎对成体)还基于特异性细胞标志物的存在。实际上，细胞标志物如膜 蛋白或转录因子的表达可随着分化途径有很大变化，它们反映了各种刺 激(如环境刺激)和细胞需求。通常在分化过程中，观察到干细胞将逐 渐停止展示指示其多能性的标志物如Oct-4，而表达有助于后续阶段的 标志物如特定镨系的标志物。作为一个非限定性的实例，Oct-4随着成 熟而逐渐丢失，另一方面进入内胚层镨系的细胞开始表达甲胎蛋白。
就通过细胞移植来进行肝脏再生而言，可以考虑多种可能的来源细 胞类型。例如由于ES细胞的多能性，预期其能够再生任何器官。实际 上，本领域中这条路已经得到广泛探索。然而，当ES细胞引入子宫(in utero)以外的任何其他组织中时ES细胞倾向于引起肿瘤生长。因此， 其体内应用由于致癌风险仍然受到限制。即便之前ES细胞在体外分化 成功，用于人类接种都不够安全。
更加安全的替代方式是使用成体祖细胞，不像ES细胞，其倾向于 表现出受限的克隆分裂能力以及分化产生更加有P艮命运的子细胞。肝脏 中，已经描述过成体祖细胞如卵圆细胞(胆管细胞和肝细胞前体)或小 肝细胞样细胞。然而，其在正常成体器官中的稀少使得其医学用途变得 困难。
因此，具有降低或没有偏离向致癌风险并显示出克隆分裂能力的成 体干细胞将代表着细胞移植来源的重大进步。多种类型的成体干细胞目
前在肝脏细胞移植研究中得以评价。例如，由于具有从另一个镨系转分 化成更成熟细胞的能力，正在对来自外周或脐带血的间充质干细胞
(mesenchymal stem cell, MSC )进行研究。并且，也在肝脏再生潜能 方面对来自骨髓的造血干细胞进行研究。
成体干细胞的体外表征仍然困难，本领域目前可以接受的是这种表 征可以优先包括检测(i)胚胎起源或镨系(尤其是中胚层、内胚层、 外胚层或造血干细胞)的标志物，(ii)反映分化水平的标志物的表达， 因而在一定程度上预示了可能的不同后代，(iii)分化之后的体外或体 内命运。因此，表征和区分从正常肝脏获得的成体干细胞可以方便地包 括评价是否存在以下标志物(i)反映该器官复杂胚胎起源的标志物， (ii)分化标志物(如存在白蛋白)以及(iii)至少一个指示干细胞命 运的标志物。
根据目前的知识，肝脏主要源自内胚层，肝细胞是内胚层镨系 (lineage)的一部分。然而，肝细胞的形成还涉及内胚层上皮和心原性 中胚层之间的相互作用。此外，在胎儿发育中，造血细胞生成发生在肝 脏中。考虑到发育中的这种相互影响，在提及成体肝脏干细胞中存在的 标志物时需要有开放性思维，因为内胚层、中胚层和/或造血系的标志 物都可预期。
当评估分化水平和细胞类型归属时，可以评价不同细胞标志物，正 如本vj^开中随后进行的。例如，在细胞分化过程中有些标志物减少或消
失，另一些标志物可以增加或出现，还有一些可以一直维持到特化和功 能性细胞。根据非限制性实例，器官发生期间，即胎儿期间，认为肝母 细胞(hepatoblast)是形成实质(尤其是肝细胞和胆细胞)的共同祖细 胞，其表达细胞角蛋白-7 (cytokeratin-7; CK-7)以及CK-19、白蛋白 和曱胎蛋白。成体肝脏中，肝细胞和胆细胞的已知共同祖细胞是卵圆细 胞(ovalcell)，其表达CK-19、白蛋白和曱胎蛋白。分化成胆细胞后， CK-19和白蛋白继续表达，而CK-7的表达则趋于停止(认为是更不成 熟细胞的一个特征)。另一方面，肝细胞维持甲胎蛋白和白蛋白的表达， 但是不表达上述CK。仍然是这个实例，由此可见干细胞的表征是复杂 的，但是可以优先使用标志物评价来指示细胞类型或特性。
根据本发明人的了解，以前的研究描述了从正常成体肝脏中分离祖
细胞，所述细胞展现了不止一种细胞命运。尚没有描述过能够在体外增 殖并在体内分化成肝细胞(并且优选仅具有肝细胞命运)的成体肝脏干
细胞。此外，以前的研究使用复杂的技术，如FACS、含钾介质或特定 密度梯度来分离肝脏干细胞。
因此，本发明的一个目标就是提供具有改进特性的新的成体肝脏来 源的祖细胞或干细胞，并且尤其可用于例如肝脏细胞移植。本发明还提 供分离所述细胞的简单方法。

发明内容
本发明提供从正常肝组织获得的成体肝脏来源的祖细胞或干细胞、 包含这种祖细胞或千细胞的细胞系或细胞群。分离这些细胞的方法、其 培养物、分化前后表征，及其在移植、人类疾病动物模型、毒理学和药 理学中的用途也在本发明范围之内。
一方面，本发明实现了一种新型的分离的祖细胞或干细胞(脊推动 物，优选哺乳动物，更优选人类细胞)，其源自成体肝脏，特征在于共 表达(即对以下呈阳性)肝细胞标志物白蛋白(ALB)以及可能地一种 或更多种其他肝脏或肝细胞标志物，优选CD29、甲胎蛋白(AFP)、 a-l 抗胰蛋白酶和/或MRP2转运蛋白中的一种、多于一种或全部的标志物， 以及至少一种间充质标志物，尤其是标志物CD卯、CD44、 CD73、波 形蛋白(vimentin)和a-平滑肌肌动蛋白(ASMA)中的一种、多于一 种如2、 3或4种或全部。所述成体肝脏祖细胞或干细胞还可以表达如 下指示肝细胞样特征或功能的分子中的一种、多于一种或全部G6P、 CYP1B1、 CYP3A4、 HNF-4、 TDO、 TAT、 GS、 GGT、 CK8、 EAAT2。 所述成体肝脏祖细胞或干细胞的特征可以还在于以下的一种、多于一种 或所有标志物至少造血标志物CD45和CD34呈阴性，也可以一个或 更多其他造血标志物，例如，CD105、 HLA-DR呈阴性，胆管细胞上皮 标志物细胞角蛋白-19 (CK-19)以及可以更多上皮标志物呈阴性；至 少未分化的干细胞标志物CD117和Oct-4呈阴性，以及可以一种或多于 一种胚胎干细胞标志物；AFP的低水平表达。优选，所述成体肝脏祖细 胞或干细胞具有间充质样形态，尤其包括单层生长、扁平形状、明显的 细胞质和/或有一个或两个核仁的卵原细胞核中的一种、多于一种或所 有形态。
在一个实施方案中，本发明具体地提供分离的来自成体肝脏的千细
胞，其呈现CD90、 CD29和CD44阳性、白蛋白阳性、波形蛋白阳性以 及a-平滑肌肌动蛋白阳性。在一个实施方案中，分离的干细胞也呈现 CK-19阴性、CD45阴性、CD34阴性以及CD117阴性。本发明还提供 包含具有至少三个如下特征的祖细胞间充质干细胞的细胞群抗体可检 测的白蛋白表达；抗体可检测的波形蛋白的表达；抗体可检测的a-平滑 肌肌动蛋白表达；CK-19缺失、CD45缺失、CD45标志物缺失、CD34 标志物缺失、CD117标志物缺失、存在CD90标志物、存在CD29标志 物、或存在CD44标志物。优选细胞具有所有上述特征。在一个优选实 施方案中，干细胞是人肝脏干细胞。
在一个实施方案中，源于成体肝脏的分离的干细胞呈现CD90、 CD73、 CD29和CD44阳性以及白蛋白阳性、波形蛋白阳性以及a-平滑 肌肌动蛋白阳性。
本发明还提供一种获得包含所述祖细胞或干细胞的分离的祖细胞 或干细胞或细胞群的方法，该方法包括(a)解离成体肝脏或其部分以 便从所述成体肝脏或其部分形成原代细胞群，(b)将原代细胞群铺板到 基底上面，使细胞附着其上，以及(c)从原代细胞群培养细胞，细胞 附着于所述基底上至少7天，优选至少10天，至少有13天，或至少15 天。
本发明还提供一种获得分离的肝脏干细胞或其细胞群的方法，其中 根据本发明方法包括以下步骤从成体肝脏培养细胞，从中分离肝细胞， 铺板肝细胞以及培养所述肝细胞至少7天，优选至少10天，至少13天， 或至少15天。
另一方面，本发明提供使用本发明的方法可获得的或直接获得的分 离的成体肝脏祖细胞或干细胞、包含所述成体肝脏祖细胞或干细胞的细 胞系和/或细胞群。
另一方面，本发明人根据本发明建立了特定的成体人肝脏祖细胞或 干细胞细胞群(细胞系)，并且根据布达佩斯条约(Budapest Treaty) 于2006年2月20日将所述分离的细胞系保藏于比利时微生物合作保藏 中心 (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMBP)),保藏号为LMBP6452CB (由国际保藏机构授予；鉴
定参考由保藏人给出ADHLSC)。因此，本发明涉及保藏于BCCM保
藏号为LMBP6452CB (本文中称为"LMBP6452CB"细胞系)的分离 的细胞、细胞系和细胞群，其亚系包括克隆亚系，还涉及其后代，其中 包括已分化后代，尤其是肝细胞或由其制备的肝细胞样细胞，还涉及其 遗传修饰的衍生物。
本发明还提供包含根据本发明分离的肝脏祖细胞或干细胞或其细 胞群的组合物。优选地，肝细胞是人类肝细胞，或哺乳动物的肝细胞。
根据本发明的祖细胞或干细胞(特别要说的是，包括但不限于LMBP 6452CB系)具有几个重要的优势。例如，不像胚胎起源的细胞，该祖 细胞或干细胞源于成体，并且用于治疗时可以展现出风险较低的不受控 (肿瘤)增长或恶性转化。
此外，发明人发现，根据本发明的祖细胞或干细胞明显没有展现出 分化成中胚层细胞类型(例如，骨或软骨细胞，结締组织细胞)的能力，
本发明人还发现，本发明的祖细胞或干细胞可以特别优先分化成肝 细胞或肝细胞样细胞，这就使它们特别适合于在肝脏中重构 (reconstitute)肝细胞功能。
本发明的祖细胞或干细胞明显在例如形态特征和标志物表达方面 不同于以前描述的肝源干细胞，如卵圓细胞。
根据本发明的成体肝脏祖细胞或干细胞尤其在医学、肝病学、肝脏 代谢出生缺陷、移植、传染性疾病、肝功能衰竭中有用。才艮据本发明的 肝脏祖细胞或干细胞尤其在(人)肝脏细胞移植、制备人肝脏细胞移植 的动物模型、生物-人工肝脏、体外肝脏细胞系和患有人类肝脏疾病的 动物模型、肝脏代谢筛选测试(药代动力学，细胞毒性，遗传毒性)和 肝脏细胞指导的基因治疗中有用。根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞可 以进一步分化成肝细胞。
本发明还提供包含根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞、其细胞系或 细胞群、或其后代(其中包括已分化后代，尤其是肝细胞或肝细胞样细 胞，任选地遗传修饰的后代)的药物组合物以及可药用载体。优选地，
所述肝脏细胞是人类肝脏细胞，或哺乳动物肝脏细胞。
本发明还提供用于治疗肝脏疾病的方法，其中包括施用有效量的根 据本发明的肝脏祖细胞或千细胞、其细胞系或细胞群、或其后代(其中 包括已分化后代，尤其是肝细胞或肝细胞样细胞，任选地遗传修饰的后 代)。在一个实施方案中，肝脏疾病，包括但不限于苯丙酮尿症和其他
氨基酸代谢疾病(aminoacidopathies )、血友病和其他凝血因子缺陷、 家族性高胆固醇血症和其他脂质代谢紊乱、尿素循环障碍、糖原贮积病 (glycogenosis )、 半乳糖血症、果糖血症(fructosemia )、 酪氛酸血症 (tyrosinemia )、蛋白质和碳水化合物代谢缺陷、有机酸尿症、线粒体 疾病、过氧化物酶体和溶酶体失常、蛋白质合成异常、肝细胞转运蛋白 缺陷、糖基化缺陷、肝炎、肝硬化、先天性代谢障碍、急性肝功能衰竭、 急性肝感染、急性化学毒性、慢性肝功能衰竭、胆管炎、胆汁性肝硬化、 Alagille综合征、a-l-抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、胆道闭锁、 肝癌、肝嚢性病变、脂肪肝、半乳糖血症、胆结石、Gilbert综合征、 血色病、曱型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、以及其他病毒感染型肝炎、 紫质症、原发性硬化性胆管炎、Reye氏综合征、结节病、酪氨酸血症、 I型糖原积症(type I glycogen storage disease)， 或威尔森氏症 (Wilson's disease )。
本发明还提供用于治疗基因表达错误的方法，该方法包括(i)将 一个基因的功能性拷贝引入根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞、其细胞 系或细胞群、或其后代(其中包含分化的后代，尤其是肝细胞或肝细胞 样细胞)用来提供转化的群；(ii)将至少部分转化的群引入患者肝脏， 该患者正需要这种基因的功能性拷贝。作为替代，可以将转化的群引入 非人类的哺乳动物的肝脏，以便产生一个新的肝脏病理的动物模型。
本发明还提供用于治疗基因表达错误的组合物，所述组合物包括根 据本发明引入有基因功能性拷贝的转化的肝脏祖细胞或干细胞、其细胞 系或细胞群、或其后代(其中包括已分化后代，尤其是肝细胞或肝细胞 样细胞，任选地遗传修饰的后代)。
本发明还提供用于治疗基因表达错误的药物组合物，所述药物组合 胞系或细胞群、或其后代(其中包含分化的后代，尤其是肝细胞或肝细
胞样细胞)，以及可药用载体。
本发明还提供用于增强受损或患病肝脏再生的方法，所述方法包
括向肝脏施用有效量的根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞、其细胞系 或细胞群、或其后代(其中包括已分化后代，尤其是肝细胞或肝细胞样 细胞，任选地遗传修饰的后代)。
本发明还提供包含基座(housing)的肝脏辅助装置，所述基座容纳 根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞、其细胞系或细胞群、或其后代(其 中包括已分化后代，尤其是肝细胞或肝细胞样细胞，任选地遗传修饰的 后代)。
本发明还提供在体外进行毒性测试的方法，所述方法包括使根据本 发明的肝脏祖细胞或干细胞、其细胞系或细胞群、或其后代(其中包括 已分化后代，尤其是肝细胞或肝细胞样细胞，任选地遗传修饰的后代) 接触测试试剂，并且观察(如有的话)至少一种测试试剂对肝细胞群的 作用。优选地，至少一种作用，其中包括对细胞活力、细胞功能或这两 方面的作用。
本发明还提供在体外进行药物代谢研究的方法，所述方法包括(i) 使根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞、其细胞系或细胞群、或其后代(其 中包括已分化后代，尤其是肝细胞或肝细胞样细胞，任选地遗传修饰的 后代)接触测试试剂，以及(ii)观察(如有的话)至少一种涉及测试 试剂在预定的测试期后的变化。优选地，至少一种变化，其中包括测试 试剂在结构、浓度或者这两方面的变化。
本发明还提供对用于治疗肝感染有效的试剂进行测试的方法，所述 方法包括(i)用目标传染原去感染根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞、 其细胞系或细胞群、或其后代(其中包括已分化后代，尤其是肝细胞或 肝细胞样细胞，任选地遗传修饰的后代)用以提供被感染的群；(ii)使 受传染的群接触预定量的测试试剂，以及(iii)观察(如有的话)接触 对受传染群的作用。在一个实施方案中，传染原包括一种微生物。在另 一个实施方案中，传染原包括一种或更多种病毒、细菌、真菌、或其组 合。在一个具体实施方案中，观察的作用包括病毒传染原对病毒复制的 作用，优选地，病毒感染剂包括肝炎病毒。
本发明还提供一种生产目标蛋白质的方法，所述方法包括(i)将 编码目标蛋白的功能性基因引入根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞、其
细胞系或细胞群、或其后代(其中包含分化的后代，尤其是肝细胞或肝 细胞样细胞)，(ii)在适合转录、翻译以及任选地翻译后修饰发生的条
件下孵育所述细胞群，以及(m)收获目标蛋白质。优选地，肝脏细胞
是人类肝脏细胞。在一个实施方案中，目标蛋白质包括疫苗抗原。 本发明还提供在体外或体内对肝的发育和肝细胞分化进行研究的
方法，所述方法包括在体外或体内使根据本发明的肝脏祖细胞或干细 胞、其细胞系或细胞群、或其后代(其中包括已分化后代)接触影响分 化条件的条件并且观察至少一种对细胞群的作用。
本发明包括细胞、其制备、表征、培养和生产的方法。
本发明还包括通过低温保藏这些细胞的培养物来保藏这些细胞。
本发明还包括动物及人类中细胞移植的技术。
本发明还包括根据本发明的肝脏干细胞来制备用于治疗上述疾病 的药物的用途。本发明还包括根据本发明的肝脏干细胞在试剂盒或部分 试剂盒中的用途。


图1表示本发明源于人类成体肝脏的祖细胞或干细胞的形态外观 (ADHLSC )，所述细胞如实施例1制备而来，经过1个月的培养之后 使用光学显微镜(相差)观察。A，较低的汇合(confluence); B，较 高的汇合。放大倍数为100 x 。
图2 A:呈现根据本发明源于人成体肝脏的祖细胞或干细胞 (ADHLSC)的免疫荧光染色，如实施例l中所制备的，l个月培k后， a-平滑肌肌动蛋白(Al)、波形蛋白(A2)以及白蛋白(A3,多克隆，A4， 单克隆)。B:和人肝细胞(hHep， 2道)，人类星状细胞(hSC， 3道)以 ;S^A类肝母细胞瘤(HepG2， 4道)相比，所述细胞系(ADHLSC， l道) 中的RT-PCR基因表达镨。
图3表示本发明源于人成体肝脏的祖细胞或干细胞(ADHLSC)在 体外分化成肝细胞样谦系。细胞如实施例1所述进行分化，在过程的第
2天(J2 )、第14天(J14 )和第30天(J30 )获取图像。
图4表示用未分化的ADHLSC细胞移植的uPA/SCID小鼠的嵌合 肝中的几张苏木精和曙红染色图像，如实施例l中所详述的，表明这些 细胞成为分化的肝细胞。
图5表示几张人白蛋白染色的图像，表明在实施例l中，用未分化 的ADHLSC移植10周后观察到的肝细胞样群的人源性。
发明详述
如此处所用，除非上下文另有明确指示，否则没有量词限定的对象意 思包括一个以及多个所指对象。作为实例，"细胞"是指一个或一个以上 的细胞。
如此处所用，术语"包含"、"包括"和"含有"是同义词，是具有包 容性的或开放式的，并且不排除额外的未详述的成员、要素或方法步骤。
本说明书中引用的所有参考文献通过引用全部并入本文。尤其是本文 专门涉及的所有参考的教导通过参考并入。
获得本发明的细胞
一方面，本发明提供一种获得分离的祖细胞或干细胞或者包含所述祖 细胞或干细胞的细胞群的方法，所述方法包括(a)解离成体肝脏或其一 部分，以便从所述成体肝脏或其一部分形成原代细胞群，(b)将原代细胞 群铺板到基底上面，使细胞附着其上，以及(c)从原代细胞群培养细胞， 细胞附着于所述基底上至少7天，优选至少10天，至少有13天，或至少 15天。
如此处所用，术语"分离的细胞"通常是指不与一个或多个细胞或者 一个或多个细胞成分结合的细胞，而在体内它们是结合的。例如，分离的 细胞可以已经离开其天然环境，或可以来自离开天然环境的细胞的增殖， 例如，离体增殖。
如此处所用，术语"体外"是指在动物或>^体之外或外部。此处所用 术语"体外"应理解为包括"离体"。术语"离体"通常是指离开动物或 人体的组织或细胞并且在体外保存或增殖，如在培养容器中。
术语"细胞群"通常是指一组细胞。除非另有指明，否则该术语是指
由本文分离的细胞组成或包含此处分离的细胞的细胞群体。
细胞群可由具有共同表型的细胞组成或可包含至少部分具有共同表型 的细胞。当细胞在一个或多个显著特征上基^t目似或一致时，认为细胞具
有共同表型，其特征包括但不限于形态外观、某细胞成分或产物(如RNA、 蛋白质或其他物质)的表达的有无或水平、某生化途径的活性、增殖能力 和/或动力学、分化潜能和/或对分化信号的响应或体外培养行为(如，附 着、不附着、单层生长、增殖动力学等)。因此这种显著特征可以定义一 个细胞群或其部分。
当此处称细胞群为"不均一"(heterogeneous)时，这通常表示细胞群 包含两种或更多种不具有共同表型的细胞或细胞部分，如细胞群包含两种 或更多种不同细胞类型的细胞。例如但不限于，不均一细胞群可以分离自 肝脏，并且可包含多种肝脏细胞类型，包括但不限于肝细胞(如大的和小 的肝细胞)、胆管细胞、Kupffer细胞、肝星状细胞(Ito细胞)以;SJf脏 内皮细胞。
当此处称细胞群为"均一"(homogeneous)时，它由具有共同表型的 细胞组成。此处称细胞群"基本均一"时包含的绝大部分细胞具有共同表 型。"基本均一的"细胞群可包含至少70% ,如至少80% ，优选至少卯％ ， 如至少95%或甚至至少99%的细胞具有共同表型，如具体提及的表型(如 祖细胞或干细胞的表型)。如此处所用，因此此处所用术语"基本均一" 还可包括均一的群。
术语"包含祖细胞或干细胞的细胞群"涉及如此处所定义的包含至少 一种祖细胞或千细胞，典型情况下如此处所定义的部分祖细胞或干细胞的 细胞群。通常，所述部分的祖细胞或干细胞可以具有共同表型。
术语"祖细胞"通常是指没有特化或相对较少特化的并且有增殖潜能 的细胞，这种细胞或其后代能够产生至少一种相对更加特化的细胞类型。 例如但不限于，祖细胞可以产生沿 一个或多个镨系分化的后代来产生相对 越来越特化的细胞，其中这种后代和/或相对越来越特化的细胞可以自身就 是祖细胞，或甚至产生终末分化的细胞，即完全特化的细胞，这可以是 有丝分裂后的。术语还包括此处定义的干细胞。
当认为祖细胞"产生"另一种相对更加特化的细胞时，例如但不限于， 祖细胞不首先经过细胞分裂而分化成另 一种细胞，或者另 一种细胞是经过 祖细胞或其后代一轮或更多轮细胞分裂和/或分化之后而产生的。
术语"干细胞"是指能够自我更新(即不分化而能够增殖)的祖细胞， 其中干细胞的后代或至少其一部分基本保持了亲代干细胞未特化的或相 对较少特化的表型、分化潜能、以及增殖能力。该术语包括能够基本上无
限自我更新的干细胞，即和亲代细胞相比，后代或其部分进一步增殖的 能力没有显著降低，以M现出有限的自我更新的干细胞，即和母细胞 相比，后代或其部分进一步增殖的能力显著降低。
本领域技术人员知道上述特征通常是指祖细胞和干细胞在体内的行 为，在适当的*下完全或至少部分地在体外和/或离体重复出来。
基于产生不同细胞类型的能力，祖细胞或干细胞通常可被描述为是全 能(totipotent),多能(pluripotent)、专能(multipotent)、或单能的 (unipoteiit)。单个"全能"细胞定义为能够生长(即发育)成整个生 物体。"多能"细胞不能长成整个生物体，但是能够产生源于所有三个胚 层的细胞类型，即内、中和外胚层。并可以能够产生生物体的所有细胞类 型。"专能"细胞能够产生来自生物体的两个或更多不同器官或组织的至 少一种细胞类型，其中所述细胞类型可以源自相同或不同的胚层(germ layer),但不能产生生物体的所有细胞类型。"单能"细胞只能分化成一个 细胞系的细胞。
术语"分化"或其派生词用于此处是指一种过程，未特化的或相对较 少特化的细胞通过这种过程变得相对更加特化。在细胞个体发生中，形容 词"分化的"是一个相对术语。因此，"分化的细胞"比相比较的细胞而 言是一种发育ii^特^JL育途径的细胞。分化的细胞，例如可以是终末分 化的细胞，即在生物体各种组织和器官中发挥特化功能的完全特化的细 胞，但是不需要是有丝分裂后的。在另一个实例中，分化的细胞也可以是 分化谱系中的祖细胞，其可以进一步增殖和/或分化。相似的，如果细胞比 相比较的细胞而言发展进入了特定发育途径，则细胞是"相对更加特化 的"，其中后者^li人作是"未特化的"或"相对较少特化的"。相对更加 特化的细胞可以在一个或更多显著表型特征方面不同于未特化的或相对 较少特化的细胞，所W型特征如，例如，某细胞成分或产物(如RNA、 蛋白质或其他物质)的表达的有无或水平、某生化途径的活性、形态外观、 增殖能力和/或动力学、分化潜能和/或对分化信号的响应等，其中这些特 征表明相对更特化的细胞进一步沿着所述发育途径的进程。
分化的非限制性实例可以包括，如，全能干细胞变成指定类型的专能 祖细胞或干细胞的变化、专能祖细胞或干细胞变成指定类型的单能祖细胞
或干细胞的变化、或单能祖细胞或干细胞变成指定细胞系中更加特化的细 胞类型或终末特化的细胞的变化。可以通过具有中等特化程度细胞的外观 来区分未特化的或较少特化的细胞分化和更特化的细胞。
席庠，趣织
如所述，本发明的方法包括解离成体肝脏或其一部分以从所述成体肝 脏或其一部分形成原代细,的步骤。
术语"肝脏"是指肝脏器官。术语"肝脏部分"通常是指肝脏器官的 任何部分，对于所述肝脏器官的部分或肝脏起源的区域在量上没有^壬何限 制。优选地，肝脏器官中存在的所有细胞类型也可在所述肝脏部分中出现。 部分肝脏的量可以至少部分上遵从实际考虑因素，如获得足以实施>^发明 方法的原代肝脏细胞的需要。根据本发明的教导这种考虑对于本领域技术 人员来说是显而易见的。因此，例如但不限于，部分肝脏可以代表(典型
地w/w)至少肝脏的0.1%、或肝脏器官的至少1%、或至少10%、或至少 20%、或至少30%、或至少40%、或至少5(T/。、或至少60%、或至少70 %、或至少80%、或至少卯％或以上。在其他非限制性实例中，部分肝脏 可以至少是lg、或至少10g、或至少100g、或至少200g、或至少300g、 或至少400g、或至少500g、或至少600g、或至少700g、或至少800g、或 至少卯0g、或至少1000g、或至少1100g、或至少1200g、或至少1300g、 或至少1400g或以上。例如，部分肝脏可以^Jf叶，例如，右叶或左叶，
或肝脏劈离IMt中切除的iv部分。
此处所用术语"成体肝脏"是指已经获得了基本发育成熟的组织(tissue organization)和细胞组成。
具体来说，本领域技术人员已知肝脏在出生后一段时间内经历发育变 化，此期间肝脏获得基本成熟的组织。例如，人类对象中，出生时的肝脏 含有相当数量的itjfc细胞，其在大约出生后1-2周内基4^Uf脏中消失。 并且，人的肝脏在出生时含有一群肝脏祖细胞，其在出生后几个月内基本 被成熟肝细胞和胆细胞所替换。
因此，在人类对象中，"成体肝脏"是指在出生后任何时间，优选全时 期(full term),可以是出生后至少一个月龄、如至少2个月、至少3个月， 如至少4个月、至少5个月，如至少出生后6个月龄，如，例如l年或以 上、5年或以上、至少10年或以上、15年或以上、20年或以上、或出生 后25年或以上的对象的肝脏。因此，可在人类对象中找到"成体肝脏"或
成熟肝脏，其中人类对象将在不同情况下按照常规术语"婴儿"、"儿童"、 "青年"、"青少年"或"成人，，来描述。
本领域技术人员知道，肝脏在不同动物物种中在产后不同时间内可以 基本发育成熟，针对各个物种能够适当解释术语"成体肝脏"。
肝脏或其部分是从"对象"、"供体对象"或获得的，其中"对 象"、"供体对象"或"供体"涉及脊推动物时可以互换，优选哺乳动物， 更优选是人。
术语"哺乳动物"包括任何分类的动物，所述分类如，包括但不限于，
人类、家畜和农场动物、动物园动物、体育动物(sport animal)、宠物动 物、伴侣动物和实验动物，其中实验动物如，例如，小鼠、大鼠、兔、狗、 猫、牛、马、猪和灵长类动物，例如猴子和类人猿。
在一个特别优选的实施方案中，成体肝脏或其部分来自人类对象。如 本说明书中所详述的，根据本发明来自人类对象的肝脏的祖细胞或干细胞 或细胞系、或其后代可以方便地用于，如，尤其是患有肝病的人类患者的 研究和治疗。
在另一个实施方案中，成体肝脏或其部分可来自非人的动物对象，优 选非人哺乳动物对象。根据本发明来自非人动物或非人哺乳动物对象的祖 细胞或干细胞或细胞系、或其后代可以方便地用于，如，在与4^目同、相
或甚至治疗患有肝病(如异种器官移植、包含非人类动物或非人哺乳动物 细胞的生物人工肝装置)的人类患者。例如但不限于，尤其适合用于人类 治疗的非人哺乳动物细胞可以来自猪。
供体对象可以是活的也可以是死的，根据本领域接受的原则所确定的， 如，例如，"心-肺"标准(通常包含循环和呼吸功能的不可逆停止)或
"脑死亡"标准(通常包含全脑，包括脑干，所有功能的不可逆停止)。 获取可以包括本领域已知的过程，例如，活组织检查、切除或切除术。
本领域技术人员知道从，对象获取肝或其部分的至少 一些方面可以 遭受分别来自法律和道德规范的考量。例如但不限制，从活的人类儉体获 取肝脏组织可以需要满足维持,今后的存活。因此，典型情况下可以只 有肝脏的一部分从活的人类,中分离出来，如使用活组织检查或切除， 从而在供体中维持足够的生理肝功能水平。另一方面，从非人动物获取肝 脏或其部分可能，但不需要满足非人动物今后的存活。例如，在获取组织
之后非人动物就可以被人道处死了 。这些以及类似的考虑对于本领域技术 人员是显而易见的，其反映了法律和道德标准并且基本不涉及本发明的本 质。
在一个实施方案中，肝脏或其部分可从供体尤其是人类供体获得，所
i^A类W^具有持续的循环如跳动的心脏，持续的呼吸功能如呼吸的肺或 人工呼吸器。考虑到道德和法律规范，供体可以需要或不需要脑死亡(如 这可能不适于人类供体的今后存活，但是在脑死亡的人类中可以允许分离 整个肝脏或其部分)。从这种供体中获取肝脏或其部分是有优势的，因为 组织不遭受实质性缺氧(缺少氧)，实质性缺氧通常是由缺血(ischemia) (循环停止)造成的。
另一个实施方案中，如本发明人惊喜的发现，肝脏或其部分可从供体 尤其是人类供体获得，所述人类供体在获取组织的时候循环就已经停止 了，如心脏停止跳动、和/或呼吸功能停止，如不进行呼吸的肺以及没有呼 吸机。尽管来自于这些供体的肝脏或其部分可能已经遭受一定程度的缺 氧，本发明人发现根据本发明可用的祖细胞或干细胞也可以从这些组织获 得。肝脏或其部分在，循环(如心跳)停止后大约24小时之内获取，如 大约20小时之内、如大约16小时之内、更优选大约12小时之内、大约8 小时之内、甚至更优选大约6小时之内、如大约5小时之内、大约4小时 之内或大约3小时之内、更优选大约2小时之内以及最优选大约1小时之 内，如WWt环(如心跳)停止后大约45、 30、或15分钟之内。
如上述获取的组织可冷却至大约室温，或低于室温的温度，但是通常 避免冷冻组织或其部分，尤其这种冷冻会导致晶核形成或冰晶生长。例如， 可在大约1。C和室温之间、大约2'C和室温之间、大约3'C和室温之间或大 约4。C和室温之间的任何温度下保存组织，并且有利地保存在大约4'C。如 本领域所公知的，组织也可以保存在"水上"。可以在整个或部分缺血期 (即M内循环停止后的时间)内冷却组织。就^li兌，组织可以经受热 缺血、冷缺血或热冷缺血的组合。可在处理前将获取的组织保存长达48 小时，优选少于24小时，如少于16小时，更优选少于12小时，如少于 IO小时，少于6小时，少于3小时，少于2小时或少于1小时。
在进一步处理组织之前，获取的组织可方便地，但不是一定^M!"于 如整个或至少部分浸于适当的基质和/或可以但不是一定要用适当的基质 灌注。本领域技术人员能够选择适当的可以在处理之前支持组织细M活 的基质。
本发明的方法包括如上所述的解离成体肝脏组织来形成原代细Jife^。
此处所用术语"解离"通常是指部分或完全破坏组织或器官的细胞组 织结构，即部分或完全破坏组织或器官的细胞和细胞成分之间的联系。本 领域技术人员能够理解，解离组织或器官的目的在于从所述组织或器官获 得细胞(细胞群)悬液。悬液可以包括独立的或单个细胞，以及物理附着 而形成的两个或多个细胞的簇或团。优选分离不引起或尽可能少的引起细 胞活力的降低。
适合解离肝脏或其部分来从其获得原代细胞群(悬液)的方法可以是 本领域公知的任何方法，包括但不限于酶消化、机械分离、过滤、离心及 其组合。在一个实施方案中，解离肝脏或其部分的方法因此可包括酶消化 肝脏组织来释放肝脏细胞。在一个实施方案中，解离肝脏或其部分的方法 可包括对肝组织的机械破坏或分离来释放肝脏细胞。在一个实施方案中， 解离肝脏或其部分的方法可包括肝组织的酶消化和机械破坏或分离的两 者组合来释放肝脏细胞。
上述解离肝脏或其部分的方法在本领域中已有记载。例如，从肝脏组
织分离肝脏细胞的方法自1960年代中期就已经是公知技术了( Howard等 1967. J Cell Biol 35: 675-84 )。利用组合的机械和酶消化技术来分离大鼠肝 细胞，之后经Berry和Friend所改进(J Cell Biol 43: 506-20， 1969 )。这种 技术经Seglen进一步发展而成为广泛应用的两步胶原酶灌注(two-step collagenase perfusion )技术(Methods Cell Biol 13: 29-83,1976 )。
因此，在一个实施方案中，解离肝脏或其部分来从其获得原代细, (悬液)的方法是或包括两步胶原酶灌注技术。本领域技术人员知道由于 上面所述技术公开，多种改进已经在本发明中得以描述和/或可以想象到 的，并且它们包括在本发明范围内。
例如但不受限制，随后对常规的两步胶原酶灌注技术进行概述。对于 全肝，可以将插管(cannulae)置于现存的主要肝脏血管中，并通过缝合 固定。对于肝脏的部分或节段，插管可以置于切割面的患者血管开口，并 通过缝合固定。这种情况下，通常需要封闭小的血管开口来防止灌注溶液 从切割面渗漏。用37X:下预热的二价阳离子游离緩冲液灌注肝脏组织，所 述緩冲液含有阳离子螯合剂，例如，如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇 四乙酸(EGTA)。緩冲液可以包括盐溶液，如，例如，N-2-羟基乙基哌噪 -N，-乙基磺酸(HEPES )、 Williams E培养基、Hanks'平衡盐溶液、或Earle's
平衡盐溶液，还可以包含盐如氯化钠和氯化钾等。这导致将细胞维系在一 起的桥粒结构的破坏。然后用緩冲液灌注组织，緩冲液含有二价阳离子，
如Ca"和Mg2+、以;SJC挥消化组织作用的M降解酶。原代肝脏细胞， 尤其是肝细胞通常经温和的机械破坏得以释放来机械性完成解离过程，如 用梳子耙、振荡、用过滤器挤压，如不锈钢过滤器、粗棉布(cheesecloth) 或尼龙织物。这种过滤器具有允许肝细胞通过的筛眼孑L径(sieve size )，例 如并且不受限制，大约0.1亳米或以上、约0.25亳米或以上、约0.50亳米 或以上、约l亳米或以上、约2、 3、 4或5毫米。可以使用筛眼逐渐减小 的一 系列过滤器来逐级使组织解离并释放细胞。用緩冲液漂洗解离的细 胞，緩冲液含有蛋白酶抑制剂、血清和/或血浆来灭活胶原酶和其他灌注过 程所用的酶，经低速离心分离，如在10 x g和500 x g之间(基本上所有活 细胞都可以方便地沉淀下来，而死细胞和细胞碎片基#除去)，用水-冷 的緩冲液洗涤获得的沉淀物来纯化细胞悬液。
分离的肝细胞的数量和质量有赖于如所用组织的质量、灌注緩沖液的 成分以及酶的类型和浓度的不同而不同。常用的酶包括，但不限于， 酶、链霉蛋白酶、胰蛋白酶、^t酶(Dispase)、透明质酸酶、嗜热菌蛋 白酶(Thermolysin )、胰脏酶(pancreatin)及其组合。胶原酶是最常用 的，通常从细菌中制备而来(如A自Clostridium histolyticum )，可以通常
由未经;f艮好纯化的酶的混合物组成，其中可以有不一致的酶作用。有些酶 表现出蛋白酶活性，可能会导致不希望的反应而影响活力/健康细胞的质量 和数量。本领域技术人员知道要使用足够纯度和质量的酶来获得活肝细胞 群。
获取原代肝脏细胞的其他方法可以不包括酶消化技术。机械性破裂已 得到广泛使用，尽管通过这种过程生产的肝脏细胞的产量往往少于由J&^ 酶消化获得的，并且较少一致性。然而，最近的方法已经得以t艮并具有
显著成果，其中包括在冷却的环境中，将蔗糖-EDTA灌注与受控振动相结 合(Kravchenko等2002. Cell Biol lnt 26: 1003-1006)。用含有EDTA (pH7.4)的蔗糖溶液原位灌注肝脏。灌注后，将肝脏从身体中分离，置 于碟中，细分装入小体积的冰-冷基质中。通过使用匀浆器马达的受控^ 振动解聚(mechanical vibrational disaggregation; MVD )的方式释放肝 脏碎片的细胞。这种方法获得的匀浆IC^可以用粗网过滤来给出肝脏细胞 的初始悬液。细胞可以悬浮在基质中，通过离心来重新获得。因此，在一 个实施方案中，可通it^L械性破坏分离肝脏细胞或其部分。本领域技术人员知道两步胶原酶技术尤其适用于至少从肝脏组织释放 肝细胞。通过所述技术获得的细胞悬液可以包含相当部分的肝细胞，也可 以含有其它肝脏细胞类型。正如所提及的，本发明人已经发现这种细胞悬
液是用于获得本发明的祖细胞或干细胞的尤其合适的材料。
在一个实施方案中，解离肝脏或其部分的方法可以形成细胞悬液(可
以轻易被本领域技术人员得以优化)，所述悬液包含至少10%,如至少有 20%、至少30%，如至少40%、至少50%，如至少有60%、至少70%， 如至少有80%或至少卯％，或最多可有大约100%的单独的细胞，即单细 胞。
正如所提及的，解离肝脏组织从而从所述成体肝脏或其部分提供原代 细麟。
如此处用，术语"原代细胞"包括从对象组织或器官如通过解离(即 铺板之前的细胞群)获得的细胞悬液中存在的细胞、外植组织中存在的细 胞、当首次铺板时前面两种类型的细胞、来自首次铺板的细胞的细胞悬液 的细胞。术语"继代细胞"是指培养中所有后续步猓中的细胞。因此，当 铺板的原代细胞首次传代，如M底表面糸沐并重新铺板，那么正如在后 续传代中所有细胞一样，在此称作继代细胞。
此处定义的并且通过解离肝脏或其部分获得的原代细胞群通常是不均 一的，即可以包含属于一种以上肝脏中细胞类型的细胞。典型的肝脏-组成型细胞类型包括但不限于肝细胞、胆管细胞、(胆管道细胞)、Kupffer 细胞、肝星状细胞(Ito细胞)、卵圆细胞以及肝内皮细胞。上述术语具有 本领域明确意义并且此处应广泛理解为包括照此分类的任何细胞类型。肝 脏-组成型细胞类型还包括实质和非实质肝脏细胞。
作为进一步说明但是不受限制，"肝细胞"包括上皮、实质肝脏细胞， 包括但不限于大小不同的肝细胞(如，"小"、"中"和"大"的肝细胞)、 倍性(如，二倍体、四倍体、八倍体)或其他特征。例如，有些作者提出， 其定义的"大"的肝细胞是负责肝脏生理功能的实质细胞，而"小"的肝 细胞提供一个发育为肝细胞的祖细胞的库(见，如Mitaka等Biochem Biophys Res Commun 214: 310-7， 1995)。还作为进一步说明但是不受限 制，"胆管细胞"包括胆管的上皮细胞。还作为进一步说明但是不受限制， "卵圆细胞"包括独特的形态(如，核形)和细胞标志物表达的细胞，如 本领域所众所周知的，被认为在特定条件下是能够产生肝细胞和胆管细胞
的祖细胞(Lowes等.KN. 2003. J Gastroenterol Hepatol 18: 4-12; Yi等 1999. J of Hepatology 31 : 497-507 )。
因此，在一个实施方案中，不均一的原代肝脏细胞群可以包括至少两 种，如至少三或四或更多种肝脏-组成型的细胞类型，如属于所有或基本所 有肝脏-组成型细胞类型的细胞，包括但不限于上面列出的细胞类型。本领 域技术人员了解不均一的群可以包括以前描述的肝脏细胞类型，无论体内 还是体外，以及本领域以前尚未描述、分类、分离和/或表征的肝脏细胞类 型。
本领域技术人员还知道不均一细胞群可以包括但不限于各种肝脏细胞 类型，所述各种肝脏细胞的相对比例同于或基本同于其分离所在的肝脏或 其部分中存在的相对比例。例如，技术人员知道， 一种或多种其它细胞类 型相比，特定的肝脏组织解离方法可以导致更有效的分离一种或多种细胞 类型，其中获得的细胞悬液可以不经意或有针对性地富集了前述的一种或 多种细胞类型。此外，有些解离方法可以对不同肝细胞类型的存活和/或活 力有不同的影响。技术人员还知道针对一种或多种目标肝脏细胞类型而用 于富集通过分离肝脏或其部分而获得的细胞群的本领域中的方法。这些方 法包括但不限于差速离心、浮力密度梯度离心、过滤、细胞淘析 (elutriation )、亲和纯化、蛋白酶消化等。
在一个实施方案中，原代肝脏细胞的不均一群可以包括属于所有或 基本所有肝脏-组成型细胞类型的细胞。本发明人发现用于获得以前未公开 的肝脏祖细胞或干细胞类型的方法。无论如何，发明人不希望所述新型祖 细胞或干细胞的来源受到任何假说的限制。
例如但不限于，所述祖细胞或干细胞、或其祖先可以已经存在于肝 脏中，如肝脏实质或非实质。例如，这种祖先可以具有和分离的祖细胞或 干细J^目同、相似或不同的表型(如根据本发明的培养可以改变祖先的表 型)。作为替代，或此外，分离的祖细胞或干细胞可以因为改变如分化或 去分化而产生一种或多种肝脏细胞类型，如以前已知或未知的肝脏细胞类 型。鉴于此，本发明的方法可以优选从代表所有或基本所有肝脏细胞类型 的细胞开始。
发明人已经发现可以从通过分离肝脏或其部分而形成的细胞群方便 地获得本发明的祖细胞或干细胞，其中所述细胞群包括肝细胞。因此，适 合根据本发明分离肝脏或其部分的方法形成包括肝细胞的细胞群。不受任
何理论限制，发明人认为发明的祖细胞或干细胞、或其祖先以>^脏中至 少释放出肝细胞的方式从肝脏组织(通过分离肝脏获得的)中一同释放的。
在一个实施方案中，解离肝脏或其部分的方法可形成包含一定比例
肝细胞的细胞群，其中至少大约10%、至少大约20%、至少30%、至少 40 % ,优选至少大约50 % 、如至少60 % 、更优选至少大约70 o/c 、如至少 大约80%、甚至更优选至少大约90%或以上、如至少大约95%、至少大 约96。/。、至少大约97%、至少大约98%、或至少大约99%。本发明AJL 现形成包含相当比例的肝细胞(如，如上所述至少大约50%或以上)的分
或千细胞。
在一个优选实施方案中，包含上述比例肝细胞的细胞群可通过解离 肝脏或其部分而获得，其中不包括进一步针对肝细胞和/或其他细胞类型富 集细胞群的步骤。
在另一个实施方案中，可通过解离肝脏或其部分、以及一步或多步 针对肝细胞和/或其他细胞类型尤其是肝细胞而富集细胞群的步骤来获得 包含上述比例肝细胞的细1&#。然而，技术人员知道，在针对肝细胞、其 亚群或其他细胞类型富集细胞群的方法中，当本发明的祖细胞或干细胞或 其祖先在适于释放肝细胞的解离条件下可以从肝脏中释放时，可以但不总 是，和肝细胞、或一种或多种肝细胞的亚群(如，"大"或"小"的肝细 胞)、或其他细胞类型共-纯化。选择方法用于富集肝细胞和/或其他细胞类 型尤其是肝细胞，从而在获得的细胞群中保留本发明的祖细胞或千细胞、 或其祖先，这属于本领域技术人员的能力范围内。
此外，本领域技术人员知道本发明的祖细胞或干细胞、或其祖先可 以具有某些性质(如物理性质或表面标志物的表达)使其可以通过合适的 分离方法在从肝脏获得的细胞群中得以富集。基于 一种或多种原则来确定 分离的、或针对本发明的祖细胞或干细胞或其祖先而富集的细胞群级分 (fraction)属于本领域技术人员的能力范围之内。这可以通过根据本发明 的方法培养来自各种测试流分的细胞，以及确定哪个流分产生本发明的祖 细胞或干细胞来实现。
细胞的"富集的群"是指这样一种细胞群，其中和可以在体内或经 富集的细胞群中发现的细J^目比， 一种或多种细胞类型以较大的相对比例 存在。
错我^《，虔逸欢^^^勿應
本发明的方法包括培养通过如此处所述的解离肝脏组织的方法获得 的原代细胞群。为此，将肝脏细胞的原代细胞群铺板于基底上使细胞附着 其上。
此处所用术语"铺板，，和接种同义，并且通常是指将细胞群引入能 够促进引入的细胞存活和/或生长的体外环境。通常，所述环境可在一种与 周围环境适当区分开的系统中来提供，从而，可以避免所述环境和周围环 境之间的物质交换(因此避免，如环境的污染或培养基^质或来自培养基质 的细胞泄露)，允许所述环境和周围环境之间连续或间歇性的其他有用物 质成分的交换(如偶尔交换部分或所有培养基质、气体的连续交换、或培 养后收获细胞等)。通常，可以在本领域公知的培养容器中建立适于培养 细胞的环境，如，例如，各种形式的细胞培##瓶、孑L板和平皿。
本发明中，将细胞(如原代肝脏细胞)铺板于允许细胞附着其上的 基底，即其表面不排斥细胞附着或贴附。这可以通过如将细胞铺板于培养 系统(如培养器皿)中来实施，其中所述培养系统呈现出一种或多种适于 细胞附着的基底表面。当所述一种或多种基底表面接触引入培养系统的细 胞悬液(如基质中的悬液)时，可以发生细胞和基底表面之间细胞粘附。 因此，术语"将细胞接种于允许细胞附着其上的基底"是指将细胞引入培 养系统，所述系统的特征为至少一种广泛兼容细胞粘附的基底表面，因而 接种的细胞可以接触所述基底表面。维持粘附的细胞培养物的一般原则在 本领域是妙的。
通常，允许细胞附着其上的基底可以是任何非常亲水的基底。如本 领域众所周知的，培养容器，如培养摇瓶、孔板、平皿等，通常可以由各 种高分子材料制造而成，包括但不限于聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯
(Polymethylacrylate )、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚砜(polysulphone )、聚 羟基酸(polyhydroxyacid )、聚酸酐、聚原酸酯(polyorthoester )、聚砩腈、 聚磷酸酯(polyphosphate )、聚酯、尼龙或其混合物等。通常用这种材料 制得的培养容器在浇铸成型之后要进行表面处理用以提供亲水性基底表 面，从而提高有效的细胞附着的可能性。表面处理可以采M面涂层处理 或可以涉及在表面通过定向能的使用而希望在聚合物表面产生化学基团 的方式。这些化学基团对"普遍的亲和性，或者表现出足够的极性使其 稳定吸附至其他极性基团。这些官能团导致亲水性，和或增加表面氧以及
认为可提高细胞在这种修饰的基底表面生长的性质。这种化学基团可包括 如胺、酰胺、羰基、羧酸、酯、羟基、St^等。定向能的实例包括大气电
晕放电(atmospheric corona discharge )、射频(RF)真空等离子体处理、 直流辉光放电或等离子体处理(如，US 6,617,152 )。目前培养贴壁细胞 的标准做法包括使用成分明确的化学介质，并添加有牛、人类或其他动物 血清。添加的血清除了提供养分和/或促生长因子，还可以通过用一层更易 于细胞粘附的基底涂层(coating)处理的塑料表面来促进细胞粘附。
一种作为替代的兼容细胞粘附的基底表面可以是玻璃，任选地，引 入如前面列出的官能团来增强其亲水性的处理过的表面。
其他粘附基底表面可经表面涂层处理来产生，如上述高分子或处理 的高分子表面的涂层。在一个非限制性实例中，涂层可以涉及合适的聚阳 离子，如，例如，聚鸟氨酸或聚赖氨酸。
在另一个实例中，优选的涂层以;M目对应的基底，包括一种或多种
胞外基质成分，如，ECM蛋白质纤维、层粘连蛋白、胶原蛋白(优选I 型蛋白)、糖胺聚糖(如肝素或石危酸乙酰肝素)、纤维粘连蛋白(fibronectin )、 明胶、玻璃粘连蛋白(Vitronectin )、弹性蛋白、固生蛋白(Tenascin )、 可聚蛋白多糖(aggrecan)、集聚蛋白(agrin )、骨唾液酸蛋白(Bone Sialoprotein)、软骨<&^蛋白(cartilage matrix protein)、 纤维蛋白原、 flbulin、津占蛋白、巢蛋白(entactin)、骨#^"白(osteopontin )、纤维蛋白 溶酶原、restrictin、丝甘蛋白聚糖(serglycin )、 SPARC/骨粘连蛋白 (osteonectin),多功能蛋白聚糖(versican )、凝血酶敏感蛋白1 (thrombospondin 1)、或包括钾粘素、连接蛋白(connexin)、选择素或 其多种组合的粘附分子。
优选实例可以包括纤维蛋白、层粘连蛋白或胶原蛋白。其他优选实 例可以涉及包含ECM成分的组分，如Matrigel @基底膜基质(BD Biosciences )，它是从EHS小鼠肉瘤提取的可溶性基底膜制备物，所述EHS 小鼠肉瘤富含ECM蛋白质，其中主要成分4^粘连蛋白，其次是IV型胶 原、硫酸乙,素蛋白IMt和巢蛋白。
尤为优选的实施方案包括由^f蛋白(尤其是I型^f蛋白)组成 的涂层或包含J!^f蛋白(尤其是I型^f、蛋白)的涂层。
如本领域技术人员公知的，为了便于随后以一个期望的密度接种细 胞，可能要计数细胞。其中，如本发明中，接种后细胞可以主要粘附于培养系统中存在的基底表面上(如培养器皿)，以每1111112或《!12所述基底表 面接种的细胞数目来表示接种密度。本发明中，从分离的肝脏或其部分获
得的原代细胞的接种密度在1个细胞/mm2和lxl(^个细胞/mm2之间，如1 x 10i和lxl05个细胞/mm2之间或lxl02和lxl05个细胞/mm2之间，如lx103 和lxl()5个细胞/mm2之间、5xl()3和5xl()4个细胞/mm2之间、在lxl(^和 lxl03个细胞/mm2之间、在lxl()2和lxl04个细胞/mm2之间，如大约lx101、 5xl01、 lx102、 5xl02、 lx103、 5xl03、 6xl03、 7xl03、 8xl03、 9xl03、 lx104、 2xl04、 3xl04、 4xl04、 5xl()4或1 xl()5个细胞/mm2。
典型情况下，原代肝脏细胞接种后，使细胞悬液接触粘附表面以便 允许细胞从细胞群粘附至所述基底。在原代肝脏细胞与粘附基底的接触 中，可以方便将细胞悬浮于含有至少基质的环境中，本发明的方法中，典 型情况下是液体基质，其有助于细胞的存活和/或生长。可以将基质在引入 细胞之前、同时或之后加入系统。基质可以是新鲜的，即先前未用于培 养细胞或可以包含至少一部分通过预先细胞培养(如，培养正##板的或 之前已有的细胞，或培养与接种的细胞不太相关或无关的细胞)所适应性 处理(conditioned)的部分。
为了^更于所述粘附，在一个实施方案中，原代细胞悬液可以与粘附 表面接触至少约0.5小时，如，至少约1小时，优选至少约2小时，如， 至少约4小时，更优选至少约8小时，如，至少约12小时，甚至更优选至 少约16小时，如，至少约20小时，最优选至少约24小时或更长时间，如， 至少约28、 32、 36、 40、 44或48小时。
在另一些优选实施方案中，原代细胞悬液可以与粘附表面接触约2 小时和约48小时之间，如约12小时和约48小时之间，优选约12小时和 约36小时之间，如约16小时和约32小时之间，甚至更优选约20小时和 约28小时之间，最优选约24小时。
尽管优选上述时间，也可以提供更短或更长的时间用于适于本发明 的细胞的粘附，并且本领域技术人员可以优化这种时间。
使来自原代肝脏细胞群的细胞粘附至上述粘附基底后，将非粘附的 物质从培养系统中去除。非粘附的物质包括，但不限于，没有粘附到粘附 基底上的细胞(例如，如，不倾向于粘附的细胞，或在允许的时间内不粘 附细胞)、没有活力的或垂死的细胞、细胞碎片等。典型情况下可以通过 从系统中弃掉基质去除非粘附的物质。粘附的细胞仍然粘附在基底上，任
选地用适当的基质或等渗緩冲液(如PBS)漂洗一次或重复漂洗贴壁细胞 和培养系统。在此，选择粘附于基底表面的，来自原代肝脏细胞群的细胞 用于进一步培养。
铺板细胞并且允许细胞粘附的环境可以包括至少一种基质，本发明 的方法中通常是液体基质，其支持细胞存活和/或生长。可以将基质在引入 细胞之前、同时或之后加入系统。基质可以是新鲜的，即先前未用于培 养细胞或可以包含至少一部分通过预先细胞培养(如，培养正要铺板的或 之前已有的细胞，或培养与接种的细胞不太相关或无关的细胞)所适应性 处理(conditioned)的部分。
基质可以是本说明书中描述的适当的培养基质。优选基质的组成可 以具有相同特性，可以和随后培养贴壁细胞的步骤中所用的基质组成相同
或基^M目同。或者，基质可以不同。有利地，基质可以包括血清或血浆， 这可以进一 步促进细胞粘附。
潜#虞《^f遂逸欢辨
粘附于所述基底的来自原代细胞群的细胞，优选在所述环境中，继
续培养至少7天，如，至少8天或至少9天，优选至少10天，如，至少 11天或至少12天，至少13天或至少14天，更优选至少15天，如，至少 16天或至少17天，或甚至至少18天，如，至少19天或至少20天或以上。 术语"培养"是本领域公知的，并且广泛涉及细胞和/或其后代的维持和/ 或生长。
在一些实施方案中，可以培养原代细胞至少大约10天和约40天之 间，优选至少约15天和约35天之间，如，至少约15天和20天之间，如 至少约15、 16、 17、 18、 19或20天。优选，如此培养原4戈细胞不超过60 天，或不超过50天，或不超过45天。
本领域技术人员知道在培养系统中延长的细胞培养可以需要定期将 培养基更换为新鲜培养基。本领域技术人员通过检查细胞培养参数(如pH 值、细胞密度或细胞的外观)能够判断是否需要更换培养基。典型情况下， 通常会定期更^t，如，每隔1至10天，优选接种后的16至32小时(如， 约24小时)之间，优选每隔2至6天，或更优选每隔2至4天，如，大约 每隔2、 3或4天。可以更换全部体积的基质或任选地仅仅更换部分基质， 从而保留了被先前的细胞培养所调整的那部分基质。在一个实施方案中， 基本所有体积的基质都更换为新鲜基质。在另一个优选实施方案中，在延
长的细胞培养期间没有更g质。
在存在液体培养基条件下培养原代细胞悬液和进一步贴壁的细胞。 典型情况下，基质包括本领域公知的基础培养基配方。许多基础培养基配
方(可以从如American Type Culture Collection, ATCC;或Invitrogen 公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州获得)可用于培养此处的原代细胞，包 括但不P艮于Eagle's Minimum Essential Medium (MEM)、 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM )、 alpha modified Minimum Essential Medium (alpha-MEM) 、 Basal Medium Essentia" BME )、 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)、 BGJb培养基、F-12 Nutrient Mixture (Ham)、 LiebovitzL-15、 DMEM/F-12、 Essential Modified Eagle's Medium (EMEM)、 RPMI-1640、 Medium 199、 Waymouth's MB 752/1或Williams Medium E及其改进或组合。上述^l培;^基的组成在本领域是公知的， 并且针对培养的细胞有必要改进或调整M和/或补充物浓度的话，也在本 领域技术人员能力范围之内。在一个实施方案中，优i^&础培养基配方可 以是Williams Medium E，其是一种营养丰富的配方，被报il^体外能维 持成体肝脏细胞培养物。其他实施方案可以采用其他基础培养基配方，如 选自上述。
这种基础培养基配方包含哺乳动物细胞发育的必要成分，这本身是 众所周知的。例如但不受限制，这些成分可以包括无机盐(特别是含有钠、 钾、镁、钙、氯、磷以及可以是铜、铁、硒和锌的盐)、生理緩沖液(如 HEPES、碳酸氢盐)、核普酸、核普和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨 基酸、维生素、抗氧化剂(如谷胱甘肽)和碳源(如葡萄糖、丙酮酸，例 如，丙酮酸钠、醋酸，如醋酸钠)等。显而易见，许多可用基质是含有或 不含丙酮酸钠的低-葡萄糖配方。
用于培养中，基础培养基可以添加有一种和多种其他成分。例如， 额外的补充可以给细胞提供必要的微量元素以及用于最适生长和扩增的 物质。这种补充包括胰岛素、转铁蛋白、硒盐及其组合。这些成分可以包 含在盐溶液中，如，但不限于，Hanks'平衡盐溶液(HBSS )、 Earle，s盐溶 液。可添加其他抗氧化补充物，如P-巯基乙醇。由于许多^fiil基质已经含 有氨基酸，有些氨基酸可在后来补充，如L-谷氨酰胺，众所周知其在溶液 中不那么稳定。基质可以进一步补充有抗生素和/或抗真菌化合物，如代表 性地，青霉素和链霉素和/或其他化合物的混合物，例如但不限于，两性霉 素、氨节青霉素、庆大霉素、博莱霉素、潮霉素、那霉素、丝裂霉素、霉
酚酸、萘咬酸、新霉素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、嘌呤霉素、利
福平、壮观霉素、四环素、泰乐菌素和zeocin。
激素还可以有利地用于细胞培养，包括但不限于D-醛固酮、己烯雌 酚(DES)、地塞米松、雌二醇、氩化可的松、胰岛素、催乳素、孕激素、 生长抑素/人生长激素(HGH)、促甲状腺素、甲状腺素、L-甲状腺原氨酸 (thyronine)、表皮生长因子(EGF)和肝细胞生长因子(HGF)。肝细胞 也可以受益于利用了三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine/triiodithyronine )、 a-生育酚醋酸酯和胰高血糖素的培养。
脂质及脂质载体也可以用来补充细胞培养基。这种脂质和载体可以 包括，但不限于环糊精、胆固醇、白蛋白缀合的亚油酸、白蛋白缀合的亚 油酸和油酸、未缀合的亚油酸、白蛋白缀合的亚油酸-油酸-花生四烯酸、 白蛋白缀合的和未缀合的油酸等等。白蛋白可以类似地用于无脂肪酸的配 方。
还可以考虑在细胞培养基中补充哺乳动物的血浆或血清。血浆或血 清往往>^有活力和扩增所必须的细胞因子和成分。也可以考虑4吏用适当的
代血清。
术语"血浆，，如常规所定义的。血浆通常是从全血样本获得的，在
抽^UfeL液样本时或不久后，提供有或接触抗凝血剂，如肝素、柠檬酸(如，
柠檬酸钠或酸式柠檬酸葡萄糖)、草酸或EDTA以防止凝血。随后，通过 适当的技术，典型情况下通过离心，将血液样本的细胞成分从液体成分(血 浆)中分离出来。因此术语"血浆，，是指不构成人类或动物体一部分的成 分。
术语"血清"如常规所定义的。血清通常是从全血样本获得的，首 先让样品发生凝血，随后通过适当的技术，典型情况下通过离心，将所形 成的凝块和血液样品的细胞成分从液体成分(血清)中分离出来。惰性催 化剂，如玻璃珠或玻璃粉，可以促进凝血。有利地，可以通过本领域乂^ 的血清分离器(serum-separatingvessel; SST)命M^血清，所述SST含有 惰性的催化剂来促进凝血，还包括密度设定介于离心后液体成分与凝块和 细胞成分的密度之间的胶，从而简化了分离。作为替代，可以通it^uk浆 中去除抗凝剂和纤维蛋白来获得血清。因此术语"血清"是指不构成人类 或动物体一部分的成分。
分离的血浆或血清可直接用于本发明的方法。本发明的方法中，也 可以妥善保存分离的血浆或血清留作后用。典型情况下可以在较短的时间
内保存血浆或血清，如，长达大约l-2周，在高于血浆或血清各自凝固点 但低于周边环境温度的室温下保存。通常，该温度约15"C或以下，优选约
1oc或以下，更优选约5"c或以下，如，约5x:、 4x:、 3*c、 2匸或约1r;， 最优选约5t:或约4x:。作为替代，血浆或血清可以保存于低于各自凝固点 的温度，即冷冻保存。如本领域通常，用于冷冻保存血浆或血清的有利温 度可以是大约-70匸或以下，如，约-75x:或以下或约-8ox:或以下。这种温 度可有利防止保存的血浆或血清的任何解冻，从而保持其质量。不论血浆 或血清需要保存多长时期，都可以采用冷冻保存。但如果需要较长期储存
时，如超过数天或超过1-2周，冷冻保存则尤其适合。
保存或使用之前，可以加热灭活分离的血浆或血清。加热灭活在本 领域中主要用于去除补充物。热灭活通常包括，让血浆或血清逐渐冷却至
环境温度后，将血浆或血清在56匸下孵育30至60分钟，如30分钟，并 持续混匀。本领域技术人员知道上述过程的任何常规改进和需求。
任选地，也可在保存或使用之前将血浆或血清进行灭菌。通常的灭 菌手段可包括，如，通过一个或多个孔径小于lnm的过滤器来过滤，优选 小于0.5jim,如小于0.45拜、O眉阿、0.35阿、0.30阿、或0.25拜，更 优选0.2nm或更小，如0.15nm或更小，O.lOpm或更小。
用于本发明基质中合适的血清或血浆可包括人血清或血浆，非-人类 的动物的血清或血浆，优选非-人类的哺乳动物，例如，如，非人类的灵长 类动物(如狐猴、猴子、猩猩)、胎牛或成年牛、马、猪、羊、山羊、狗、 兔、小鼠或大鼠等的血清或血浆。在另一实施方案中，本发明预见了上述 血浆和/或血清的任意组合的用途。
因此，在一个实施方案中，可以从和获得原代肝脏细船目同的物种 生物体中获得血清或血浆。在一个非限制性实例中，人血清或血浆可用于 培养原代人类肝脏细胞。
在另一个优选实施方案中，基质包含血清或血浆，优选胎牛(小牛) 血清或血浆，更优选胎牛(小牛)血清(FCS或FBS)。
在另一个实施方案中，用于培养原代人类肝脏细胞的基质包括牛血 清或血浆，优选胎牛(小牛)血清或血浆，更优选胎牛(小牛)血清(FCS 或FBS )。
在一个实施方案中，基质包含约0.5 %和约40 % (V/V)之间的血清
或血浆或代血清，优选约5%和约20% (V/V)之间，如，约5%和约15 % (V/V)之间，更优选约8%和约12% (V/V)之间，如，约10%的血 清或血浆或代血清，尤其优选上述定义的血清或血浆。
在另一些优选实施方案中，用于培养原代人类肝脏细胞的基质包含， 量是约0.5%和约40% (V/V)之间，优选约5%和约20。/。 (V/V)之间， 如，约5%和约15% (V/V)之间，更优选约8%和约12% (V/V)之间， 如，约l(T/n的牛血清或血浆，优选胎牛(小牛)血清或血浆，更优选胎牛 (小牛)血清(FCS或FBS)。
在另一些实施方案中，基质可包含来自一种以上物种的血浆或血清。 例如，基质可包括来自和培养的原代肝脏细JJ^目对应的物种、另一物种的 血清或血浆的混合物。例如，用于培养人原代肝脏细胞的基质可包含Air 浆或血清的混合物，优i^Ajfii清，以及牛血浆或血清，优选牛血清。
此外，基质可优选包含至少一种外源性(即除了血浆或血清)添加 的生长因子。技术人员知il&础培养基(加入血清或血浆之前)的常规成 分，如，尤其是生理盐水、緩冲液、无机盐、氨基酸、碳源、维生素、抗 氧化剂、pH指示剂和抗生素在本领域中不被认为是生长因子或分化因子。 另一方面，血清或血浆是一种复杂的组成，可以包含一种或多种这样的生 长因子或分化因子。
此处所用术语"生长因子"；^指一类影响多种细胞类型增殖、生长、 分化、生存和/或迁移的，可以影响生物体发育、形态和功能变化的生物活 性物质，其单独作用或受其他物质调节。生长因子通常作为配体通过结合 细胞内存在的响应生长因子的受体(如，表面或细胞内受体)而发挥作用。 此处的生长因子可以尤其是包含一条或多条多肽链的蛋白质实体。
例如，而不是限制，术语"生长因子"包括成纤维细胞生长因子 (FGF )家族、骨形态发生蛋白(BMP )的家族、血小板源生长因子(PDGF) 家族、转化生长因子P (TGF-p )家族、神经生长因子(NGF)家族、表 皮生长因子(EGF)家族、胰乌素相关的生长因子(IGF)家族、肝细胞 生长因子(HGF)家族、造血生长因子(HeGF)、血小板衍化内皮细胞生 长因子(PD-ECGF)、血管生成素、血管内皮生长因子(VEGF)家族， 糖皮质激素等的成员。
一个优选实施方案中，基质含有一种生长因子，其是表皮生长因子 (EGF)家族成员。在另一个实施方案中，所述EGF家族成员选自双
调蛋白(amphiregulin )、 0细胞素、EGF、上皮调节蛋白、HB-EGF (肝 素结合表皮生长因子样生长因子)、NRG1(神经调节素-1 )异形体(isoform) GGF2、 NRG1异形体SMDF、 NRGl-a、 NRG1- P 、 TGFa、 tomoregulin-l 和TMEFF2。在一个尤为优选的实施方案中，基质包含EGF。
另一个实施方案中，基^质包含一种生长因子，其是胰岛素相关的生 长因子(IGF)家族成员。在另一个实施方案中，所述IGF家族成员选自 胰岛素、IGF1A (胰岛素样生长因子1A)、 IGF1B、 IGF2、 INSL3 (胰岛 素样3)、 INSL5、 INSL6和松弛素。在一个尤为优选的实施方案中，M 包含胰岛素。
另一个实施方案中，基质包含一种生长因子，其是糖皮质激素。在 另一个实施方案中，所述糖皮质激素选自地塞米松、氢化可的松、强的 松龙、强的松、曱基泼尼松(methylprednisolone)、泼尼松、曲安奈德、 皮质酮、氟轻松、可的松、倍他米松。在一个尤为优选的实施方案中，基 质包含地塞米松。
另一个优选实施方案中，基质包含任何两个或两个以上外源性添加 的生长因子或此处所定义的优选生长因子的组合。例如，而不是限制，基 质可以包括EGF和胰岛素，或EGF和地塞米松，或胰島素和地塞米松， 或单独的EGF、胰岛素和地塞米松；包含这些外源性添加的生长因子的基 质可优选包括上述实施方案中定义的血清或血浆。
在什么浓度下特定生长因子可以诱导尤其是对体外培养的细胞的作 用，并且这种浓度可用于上述生长因子，对于本领域技术人员而言这种浓 度是常识。例如，而不是限制，典型情况下可在大约0.1ng/ml和l吗/ml 之间，优选lng/ml和100ng/ml之间，如，约25ng/ml浓度下使用EGF; 典型情况下可在大约0.1將/ml和lmg/ml之间，优选约l吗/ml和100fig/ml 之间，如，约10吗/ml浓度下使用胰岛素；典型情况下可在大约0.1nM和 l|LiM，优选在大约lnM和100nM，如约10nM浓度下使用地塞米松。
一个优选实施方案中，尤其是在用于人类肝脏细胞的方法中，本发 明所用的生长因子可以是人生长因子。如此处所用术语"人类生长因子" 是指一种和天然存在的人类生长因子基^目同的生长因子。例如，当生长
因子是蛋白质实体时，其组成型肽或多肽可具有和天然存在的人类生长因 子一致的M酸一级序列。优选使用本发明方法的人类生长因子，预计这 种生长因子引发期望的对细胞功能的作用。
如所述的，本发明人已经发现通过持续培养原代肝脏细胞一段时期 (如上述定义的时期)，优选使用上述基质组成，出现本发明的祖细胞或 干细胞并增殖，而分化的肝脏细胞类型在延长的原代肝脏细胞培养中的优 势减少。不受任何假说限制，分化的原代肝脏细胞类型可以，例如，延长
培养时没能增殖、死亡和/或逆分化(retro-differentiation)。如实施部分所 详述的，可通过，其中，形态区分祖细胞或干细胞和原代细胞培养中存在 的其他细胞类型，根据本发明人的知识，所述形态表示为间充质或间充质 样形态，典型情况下，包括扁平形状、明显的细胞质和/或有一个或两个核 仁的卵原细胞核。
本发明人也发现可以通过改变培养基质进一步促进所述祖细胞或干 细胞原代培养的出现、增殖和富集，从而有利于进一步消除一种或多种分 化的肝细胞类型，尤其是肝细胞，肝细胞可以在分离的原代肝脏细胞培养 物中占据主导。在这种情况下，本发明的祖细胞或干细胞能够有利地增殖 以及成为原代肝脏细胞培养中的主导细胞类型。如，由于一种或多种分化 的细胞类型生理上的减弱或在培养期间被淘汰，分化的肝脏细胞类型可以 丢失；作为替代，由于一种或多种细胞类型在培养期间逆分化，分化的表 型可以被减弱。
当维持本发明的祖细胞或干细胞的增殖时(例如，可以容易地针对 不同细胞类型的通过目视检查细胞培养来判断)，可以使用任何有利于消 除一种或多种分化的肝脏细胞类型尤其是肝细胞的基质。例如，如本发明 所阐述的， 一种变化可以是使用含有高葡萄糖浓度的基础培养基，如浓度 介于3000mg/l和6000mg/l之间，优选4000mg/l和5000mg /1之间，以及 典型情况下约4500mg/l。另一种变化可以是没有外源性添加(即，除了血 清或血浆中存在的)的生长因子。例如，基质中至少没有外源性添加的胰 島素、地塞米松和/或EGF。另一种变化可以是使用除Williams Medium E (尤其适合长期培养原代肝脏细胞类型，尤其是肝细胞)以外的基础培养 基。例如，而不是限制，如MEM、 DMEM、 alpha-MEM或EMEM的基 础培养基的使用可以有优势。需要了解的是，可以按上述一种、 一种以上 或所有的方式改变基质。还需要了解的是，基质包含上述的血清或血浆或 代血清，其中包括上面详述的优选实施方案。
在一个实施方案中，可以在培养原代肝脏细胞一开始加入有利于消 除上述一种或多种分化的肝脏细胞类型并促进本发明祖细胞或干细胞的 基质。在另一个实施方案中，可以在延长培养原代肝脏细胞期间以此方式
改变基质。例如，可以在接种原代肝脏细胞之后的约1天、约2天、3天， 如，约4或5天，或起始于约6天，例如，如，约7或8天，或起始于约 9天，例如，如，约10或11天，起始于约12天，如，约13或14天，更 优i^始于约15天，如，约16、 17、 18、 19或20天依此方式改变M。 在一个示例性实施方案中，可以在接种后的16至32小时之间，如约24 小时，依此方式改变基质。在一个实施方案中，依此方式改变基质后，可 以如，每隔2至6天，优选每隔2至4天，如，每隔3或4天iH更新基 质。
因此，在一个示例性优选实施方案中，铺板之后可以在有助于原代 肝脏细胞存活的基质中培养原代肝脏细胞，所述原代肝脏细胞包括分化的 肝脏细胞类型，如肝细胞，在上述时间时，可以将基质改变为有助于消除
细胞的基质。例如，原代肝脏细胞可先培养于具有一种、多于一种或所有 如下特征的基质中包含一种营养丰富的基础培养基，例如，如Williams Medium E，包含低浓度葡萄糖，如介于500 mg/1和2999mg/l之间，优选 lOOOmg/1和2000mg/l中间，包括至少一种外源性添加的生长因子，优选胰 岛素、地塞米木^和EGF中的一种、多于一种或所有。此后，在上述时期， 可以将基质改变为包括一种、多于一种或所有如下特征的基质包含除 Williams Medium E以外的基础培养基，例如，如MEM、 DMEM、 alpha-MEM或EMEM的基础培养基，包含高(浓度)葡萄糖，不含外源 性添加的生长因子或至少不含地塞米松、胰岛素和/或EGF。需要了解的 是，上U质将包含上述的血清或血浆或代血清，其中包括上面详述的优 选实施方案。
如所述，上述原代肝脏细胞的培养导致在培养物中本发明的祖细胞 或干细胞的发生和增殖。可以方便地维持所述培养直至出现的本发明的祖 细胞或干细胞已经充分增殖。例如，可以持续所述培养直至细胞群到达一 定的汇合程度，如至少40%，优选至少50%，更优选至少60%以及甚至 更优选至少70%,如，至少80%,或至少卯°/。或以上的汇合。此处所用 术语"汇合"是指培养细胞的密度，该密度下彼此接触的细胞基本覆盖所 有可供生长的表面(即，完全汇合)。
勿詹A
上述原代肝脏细胞培养以及本发明祖细胞或干细胞的发生和增殖之
后，如此获得的细胞群可以至少传代一次。
本发明人惊喜地发现，出现在原代细胞培养中的本发明的祖细胞或 干细胞在传代之后基本保持其增殖能力，从而允许方便地进一步富集这些 细胞的细胞群。方便起见，所述方法的这一阶段所进行的传代此处是指本 发明方法中的"首次传代"(传代1)。细胞可传代至少一次，优选两次或 两次以上。此处，传代l之后的每次传代以数目增加一个来表示，如传代
2、 3、 4、 5等等。
传代时，培养细胞彼此解离(detach)并且从培养基质中分离。可 以按照本领域公知的(方法)进行细胞的解离和分离，如用蛋白酶进行酶 处理(如选自胰蛋白酶、M^、酶，如I、 II、 III或IV型，*酶、链* 白酶(pronase )、木瓜蛋白酶等)、用二价离子螯合剂(如，EDTA或EGTA) 或机械性处理(如，通过小孔径移液器或移液头反复吹打)，或这些处理 的任意组合来处理。优选，培养细胞的解离和分离将产生相当比例的单个 细胞。例如，40%或以上回收的细胞是单个细胞，如至少5(T/q,优选至少 60%，如，至少70%,更优选至少80%，如，至少90%或至少有95%的 回收的细胞是单个细胞。此夕卜，其余的细胞可以以细胞团或簇的形式存在， 其中大部分可以含有相对较少的细胞，如，平均多于l个至IO个之间的细 胞，如少于8个细胞，优选少于6个细胞，更优选少于4个细胞，如少于 3个或少于2个细胞。
一般来说， 一种适于解离和^t细胞的方法应保留细胞活力。优选， 解离和^L^获得的细胞悬液可以包括至少60%的活细胞，如，至少70 % ，更优选至少80 % ，最优选至少卯％至100 %的活细胞。本领域技术人 员知道通常选择何种条件确保期望程度的细胞解离和分散，保存细胞活 力。
之后，将解离并分离的细胞(典型情况下，等渗緩冲或基质中的悬 液)重新接种至基质上，使细胞粘附于其上，如上所述随后培养于基质中 来维持本发明祖细胞或干细胞进一步增殖。典型情况下，以lxl(^和lxl06 个细胞/cm2之间，如lxl()2和lxl06个细胞/cm2之间，优选lxl()3和lx105 个细胞/cm2之间，如，约lxl()3个细胞/cin2，约5xl()3个细胞/cm2,约lx104 个细胞/cm2，约5xl()4个细胞/cm2，或约lxl()5个细胞/cm2，优选约lx103 和lxlO"个细胞/mi^之间的接种密度重新接种细胞。
作为替代，以约1/8和1/2之间，优选约1/4和1/2之间，更优选约
1/2或约1/3的分割比(splitting ratio)重新接种细胞。分割比表示传代的 细胞的比例，将其接种至空的(典型情况下，新的)培养容器中和获得细 胞的容器相同的表面区域。
重新铺板细胞的粘附基质如本说明中详细描述的。基质可优选和铺 板原代肝脏细胞的基质相同(包括上述这种基质的优选实施方案)或不同。 优选这种基质A^^蛋白，尤其是上述I型^f、蛋白。
进一步培养传代的细胞直至细胞成为至少50%汇合的，如，至少60 %，优选至少70%，例，至少80%，更优选至少卯％，如，至少有95% 或甚至完全汇合的。
本发明人已经发现所述方法的这一阶段获得的细胞群包含相当比例 的本发明的祖细胞和干细胞，细胞可以有利地至少再传代一次(即至少 第二次传代)，基本如上所述的第一次传代。通过形态和/或分子标志物判 断，这进一步增加了本发明祖细胞和干细胞在细胞群中的比例，甚至获得 基本均一的本发明祖细胞和千细胞的群。
因此，根据本发明，接种和培养原代肝脏细胞之后，引发祖细胞或 干细胞在所述培养物中的发生和增殖，培养的细胞传代至少一次(即，首 次传代)优选至少两次(即第一次和第二次传代)，任选地更多次传代(即 第一次、第二次以及后续每次传代)。例如，接种原代肝脏细胞之后，细 胞可以传代至少一次、至少2次、至少3次、至少4次、或至少5次。在 另一个实施方案中，接种和培养原代肝脏细胞之后，细胞可以传代2至10 次之间，如，2至8次之间，或2至5次之间。在和第一次传代，如上述， 基本一致或类似的条件下进行额外的传代(如，细胞解离和a、重新接 种、基质等)和培养(如，基质、基质更换、最终的汇合等)，其中包括 其优选实施方案，并且包括对于本领域技术人员而言显而易见的改进。
因此本发明的方法提供包含相当比例的如本公开所定义的祖细胞或
干细胞的细,，所i^a细胞或干细胞的比例随着原代肝脏细胞延长培养
的一次或多次传代而增加。典型情况下，所^#将包含至少约10%,如， 至少约20%所述祖细胞或干细胞，但发明人t现通常将获得更高比例的所 i^细胞或干细胞，如，至少30 % 、至少40 % 、至少50 % 、至少为60 % 、 至少70%、至少80%、或至少至少卯％或以上。此外，方法甚至可以产 生基本均一或均一的所述祖细胞或干细M。可通过任何合适的标准方法
评价祖细胞或干细胞的比例，如通过流式细胞仪。 舉持處谬辨勿應
当通过本发明的方法获得含有肝脏来源的本发明的祖细胞或干细胞 的群，并且可以进而富集所述祖细胞或干细胞时，可接下来在允许所述祖 细胞或干细胞生长和倍增而不分化的条件下维持和/或增殖细胞群。这种条 件可以是，如，用于获得祖细胞或干细胞的条件。能够评判是否发生细胞 分化的本领域技术人员可轻易建立其他条件。这有助于增加由于后续用途 的可用祖细胞或干细胞的数目。
本发明人已经发现可以冻存(正如对于哺乳动物细胞而言这是>^ 的)原代或任何其他后续传代用于随后的用途。
本发明人已经发现原代细胞培养中出现的本发明的祖细胞或干细胞 在冻融之后基本保持增殖能力。可以将所述细胞以冷冻浓缩细胞悬液的形 式保存，如本领域公知的，在如本说明书中所述的相同条件下解冻并重新 铺板(细胞)。
本发明的祖细胞或干细胞
本发明人发现通过如上所述培养以及优选还通过传代原代肝脏细胞 获得的的细胞群包含本发明肝脏来源的祖细胞或干细胞，其共表达(即对
以下呈阳性)至少一种间充质标志物，尤其是例如CD卯、CD73、 CD44、 波形蛋白和a-平滑肌肌动蛋白(ASMA)中的一种、多于一种，如2、 3、 或4种或全部，以及肝细胞标志物白蛋白(ALB)以及可能地一种或更多 种其他肝脏或肝细胞标志物，优选CD29、曱胎蛋白(AFP)、 a-l抗胰蛋 白酶和/或MRP2转运蛋白中的一种、多于一种或全部。
在一个更具体的实施方案中，本发明肝脏来源的祖细胞或干细胞可 以共表达(即对以下呈阳性)至少一种间充质标志物，尤其是CD卯、CD73、 CD44、波形蛋白和a-平滑肌肌动蛋白(ASMA)中的一种、多于一种，如 2、 3、或4种或全部，以及肝细胞标志物白蛋白(ALB)以及可能地一种 或更多其他肝细胞标志物，优选a-l抗胰蛋白酶和MRP2转运蛋白中的一 种或两种，以及至少一种肝脏标志物CD29或甲胎蛋白(AFP)。
任何所述成体肝脏祖细胞或干细胞可进一步表达一种、多于一种或 所有如下预示着肝细胞-样性质或功能的分子G6P、 CYP1B1、 CYP3A4、 HNF画4、 TDO、 TAT、 GS、 GGT、 CK8、 EAAT2。所述成体肝脏祖细胞 或干细胞还可具有一种、多于一种或全部如下特征至少itifi^示志物CD45 和CD34为阴性，也可以是一种或多种其他造血标志物例如CD105和 HLA-DR为阴性；胆管细胞上皮标志物细胞角蛋白-19 (CK-19)阴性，可 能地更多上皮标志物为阴性；至少未分化的干细胞标志物CD117和Oct-4 为阴性，以及也可以一种或多于一种胚胎干细胞标志物为阴性；低水平表 达的甲胎蛋白(AFP)。优选所述成体肝脏祖细胞或干细胞可以具有间充质 样形态，尤其包括以单层、扁平形状、明显的细胞质和/或具有一个或两个 核仁的卵圆形核中的一种、多于一种或全部。
通过其CD (common determinant,"共同决謹")名称鉴定特定细 胞表面分子是本领域中公知的。本应用中的其他名字或名称的使用如本领 域中所确定的。在实施例中也可找到具体分子的其他说明。
其中当认为一个细胞对特定标志物呈阳性时，il^示，当对比合适 的对照进行适当测量时，本领域技术人员将确定该标志物的明显信号的出 现或迹象，如抗体可检测的或通过逆转录聚合SI^式^JL检测。其中所述 方法允许定量评价该标志物，阳性细胞平均可产生显著区别于对照的信 号，如，但不受限制，至少^1对照细胞产生的信号的1.5倍以上，如，至 少2倍、至少4倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至 少50倍甚至更高。
可以使用本领域公知的任何合适的免疫学技#测细胞特异性标志 物，如流式细胞仪、免疫细胞化学或亲和吸附、Western印迹分析、ELISA 等，或通过任何合适的测量标志物mRNA量的技术，如Northern杂交、 半定量或定量RT-PCR等。
本领域技术人员知道可以收获(如通过合适的解离技术)通过本方 法获得的细IW，其中包括上述祖细胞或干细胞，并可选地进一步富集那 些展示特异性特征(通过本领域公知的方法)的细胞(所以这种细胞可以 从所述群中分离出来)。例如，而不是限制，呈现一种或多种本发明祖细 胞或干细胞表面分子特征的细胞，如， 一种或一种以上上面列出的标志物， 可通过抗这种分子的特异性(标签)抗体或其他识别试剂来识别，并从不 展示这种表面分子的细胞中分离出来，如通过荧光激活细胞分选或利用亲 和力结合至，如，柱、珠或表面(板)。富集细胞的任何其他方法都包含 在发明范围之内。
另一个方面，本发明人因而实现了一种新型的分离来自成体肝脏的 祖细胞或干细胞(脊推动物，优选哺乳类动物，更优i^A类细胞)的方法，
所述祖细胞或干细胞特征在于共表达(即对以下呈阳性)至少一种间充质
标志物，尤其是CD卯、CD29、 CD44、波形蛋白和a-平滑肌肌动蛋白 (ASMA)中的一种、多于一种，如2、 3、或4种或全部，以及肝细胞标 志物白蛋白(ALB)以及可能地一种或更多种其他肝细胞标志物。所述成 体肝脏祖细胞或干细胞还可具有一种、多于一种或全部如下特征至少对 造血标志物CD45、 CD34和CD117为阴性，以及还可以对一种或多种其 他造血标志物为阴性；细胞角蛋白-19 (CK-19)为阴性；间充质样形态， 尤其包括以单层生长、扁平形状、明显的细胞质和/或具有一个或两个核仁 的卵圆形核中的一种或全部。
因此，在一个具体实施方案(1)中，分离的肝脏来源的祖细胞或干 细胞共表达ALB以及CD90、 CD73、 CD44、波形蛋白和a-平滑肌肌动蛋 白(ASMA)。在另一个实施方案(2)中，肝脏来源的祖细胞或干细胞共 表达ALB和a-l抗胰蛋白酶以及CD卯、CD44、波形蛋白和a-平滑肌肌动 蛋白(ASMA)。在另一个实施方案(3)中，肝脏来源的祖细胞或干细胞 共表达ALB和MRP2以及CD卯、CD73、 CD44、波形蛋白和a-平滑肌肌 动蛋白(ASMA)。在另一个实施方案(4)中，肝脏来源的祖细胞或干细 胞共表达ALB、 a-l抗胰蛋白酶和MRP2以及CD卯、CD44、波形蛋白和 a-平滑肌肌动蛋白(ASMA)。在另一个实施方案(5)中，上述实施方案 (1)至(4)中任意一项的肝脏来源的祖细胞或干细胞还表达CD29。在 另一个实施方案(6)中，上述实施方案(1)至(4)中任意一项的肝脏来 源的祖细胞或干细胞还表达曱胎蛋白。在另一个实施方案(7)中，上述实 施方案(1)至(4 )中任意一项的肝脏来源的祖细胞或干细胞i^达CD29 和曱胎蛋白。
在另一些实施方案(8)中，上述实施方案(1)至(7)中任意一项 的肝脏来源的祖细胞或干细胞是CD45和CD34阴性。在另一些实施方案
(9)中，上述实施方案(1)至(7)中任意一项的肝脏来源的祖细胞或干 细胞是CD117和Oct-4阴性。在另一些实施方案(10)中，上述实施方案
(1)至(7)中任意一项的肝脏来源的祖细胞或干细胞是CD45、 CD34、 CD117和Oct-4阴性。
在另一些实施方案(11)中，上述实施方案(1)至(10)中任意一 项的肝脏来源的祖细胞或干细胞是CK19阴性。在另一些实施方案(12) 中，上述实施方案(1)至(10 )中任意一项的肝脏来源的祖细胞或干细胞 是CK7阴性。在另一些实施方案(13)中，上述实施方案(1)至(10)
中任意一项的肝脏来源的祖细胞或干细胞是CK19和CK7阴性。
在另一些实施方案(14)中，上述实施方案(1)至(13)中任意一 项的肝脏来源的祖细胞或干细胞表现间充质样形态，尤其包括以单层生 长、扁平形状、明显的细胞质和/或具有一个或两个核仁的卵圆形核。
在另一个实施方案(15)中，上述实施方案(1)至(14)中任意一 项的肝脏来源的祖细胞或干细胞还表达一种、多于一种或所有如下预示着 肝细胞样的性质或功能的分子G6P、 CYP1B1、 CYP3A4、 HNF-4、 TDO、 TAT、 GS、 GGT、 CK8、 EAAT2。
在另一个实施方案(16)中，上述实施方案(1)至(15)中任意一 项的肝脏来源的祖细胞或干细fci表达一种、多于一种或所有如下分子 CD49e、 CD13、 CD54、 I类主要组织相容性复合体(MHC ) (HLA-ABC )。
在另一个实施方案(17)中，上述实施方案(1)至(16)中任意一 项的肝脏来源的祖细胞或干细胞是一种、多于一种或所有如下分子阴性 的CD105、 HLA國DR、 CD133、 CD49b、 CD49f和CD140。
在另一个实施方案(18)中，上述实施方案(6)至(17)中任意一 项的肝脏来源的祖细胞或干细胞低7jC平表达甲胎蛋白(AFP)。优选地，低
水平基本上对应于正常肝细胞中测量的表达水平。优选，低于致瘤修饰的
人类肝脏细胞系(如HepG2)中测量的表达水平。
本发明分离的肝脏来源的祖细胞或干细胞可以优选展示干细胞特 征，尤其是典型情况下展示至少有限的(可以基本无限的)自我更新，即 增殖而不分化的能力。例如，而不是限制，本发明的祖细胞或干细胞可增 殖至少4次传代，如，至少6次传代、至少10次传代、或至少20次传代、 至少50次传代或更多。
另一个方面，本发明提供通过方法可获得的或直接获得的分离的成 体肝脏祖细胞或干细胞、包含所述成体肝脏祖细胞或干细胞的细胞系和/ 或细胞群，所述方法包含(a)优选两步胶原酶法，M象解离成体肝脏 或其部分，优选脊推动物、哺乳动物以及更优l人类对象，以便从所述成 体肝脏或其部分形成原代细胞群；(b)将原代细胞群接种到Williams Medium E中覆盖有I型胶原的基质上，其中含有胎牛血清，优选10% (V/V)、 EGF,优选25ng/ml、胰岛素，优选10pg/ml、地塞米松，优选 1^; (c)允许细胞从原代细Jf^粘附至所i^质上至少24小时，而后将 基质更换为含有(b)中组成的新鲜基质；(d)在(c)中所述基质上培养
细胞两周(优选15天)；(e)将基质更换为含高(浓度)葡萄糖和FCS的 DMEM,优选10%，继续培养细胞，从而本发明的祖细胞或干细胞发生 并且增殖；(f)任选地并且优选地，使细胞得到约70%的汇合并且细胞至 少传代一次，优选至少2次，其中细胞接种至(b)中所述J^质并且在(e) 中所U质培养。
步骤(a)可优选包括通过让细胞经过至少一个孔径为0.25mm的筛 来解离原代细胞，优选通过一系列筛目艮逐渐减小至0.25mm的筛，如，实 施例1中的。
步骤(e)的基质可优选在一个实施方案中不包含地塞米松、胰岛素 和EGF。在另 一个实施方案中不包含任何外源性添加的生长因子。
一方面，本发明还涉及上述方法。
另一方面，本发明提供按照实施例1中陈述的^Mt过程可获得的或 直接获得的分离的成体肝脏祖细胞或干细胞、包含所述成体肝脏祖细胞或 干细胞的细胞系和/或细胞群。
另一方面，本发明人通过本发明的方法，尤其如实施例1中所记载 的，建立了成体人肝脏祖细胞或干细胞细胞群(细胞系)，并且根据布达 佩斯条约(Budapest Treaty)于2006年2月20日将所述分离的细胞系保 藏于比利时微生物合作保藏中心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM/LMBP)),保藏号为LMBP 6452CB (由国际保藏 机构授予；鉴定参考由保藏人给出ADHLSC)。因此，本发明的一方面 涉及保藏于BCCM收录号为LMBP 6452CB (此处为"LMBP 6452CB" 细胞系)的分离的细胞、细胞系和细JIW，亚系包括克隆亚系，还涉及其 后代，其中包括其已分化后代，尤其是肝细胞或由其制备的肝细胞样细胞， 还涉及其遗传修饰的衍生物。
本领域技术人员知道根据本发明的方法从成体人类肝脏获得的祖细 胞或干细胞、包含所述祖细胞或干细胞的细胞系和细胞群可具有生物性 质，尤其是和上述保藏的细胞系一致或类似的增殖和分化能力、细胞形态 和/或标志物表达，尽管它们可以在遗传上有差别(由于人之间的正常遗传 变异)。因此，具有和保藏的细胞群一致或类似生物性质的祖细胞或干细 胞或细胞群，尤其是来自肝脏的，也包括在本发明范围内。
另一个方面，本发明提供包含分离的成体肝脏的祖细胞或干细胞的 细胞群，所述细胞或干细胞具有上述特征，任选地经过进一步修饰，如遗
传改造。在一个实施方案中，所述细胞群可包含约5%或以上，如，约10 %或以上的所述祖细胞或干细胞，约2(T/。或以上、约30%或以上、约40 %或以上、约50%或以上、约60%或以上、约70%或以上、约80%或以 上、或约卯％或以上的祖细胞或干细胞，或和所述祖细胞或干细胞基本均 一或均一的群。
另一方面，本发明提供通过增殖肝脏来源的本发明的祖细胞或干细 胞，(任选地经过进一步修饰，如遗传改造)而建立的细胞系。这种增殖 可以来自一种祖细胞或干细胞(克隆细胞系)或来自多于一种细胞。
另一方面，本发明提供通过上述本发明的方法(包括其优选实施方 案)可获得的或直接获得的分离的成体肝脏祖细胞或干细胞、包含所述成 体肝脏祖细胞或干细胞的细胞系和/或细胞群。
在一个具体实施方案中，因此本发明提供从成体正常(人)肝脏分 离活性的祖细胞间充质-样干细胞的方法(图1)。干细胞能够在培养基中 增殖，并表达多种肝脏细胞类型的标志物，例如，白蛋白(肝细胞)、波 形蛋白(星状细胞)、a-平滑肌肌动蛋白(ASMA)(图2A)。他们不具有 胆的表型，正如阴性的细胞角蛋白19免疫染色和RT-PCR分析所示的(图 2B)。利用流式细胞>(^检测时，ADHLSC对CD45、 CD34和CD117显阴 性，表示其未被淋巴itii镨系污染。相比之下，ADHLSC对CD卯、CD29 和CD44，间充质系的标志物显阳性。
在一个实施方案中，所述细胞在胰蛋白酶/EDTA处理后能保持其增 殖能力。在限定的基质中孵育细胞允许这些细胞特异性分化为肝细胞(图 3)。按照其他特异性标准，它们无法转分化成骨细胞或脂肪细胞，如利用 专能(multipotent)人间充质骨髓细胞所观察到的。其增殖的能力，以及 他们的肝脏特异性^吏得肝脏细胞移植的疗效和安全性增加。此外，由于其 源自成体，这些干细胞可避免胚胎细胞相关的免疫、伦理和致癌的问题。
本发明祖细胞或干细胞的分化
除了检测细胞标志物，研究细胞在体外和/或在体内的分化可以提供息。
本发明AJi发现，通过上述方法获得的来自肝脏的祖细胞或干细胞 可以具有特异性分化能力。具体而言，干细胞可以分化成肝细胞或肝细胞 样细胞。在另一个实施方案中，所述细胞不分化为中胚层(间充质)细胞类型，例如，如，骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、结締组织细胞、肌腱细
胞(tendonocyte )、月旨肪细胞或基质细胞(stromal cell )。
本发明的分离的成体肝脏祖细胞或干细胞、包含所述成体肝脏祖细 胞或干细胞的细胞系和/或细胞群(尤其要指出，虽然如此但不限于， LMBP6452CB系)、或其后代，可以有利地经诱导而分化成肝细胞系的细 胞，尤其是肝细胞或肝细胞样细胞。这种分化能够发生在体内、或体外或 离体。因此，本发明还提供从本发明分离的祖细胞或干细胞中产生肝细胞 或肝细胞样细胞的方法，以及提供获得的肝细胞或肝细胞样细胞。
在一个具体实施方案中，本发明分离的肝脏来源的祖细胞或干细胞 因此特征在于其分化成肝细胞或肝细胞样细胞的能力以及缺乏朝中胚层 细胞类型(例如，如骨细胞和脂肪细胞)分化的能力。
本领域技术人员知道，可以在体外、离体或体内观察到朝某特异细 胞类型分化的能力或缺乏这种能力。通过实例，如本领域公知的，在体外 或离体通过将细胞暴露于含特异性分化的基质中来评价分化。否则，可以 在体内通过l^的命运来评估所引入的(细胞)的分化(如，移植的、注 射的、或施用的细胞)。本领域技术人员通it^型原则(包括但不限于细 胞形态、蛋白标志物的表达、和/或特定的代谢活性或其他生理通路)能够 识别朝着特定细胞类型的分化。
分化成肝细胞镨系的细胞可以有利地在细胞因子和生长因子(可以 是肝脏-特异性的)存在的条件下发生。例如，肝细胞生长因子(HGF)或 扩散因子(scatter factor)是公知的促进向肝细胞表型分化的细胞因子。 相似的， 一个其他细胞因子的非限制性列表包括表皮生长因子(EGF)、 碱性FGF、胰岛素、烟酰胺、制瘤素(oncostatin) M、地塞米松、HDAC 抑制剂(如丁酸钠)、二甲基亚砜、维生素A、或基质成分，如硫酸肝素， 上述这些也参与朝向肝细胞的分化中。诱导肝细胞分化在本领域是>^知 的，并且可以被技术人员进一步优化。
可以通过本领域公知的方法进行鉴定以及随后从其未分化的对应物 (counterpart)分离分化的细胞。例如，通站使得分化细胞数目超出未 分化细胞的条件下选择性培养细胞来鉴定已被诱导分化的细胞。相似地， 通过未分化的对应物没有的形态学变化和特征来鉴定分化的细胞，如细胞 的大小、形状或细胞内细胞器分布的复杂性。还考虑的鉴定分化的细胞的 方法是通过特异性蛋白质标记物的表达，如细胞表面标志物。可以通过，
如流式细胞仪、ELISA和/或磁珠，来实现这些细胞的检测与分离。逆转 录酶链式反应(RT-PCR)技术也可用来监测基因表达响应分化的变化。 此外，应用微阵列技术的全基因组分析可用于鉴定分化的细胞。
本发明祖细胞或干细胞的遗传改造
可以进一步修饰所述成体肝脏祖细胞或干细胞，如上述的遗传^。 本发明还包括成体肝脏祖细胞或干细胞的后代，包括已分化后代。
在一个实施方案中，为了提高获得的本发明祖细胞或干细胞的复制 能力，如本领域公知的，可以将细胞端粒化(telomerised)。如果细胞被任 何物种的编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸以TERT在细胞中转录并 且翻译的方式遗传改造的话，则细胞被描述为被"端粒化"。该术语还用 于原本已被改造了的细胞的后代，其继承了以更高水平表达TERT编码区 的能力。典型情况下TERT编码序列取自或改造自哺乳动物TERT基因， 如下例如人类和小鼠TERT所示。可通过用适当的载体遗传改造细胞来将 其端粒化，从而以更高水平表达端粒酶催化的成分(TERT)。尤其合适的 是如W01998/14592提供的人端粒酶催化成分(hTERT )。对于某些应用， 可以使用其他TERT序列。还提及了细胞永生化的其他方法，如用编码 SV40大T抗原的DNA (US 5，869，243， WO 1997/32972 )、用Epstein Bar 病毒感染、引入原癌基因如myc和/或ras、引入病毒复制基因如腺病毒 Ela、以及和具有期望表型的永生化细胞系融合对细胞进行遗传改造。当 细胞用于治疗目的时，通常不太适合用原癌基因或肿瘤病毒(oncovirus) 产物转染细胞。
通常，当考虑将所述细胞或其后代(包括其分化的后代)用于治疗 时，如这种细胞将被引AA或动物尤其是人体，优选不通过端粒化或其他 永生化方法^tit本发明的祖细胞或干细胞。
本发明中，如基本上本领域所公知的，在后续应用如治疗或研究之 前，可以用目的核酸稳定或瞬时转染或转化获得的来自肝脏的祖细胞或干 细胞或其后代。目的核酸序列可包括但不限于，如，那些编码提高治疗中 有用的细胞类型(如源自本发明的祖细胞或干细胞的细胞类型，尤其A^f 细胞或肝细胞样细胞)的生长、分化和/或功能的基因产物的序列，或递送 治疗性基因至这种细胞施用或^部位的序列。
例如，而不是限制，可以^tit获得的祖细胞或干细胞或其后代来组 成型或诱导过表达多肽，所述多肽通常由肝脏细胞尤其是肝细胞表达，但是在患者中缺陷或缺失。这种缺陷标志着患者的病理状态。施用如此改造 的细胞之后可恢复蛋白质的生产，从而有助于治疗患者。例如，祖细胞或 干细胞或其后代可以含有编码代谢蛋白质如鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀
酸合成酶、精^J^t珀酸裂解酶、精氨酸酶、氨曱酰磷酸合成酶、N-乙酰 谷氨酸合酶、谷氨酰胺合成酶、糖原合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、琥珀, 氢酶、葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、乙酰CoA羧化酶、脂肪酸合成酶、丙氨 酸氨基转移酶、谷氨,氢酶、铁蛋白、低密度脂蛋白(LDL)受体、P450 酶、和/或乙醇脱氢酶的异源DNA。作为替代，细胞可以含有编码分泌的 血浆蛋白如白蛋白、转铁蛋白、补体、成分C3、 a2-巨球蛋白、纤维蛋白 原、XIII因子、IX因子、al-抗胰蛋白酶等的DNA。
肝脏是产生很多分泌蛋白的中心。它在解剖上以这样一种方式与循 环系统联系起来，即允许各种蛋白质高效释放i^血流。因此，相对于通 常产生编码有系统性作用的蛋白质的特定细胞类型，尤其如果m^将基因 整合至这些细胞时，将所述编码基因插入到本发明的肝脏细胞中。例如，
基因产物至循环系统中。
使用传统的基因转移方法将核酸引入细胞。引入一种基因的确切方 法对于本发明而言不是至关重要的。例如，将DNA引入细胞的物理方法 包括显微注射和电穿孔。化学方法，如磷酸钩共-沉淀和将DNA掺入脂质 体也是将DNA引入哺乳动物细胞的标准方法。也可以考虑病毒转染。使 用标准载体引入DNA，如那些来自鼠和禽逆转录病毒的载体(如，见 Gluzman等,Viral Vectors, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y.， 1988 )。本领域公知的标准DNA重组方法(见，如，Ausubel 等,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989)以及基因治疗用病毒载体已经得以JL艮并成功用于临床(见，如， Rosenberg，等，N. Engl. J. Med, 323:370 1990 )。
本发明的祖细胞或干细胞的用途
分离的源自肝脏的本发明的祖细胞或干细胞、包含所述祖细胞或干
泛考虑上述定义的任何成体肝脏祖细胞或干细胞，尤其是通过上述定义的 方法可获得的或直接获得的细胞、表现出上述限定特征的细胞、以及 LMBP6452CB细胞系，优选成体来源的人肝脏干细胞系(ADHLSC);其
后代；或其遗传改造的衍生物)，其包括但不限于
—使用根据本发明的分离的祖细胞或干细胞或其群，为了治疗肝脏代谢
缺陷、肝脏退化性疾病(liver degenerative disease)或暴发性肝功能衰竭 (fulminant liver failure)而进行肝脏细胞移植，
—使用根据本发明的分离的祖细胞或干细胞或其群来制备生物-人工肝脏 装置，
—通过在动物中移植根据本发明分离的祖细胞或干细胞或其群来制备人 类肝脏疾病的动物模型，
—通过根据本发明分离的祖细胞或干细胞或其群来制备体外毒理学、药 理学动物模型，
—在根据本发明分离的祖细胞或干细胞或其群上测试新药，包括用于人 类肝炎病毒的抗病毒药物。
例如，分析脾移植ADHLSC (LMBP 6452CB系)的uPA+/+-SCID
和SCID小鼠肝脏，表明这些细胞能够移植并且分化为成熟肝细胞(图4
和5)。此外，在这些移植10周后的移植小鼠血清中检测到人白蛋白，而 没有检测到甲胎蛋白7JC平。
根据本发明的祖细胞或干细胞(特别要说的是，当然包括但不限于 LMBP 6452CB系)可用于先天性代谢障碍的移植、肝功能衰竭的动物模 型或人类病毒性肝炎动物模型的移植。本发明的细胞因此可以用于肝J3^目 关疾病的治疗，包括但不限于肝功能衰竭、肝炎、先天性代谢的障碍。
在一个示例性实施方案中，如实施例1中所示，本发明人证明了， 当通过脾内注射如免疫-缺陷哺乳动物(更优选啮齿动物，尤其是小鼠或大 鼠)来施用时，本发明的AJf脏祖细胞或干细胞保持其增殖能力并移^ 宿主肝脏中。因此在一个实施方案中，将含有本发明的祖细胞或干细胞的 群，优选来自人类(特别要说的是，当然是但不限于LMBP6452CB系)， 引入(如通过注射)并且允许^遗传或化学改造的免疫缺陷哺乳动物中， 从而获得动物模型。优选地，这种群可以包含至少2 x 106个本发明的细胞。
干细胞的肝脏移植的其他方式。
如实施例1中所详述的，移植的细胞没有过度增殖，从而低估了其 在人类或其他动物(优选哺乳动物)细胞移植中的优势。
本发明还包括使用根据本发明的分离的祖细胞或干细胞或其群(特
别要i兌的是，当然包括但不限于LMBP 6452CB系)用于如下目的
—移植肝脏祖细胞或干细胞来治疗基于肝脏的先天性代谢缺陷这种疾 病的非完全实例包括苯丙酮尿症和其他氨基酸代谢疾病
Uminoacid叩athies )、血友病和其他凝血因子缺陷、家族性高胆固醇血症 和其他脂质代谢紊乱、尿素循环障碍、糖原贮积病(glycogenosis),半乳 糖血症、果糖血症(fructosemia )、酪氛酸血症(tyrosinemia )、蛋白质和 碳水化合物代谢缺陷、有机^l症、线粒体疾病、过氧化物酶体和溶S^ 失常、蛋白质合成异常、肝细胞转运蛋白缺陷、糖基化缺陷等，
—移植根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞来治疗获得性肝脏退行性疾
病，
—使用根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞来治疗暴发性肝功能衰竭和急 性或慢性肝功能衰竭，
-在生物人工肝脏装置和肝脏辅助装置中使用根据本发明的肝脏祖细胞 或干细胞，
—通过在小型和大型动物中移植根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞获得 的人类肝脏疾病动物模型，
—制^^人类肝炎病毒感染动物模型(HBV、 HAV、 HCV、 HEV、 HDV…) 来研究抗病毒药物的生活史、传播、抗性、治疗效果、用途以及任何使用 根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞移植的研究，
—使用根据本发明的肝脏祖细胞或干细胞制备体外毒理学、药理学动物 模型，
—在根据本发明的祖细胞或干细胞上测试新药，
—通过在根据本发明的祖细胞或干细胞中插入可在体外扩增的病毒序列 的基因治疗，
—研究人肝脏细胞代谢的动物模型，
—通过使用根据本发明的祖细胞或干细胞，耐受异基因细胞，和/或
—使用根据本发明的祖细胞或干细胞避免、预防或治疗肝脏或肝脏细胞 异体移植排斥反应。
在本发明的一个方面，本发明的祖细胞或干细胞或其后代，包括已
分化后代，意图用于治疗应用，如，组织工程和细胞治疗。
本领域技术人员了解此处详述的用途可以包括祖细胞或干细胞、包 含祖细胞或干细胞的细胞系和细胞群的用途，以及其后代、包括分化的后 代，尤其是肝细胞或肝细胞样细胞，或其遗传改造衍生物的用途。
如上所述，根据本发明源自肝脏的祖细胞或干细胞、包含祖细胞或
干细胞的细胞系和细胞群(特别要说的是，包括但不限于LMBP 6452CB 系)、或其后代(任选地遗传^Ut的)，可以用于细胞替代治疗。可以向对 象的目标组织施用细胞来补充功能性细胞或替换失去功能的细胞。作为替 代，也可以考虑提供分化细胞(尤其是肝细胞或肝细胞样细胞)的方法， 其中在分化因子存在下使祖细胞或干细胞分化、分离并施用于对象。
特征在于肝脏质量(mass)和/或功能损失的疾病状态或缺陷可受益 于本发明的祖细胞或干细胞，包括上面所列举的那些，还包括但不限于 alagille综合征、酒精性肝病(酒精诱导肝硬化)、a-l-抗胰蛋白酶缺乏症 (所有表型)、高脂血症和其他脂质代谢紊乱、自身免疫性肝炎、布-加综 合征(Budd-Chiari syndrome )、胆道闭锁、I、 II和III型进行性家族性 胆汁淤积、肝癌、Caroli病、crigler-najjar综合征、^t血症、半乳糖血 症、糖基化的缺陷、其他糖代谢紊乱、碳水化合物不足(carbohydrate deficient )、 refsum病以及其他过氧化物酶体疾病，Niemann Pick病、 wolman病以及其他溶酶体疾病、酪氨酸血症、triple H以及其他^J^酸代 谢紊乱、杜宾-约翰逊综合征、脂肪肝(非酒精性脂肪性肝炎)、吉尔伯特 综合征、糖原贮积症I和III、血色病、A-G型肝炎、紫质症、原发性胆汁 性肝硬化、硬化性胆管炎、酪氨酸血症、凝血因子缺陷、血友病B、苯丙 酮尿症、威尔森氏症(Wilson's Disease)、暴发性肝功能衰竭、肝切除后 肝功能衰竭、线粒体呼吸链疾病。此外，所述细胞也可以被用来治疗病毒 感染引起的肝病。
因此，本发明的一个方面提供本发明的成体肝脏祖细胞或干细胞、 含有所述祖细胞或干细胞的细胞系或细胞群(特别要说的，包括但不限于， LMBP6452CB系)、或其后代(包括分化的后代，尤其是肝细胞或肝细胞 样细胞，任选地如上详述经遗传^Ut)用于治疗的用途和/或制备用于治疗 肝脏疾病的药物的用途。这种疾病可包括影响肝组织的疾病，尤其考虑影 响肝细胞活性和/或功能的疾病，并且可以代表如先天性障碍、疾病状态的 影响、创伤的影响、毒性作用、病毒感染等。尤其考虑本说明中列出的肝 脏疾病。施用根据本发明的细胞可在对象中导致组织重构或再生。以允许
他们移植或迁移到期望的组织位点的方式施用细胞，并且重构或再生功能 缺陷的区域。
本发明的另一方面是预防和/或治疗肝脏疾病的方法，包括向需要这 种治疗的对象尤其是人施用本发明的成体肝脏祖细胞或干细胞、含有所述
脏祖细胞或干细胞的细胞系或细胞群(特别要说的，包括但不限于，LMBP 6452CB系)、或其后代，包括分化的后代，尤其是肝细胞或肝细胞样细胞， 任选地其被遗传&造。通常是以治疗有效量施用，即通常提供期望的局部 或全身性作用或性能的量。
另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的成体肝 脏祖细胞或干细胞、含所述脏祖细胞或干细胞的细胞系或细胞群(特别要 说的是，包括但不限于，LMBP6452CB系)、或其后代(包括已分化后代)， 尤其是肝细胞或肝细胞样细胞，任选地如上被遗传改造。
例如，而不是限制，可有利地通过注射(也包括导管施用)或^UV， 如局部注射、系统性注射、脾内注射(参见Gupta等，Seminars in Liver Disease 12: 321 , 1992 )、门静脉注射、肝浆注射，如肝包膜下、腹腔注射 或宫内注射入胚胎或胎儿来施用本发明的分离的肝脏祖细胞或干细胞、含 所述脏祖细胞或干细胞的细胞系或细胞群(特别要说的是，包括但不限于， LMBP 6452CB系)、或其后4戈。
在一个优选实施方案中，可通过肝细胞移植(LCT)将本发明源自 肝脏的祖细胞或干细胞、含所述肝脏祖细胞或干细胞的细胞系或细胞群
(特别要说的是，包括但不限于，LMBP 6452CB系)、或其后代(优选被 遗传改造)用于组织工程和细胞疗法。肝脏细胞移植以及肝脏干细胞移植
(LSCT)是指以任何导致1肝脏和细胞植入的方式，优选经门静脉， 还可通过直接肝注射，或通过脾内注射，注入包括本发明细胞的成熟肝脏 细胞或肝脏祖细胞的技术。
例如，分离之后或超低温保存解冻之后，细胞可以在任何培养基中 的细胞悬液的形式提供，优选含有人白蛋白。
在一个实施方案中，本发明考虑使用患者自身的肝组织来分离本发 明的祖细胞或干细胞。这种细胞是患者自体性的，并且容易向患者施用。 此外，如果患者具有标志着特定病理条件的遗传缺陷，通过遗传操作所获 得的细胞可避免这种缺陷。
另一个实施方案中，本发明的祖细胞或干细胞可从不是患者自身的
组织中分离获得。当考虑向患者施用这种细胞时，优选，选择本发明方法 处理的肝脏组织而获得祖细胞或干细胞，最大限度地(至少在可以实现的 范围内)来增加患者与施用细胞间的组织相容性，从而减少施用的细胞被 患者免疫系统排斥的机会(如，宿主对的移植物排斥反应)。
免疫系统区分自我和非我的能力很大程度上取决于主要组织相容性
复合体(MHC )的产物，其基因在6号染色体上并且属于免疫球蛋白基因 超家族。I类MHC产物由HLA-A、 HLA-B和HLA-C组成；其分布广泛 并且出现在基本上所有有核细胞和血小板的表面上。II类MHC产物由 HLA-D、 HLA-DR、 HLA-DP和HLA-DQ组成；其分布有P艮，包括B细 胞、巨谨细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞以及活化的(而非静息)T细 胞。
HLA基因位点通常是多等位基因，如，使用特异性抗体识别至少26 个HLA-A等位基因、59个HLA-B等位基因、10个HLA-C等位基因、 26个HLA-D等位基因、22个HLA-DR等位基因、9个HLA-DQ等位基 因和6个HLA-DP等位基因。由于HLA基因位点是紧密连锁的，HLA抗 原也可以是保守的单倍型形式存在。
需要本发明细胞治疗的对象可通过针对是否存在抗一 HLA抗体及 其HLA基因型和/或表型(如，淋巴细胞上；如使用血清学方法或遗传DNA 分析)进行筛选。根据本发明获得的祖细胞或干细胞、或肝脏组织来源或
适组织或细胞，其具有和患者一致的HLA单倍型，或具有患者中常见的 大多HLA抗原等位基因，并且没有或最少针对患者中预先存在的抗-HLA抗体的HLA抗原。移植细胞被成功接受的概率将随着相同的HLA 抗原数目的增加而提高。本领域技术人员知道这些考虑的其他变化。
还可以考虑获得代表了患者MHC谱的其他途径，如本发明获得的 祖细胞或干细胞或其后代的遗传操作。
如果细胞是来自外源(即非自体)，通常施用伴随的免疫抑制治疗， 如使用免疫抑制剂，如环孢霉素或他克莫司(tacrolimus) (FK506 )。作为 替代，所述细胞可以包裹在允许液体交换但阻止细胞/细胞接触的胶囊内。 微嚢化细胞的移植是本领域公知的，如Balladur等，1995, Surgery 117:189-194;和Dixit等，1992， Cell Transplantation 1:275-279。优选，细 胞是自体的，或如所述的表现HLA匹配接近的。
在另一个优选实施方案中，成体肝脏细胞或其部分来自非人类动物 对象，优选非人类的哺乳动物对象。可在相同、相关或其他非人类动物或
脏疾病治疗(如，含有非人类动物或非人类哺乳动物细胞的异种器官移植、 生物人工肝脏装置)。例如，而不是限制，用于人类治疗特别适合的非人 类哺乳动物细胞可以来自猪。
有关本发明祖细胞或干细胞的治疗用途的一个问题是要达到最佳效
果的细胞量。施用的剂量可以变化，可以包括跟随有后续施用的首次施用； 并且可以由本公开所属领域技术人员确定。典型情况下，施用剂量或剂量 将提供治疗有效量的细胞，即达到预期的局部及系统性效果和性能。
目前自体性单个核骨髓细胞的人类研究，经验剂量从1至4xi(T个 细胞不等，已经得到4^人鼓舞的成果。然而，不同的情况可能需要优化施 用细胞的量。因此，施用的细胞随处理的对象不同而不同。在一个优选实 施方案中，102至109之间、或103至109之间、或104至109之间、如104 至108之间、或105至107之间、如约lxl05、约5xl05、约lx106、约5xl06、 约lx107、或约2xl07、约3xl07、约4xl07、约5xl07、约6xl07、约7xl07、 约8xl07、约9xl07、或约lxl()S个细胞可以施用于人类对象。然而，精确 确定治疗有效剂量可以基于每一个患者的个体因素，包括其身材、年龄、 组织损伤大小、以及损伤发生后的时间长短，可以由本领域技术人员根据 4^>开和本领域常识轻易确定。
优选，用于施用的包含本发明祖细胞或干细胞的细胞群纯度可在约 50至约55。/。之间、约55至约60%之间、约65至约70%之间。更优选纯 度可在约70至约75 %之间、约75至约80 %之间、约80至约85 。/q之间； 最优选纯度可在约85至约90 %之间、约卯至约95 %之间、约95至约100 %之间；可以根据如细胞群中细胞表面标志物镨来确定所述干细胞纯度。 剂量可以容易地由本领域技术人员调整(如较低纯度可能需要增加剂量)。
本领域技术人员可以容易地确定本发明方法中待施用组合物中的细 胞量和任选的添加剂、赋形剂、和/或载体。典型情况下，^添加剂(除 了活性祖细胞或干细胞和/或细胞因子)可以0.001至50%的量(w/w或 w/v)存在于磷酸盐緩沖液的溶液中，典型情况下，活性成分可以在微克到 毫克级别，如约0.0001至约5% (w/w或w/v)，优选约0.0001至约1 % ， 最优选约0.0001至约0.05 。/。或约0.001至约20 % ,优选约0.01至约10 % ，
以及最优选约0.05至约5 % 。
当施用本发明的治疗性组合物时，通常配制成单位剂量注射剂的形 式(如，溶液、悬液、*剂、乳剂)。适于注射的药物剂型包括无菌水 溶液和*剂。如此处所用的，溶液或分軟剂包含本发明的细胞在其中仍 然保持活性的可药用载体或稀释剂。载体可以是包含例如水、盐水、磷酸 盐緩冲液、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)以及合适的 其混合物的可药用溶剂或M介质。
此外，可以添加能够提高组合物稳定性、无菌性和等渗性的各种添 加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂、以及緩冲液。通过各种抗菌 和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来保证防止 微生物活动。
在4艮多情况下，希望含有等渗剂来确保细胞的活性，例如，糖、氯 化钠等。本发明组合物的理想等渗性可通过使用氯化钠或其他可药用试剂 来实现，如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶质。尤 其对于含有钠离子的緩冲液而言优选氯化钠。
当向有需求的对象引入目标祖细胞或干细胞或分化的后代时，为了 有效增加细胞的存活，可能要将所述细胞掺入生物高分子或合成聚合物 中。适合生物高分子的实例包括，但不限于，纤维连接蛋白、纤维蛋白、 纤维蛋白原、凝血酶、胶原蛋白、蛋白聚糖。其建构可以包括或不包括细 胞因子、生长因子、分化因子或核酸表达的建构物等。这种生物高分子， 如，可以是悬液或细胞嵌入其中的三维蒯欧的形式。这种聚合物优选是可 生物降解的。
可以通过使用緩释吸收剂来延长可注射的药剂形式的吸收，例如， 单硬脂酸铝和明胶。根据本发明，然而，任何使用的载体、稀释剂、或添 加剂都必须和祖细胞或干细胞兼容。
可以通过将实施本发明时所用的细胞同各种量的其他成分(需要的 话)掺入所需量的合适溶剂中来制备无菌注射溶液。
这种组合物还可混合有合适的载体、稀释剂、或赋形剂，如无菌水、 生理盐水、葡萄糖、右旋糖等。组合物可包含辅助物质，如润湿剂或乳化 剂、pH緩沖试剂、胶凝剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、色素等， 这取决于给药途径以及制备要求。
可以参考标准文本，如"Remington's pharmaceutical science"第 17版，1985通过参考并入此处，来做适当的准备，而避免不必要的实验。
如果需要的话，可以使用可药用增稠剂将组合物的粘度维持在选定 水平。优选曱基纤维素，因为它很容易商业上获得并且便于操作。其他合 适的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆 等。优选的增稠剂的浓度取决于所选的试剂。在使用某个量时，在这一量 下将获得选定的粘度。通常通过在溶液中添加这种增稠剂来制备粘性组合 物。
本发明祖细胞或干细胞的其他用途
下面考虑了本发明的祖细胞或干细胞、含有所述脏祖细胞或干细胞 的细胞系或细胞群(特别要说的是，包括但不限于，LMBP 6452CB系)、 或其后代(包括分化的后代，尤其是肝细胞或肝细胞样细胞，任选地其遗 传^Ut的后代)的其他用途。
因此，祖细胞或干细胞或其分化衍生物，尤其是肝细胞或肝细胞样 细胞，可用于检测对生物活性试剂(生物剂或药理剂)的细胞反应(如毒 性)，包括使细胞培养物、或其分化的衍生物接触一种或更多种生物或药 理剂，鉴定对一种或更多种生物或药理剂的一种或更多种细胞反应，比较 细胞培养物的细胞反应和对照培养物的细胞反应。这种反应可通过检测分 子活性来确定，例如，但不限于，碱性磷酸酶、细胞色素P450、尿素途径 的酶等。
此外，例如，可以通过本发明的祖细胞或干细胞或其分化的后代， 尤其是肝细胞或肝细胞样细胞，来筛选细胞因子、趋化因子、药物组合物 和生长因子，以更清楚地阐明其对这种细胞的分化和功能的作用。
本发明还设计了一种组织工程化器官，或其部分，或特定的部分、 包含目标组织和任选地细胞因子、生长因子、或分化因子的组织工程装置， 其中本发明的细胞用来产生组织，尤其^Jt脏组织，尤其是包含肝细胞的 组织。组织工程化器官可以配合生物相容性支架使用，所述支架支持细胞 以三维构象(结构)生长，支架是可生物降解的。从本发明的干细胞产生 的组织工程化器官可^需要更换器官、其部分或特定部分的对象。本发 明还设计了干细胞或其分化的细胞用作生物反应器(如肝脏辅助装置)的 用途。
可将来自本发明干细胞的器官、其部分或区域植入宿主。移植可以是自体的，即来自器官或器官单元的干细胞的^是工程化组织的受体。 移植可以是异源的，即来自器官或器官单元的干细胞的供体不是工程化组 织的受体。
一旦转移至宿主，组织工程化器官可以重现天然宿主组织的功 能和结构。组织工程化器官将有利于本发明主题的多种应用，包括治疗癌 症和此处公开的其他疾病、先天缺陷、或由于外科切除造成的损伤。
作为药物检验和开发过程的工具，肝脏细胞及其后代可以用来评估
待开发药物引起的基因表i^式变化。潜在药物引起的基因表ii^式变化
可以和那些已知影响肝脏的药物引起的变化相比较。这将使制药公司能够 对化合物在开发早期对肝脏的影响进行筛选，从而节省了时间和金钱。肝 脏细胞的整个镨系，从祖细胞到成熟细胞，也可以用来测试药物对肝脏的 毒性，研究药物如何代谢。目前，制药公司在获得一致性的用于毒性测试 的肝脏细胞供应方面有困难。本发明方法和细胞满足了这种需求。
此夕卜，本发明成体肝脏祖细胞或干细胞或其后代(包括已分化后代)， 尤其是肝细胞或肝细胞样细胞，可以作为脱毒装置的生物组分，如肝脏灌 注或肝脏辅助装置。
传统的肝脏辅助装置包括一个坚固的塑料外壳和空心半透膜纤维， 其中接种有干细胞或分化的肝细胞或来自干细胞。这种纤维可用胶原、凝 集素、层粘连蛋白、或纤维连接蛋白处理，用于粘附细胞或留下未经处理 的。根据公知的程序通过装置灌注体液来脱毒，然后再输回患者。国际专
利公开PCT US00/15524中描述了一个适合本发明细胞的LAD的实例。
本发明的成体肝脏祖细胞或干细胞或其后代可以在体外分化并且还 在"ADMET"(施用、分布、代谢、消除和毒理学)或细胞毒性测试中替 代成熟肝细胞。
或肝细胞样细胞可提供一种用于研k肝脏发^、、肝脏细胞代谢或肝脏细胞 生物学的体外模型；用于筛选分化、增殖或毒性分子。还考虑这种细胞的 遗传操作，它们可以用于研究肝脏发育、肝脏细胞代谢或生物学相关的基 因。
现在将通过如下实施例来说明本发明，这不以任何方式限制本发明 的范围。
实施例
〃虔勿應为、岸方法
从来自健康尸体或无心跳供体的整个肝脏或肝脏部分获得人类肝脏
细胞。总阻断时间后(如，总阻断时间后6至12小时)分离细胞，直到灌 注之前肝脏都在威斯康星大学介质中(the University of Wisconsin medium)保存于冰上。使用经典两步灌注技术分离肝细胞(Seglen， 1976}{Stephenne, 2005}。肝脏组织随后经由明显的血管用EGTA溶液(Earl 平衡盐溶液，不含Ca^和MgW、 0.5mMEGTA、 5mMHepes、 2 mg/1庆 大霉素和100,000 IU/I青霉素G)和消化酶溶液在37"C下各自灌注9至 12分钟。消化溶液(EBSS含Ca抖和Mg卄、5 mM Hepes、 2 mg/1庆大霉 素和100,000 IU/I青霉素G)含有0.9毫克/毫升胶源i^ P和0.03毫克/毫 升的大豆胰蛋白酶抑制剂。切割肝包膜并且轻微振荡释放肝细胞。用水冷 的含有0.03亳克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂和100亳升/升人血浆的清洗介 质终止消化(M199培养基、5 mM Hepes、 2 mg/1庆大霉素和IOO，OOO IU/I 青霉素G)。通过四个金属筛网过滤并清洗细胞，筛网孔径分别为4.5mm、 lmm、 0.5mm和0.25mm。通过在1200rpm下离心3分钟，用冰冷的M199 清洗介质洗涤细胞3次。
将单细胞悬液重悬于补充有10%胎牛血清(FCS) (Perbio， Hyclone)、 25ng/ml EGF (Peprotech )、 10ng/ml胰岛素、lpm地塞米松和 1%青霉素/链霉素(P/S) (Invitrogen公司)的Williams' E基质中 (Invitrogen公司)。细胞接种于I型鼠尾^f、 (BD Biosciences)包被的 摇瓶或平皿上(如，6孑L板)(Greiner Bio画one )，并且在含5 % C02水饱和 的环境中在371C下培养。24小时后，更换培养基来去除未粘附的细胞，此 后每3天进行更新。在两个星期内，每天显^bi见^^养物，每三天分析培 养基。然后将培养基换成具有高葡萄糖浓度补充有10。/。FCS的(Perbio， Hyclone)和1% P/S (Invitrogen)的DMEM (Invitrogen)以{^>速成体 肝细胞的去除。经相差显微镜确认，具有间充质样形态的细胞类型随后自 发性出现，增殖并填补孔板的空白处。培养15至20天之间出现这些细胞， 并且呈现扁平形状、明显细胞质和/或有一个或两个核仁的卵原形核(图1 )。 当达到70 %汇合时，用0.25 %胰蛋白酶和lmM EDTA剥离细胞，并以期 望浓度重新接种。用流式细胞仪进行的细胞悬液分析表明传代2次之后细
胞群变得均一化。对于每次传代，也可以用RT-PCR、和免疫荧光来分析 细胞悬液。
滅絲
为了避免可能被其他类型细胞污染，进行免疫细胞化学来研究这些 细胞的表型。由于他们来源于肝脏，已经在多聚甲醛固定的细胞中分析了 特异性标志物如白蛋白的表达。如图2所示，使用单克隆(Sigma克隆 HAS-lll)或多克隆(Chemicon)抗体检测唯独在肝细胞中表达的白蛋白。 还平行地评价了间充质细胞标志物的表达，表明这些细胞是波形蛋白和a 平滑肌肌动蛋白免疫阳性(图2 )。迄今为止在已经传代7次的研究中其表 型特征具有很大稳定性。
勿應为、必；
以0.5-1 x 104/cm2的密度将细胞接种在补充有FCS和P/S的DMEM 中包被有I型鼠^CJ!^f包被的6孑L板上。24小时后将培养基换成Iscove's modified Dulbecco，s培养基(IMDM) (Invitrogen)。对于诱导，将细胞在 ^^有IMDM补充20 ng/ml HGF (Biosource )、 10 ng/ml bFGF (Peprotech) 和0.61 g/1烟酰胺(Sigma)的诱导培养基中孵育2周。此后，将细胞在含 有IMDM补充20 ng/ml制瘤素M ( Sigma )、 l^M地塞米松(Sigma )、 50mg/ml ITS (胰岛素、转铁蛋白、硒)(Invitrogen)的成熟培养基中孵 育。对于诱导和成熟步骤，每3天改变和分析培养基。与以上混合物 (cocktail )接触后，细胞开始失去其锐利边缘、逐渐收缩并且失去其最初 形态而呈现多边形形状(图3)。
流式勿應》浙
以1200rpm离心5分钟后收集细胞，并以500至1000的 浓度将细胞重悬于PBS中。然后与抗体在4t:下孵育30分钟。相应的对
照抗体亚型用于评价单克隆抗体的非特异性结合。然后漂洗细胞，重悬于
Isoton (Beckham Coulter)用Beckham Coulter流式细胞仪读取。
及n及
根据制造商的说明书，使用TriPure分离试剂(Poche)从生长于6 孔板上的细胞中提取总RNA，用逆转录试剂盒产生cDNA。 25nl终体积中 用聚合酶延长酶和适当的引物进行PCR扩增。此后，样本在1 %琼脂糖凝 胶上进行电泳并通过溴化乙锭染色观察核酸。
免疫染色，在室温下，用4。/。多聚曱醛(V/V)固定生长于I型鼠尾 ^^、-包被的12mm圆形盖璃片上的细胞15分钟，此后用Triton X 100的 1 % TBS溶液(V/V )将细胞透化(Permeabilized )15分钟(Tris國HCl 50 mM、 NaCl 150 mM、 pH 7.4 )。通过37X:下在含有3 %脱脂奶粉的TBS溶液中 孵育1小时来防止非特异性免疫染色。细胞随后同一抗在室温下于相同溶 液中孵育l小时，用TBS漂洗5次，同二抗一起孵育1小时(1/500)。用 核染料DAPI (1/5000 )对核进行30分钟染色。漂洗3次后，将制备物置 于Fluoprep介质中(BioMerieux，布鲁塞尔，比利时)并用配有CCD相 机(T.I丄丄.photonics,马丁斯里德，德国)的Olympus 1 x 70倒置显微 镜检查。用配有单色器(monochromator) ( T.I丄丄.photonics,马丁斯里德， 德国)的氙灯获得^U1光(对于Cy-3、 FITC和DAPI分别是552、 488和 372 nm)。使用适当的滤镜并配合使用TILLvision软件获得数码影像。
本Jt微勿賴"f趁浙
使用上述方法，在该实施例的用于建立细胞的实验中，已经建立了 如下多种细胞标志物的表达镨(ADHLSC ):
CD卯阳性。CD90或Thy-l， 一种细^fe^面蛋白，初视为间充质系 的标志。
CD44阳性。CD44是一种细胞粘附分子并且用来识别至少某些类型 的间质干细胞(MSC)。
波形蛋白阳性。波形蛋白是一种间充质细胞和成纤维细胞中经常能 检测到的III型中间纤维。
白蛋白阳性。白蛋白是一种由肝脏产生并分泌的血浆蛋白。在肝细 胞中，通常发现白蛋白是一种细胞质蛋白。
CD29阳性。CD29,也称为整合素P-1，是一种跨膜糖蛋白，也存 在于肝组织中，被认为和整合素a—起形成参与和细胞外基质相互作用的 功能性受体复合物。
CD73阳性。CD73是一种袪3人为是一种间充质标志物的5，-外切核 苷酸酶。
CD49b阳性。CD49b也被称为整合素a-2或胶原蛋白受体，并且参 与和细胞外基质的相互作用。HLA-ABC阳性。HLA-ABC (人类白细胞抗原A、 B和C )是I类 主要组织相容性复合体抗原形成膜异二聚体。
低水平表达的甲胎蛋白。曱胎蛋白是一种原始内胚层(primitive endoderm)发育过程和整个成熟中表达的、反映内胚层镨系的蛋白质。高 水平表达甲胎蛋白通常揭示致瘤性分离(tumorigenic shunt )。
ct-l抗胰蛋白酶阳性。a-l抗胰蛋白酶是一种肝脏合成的血浆蛋白。
葡萄糖6-磷酸酶(G6P)阳性。G6P是一种将葡萄糖6-磷酸水解成 葡萄糖和无机磷的肝脏酶，使jMt从肝脏iiAjfii液。
细胞色素P450 1B1 (CYP1B1)阳性。CYP1B1是一种二恶英可诱 导的细胞色素，其负责范围广泛的结构上多样的差^质的I期代谢。
细胞色素P450 3A4 (CYP3A4)阳性。CYP3A4是一种参与异生物 素代谢的关键酶。
肝细胞核因子4 (HNF-4)阳性。HNF4， 一种核受体，是一种参与 能量代谢调节的转录因子。
色氨酸2，3-双加氧酶(TDO )阳性。TDO是参与色氨酸在肝脏中氧 化的第一个酶。
酪氨酸转氨酶(TAT)阳性。TAT是一种参与JL^酸代谢和糖原异 生的线粒体肝脏特异性酶。
谷氨跣胺合成酶(GS)阳性。GS是一种氨同化的关键酶。
Gamma-谷氨酰转肽酶(GGT )阳性。GGT是一种参与谷胱甘肽代 谢的酶。
细胞角蛋白8 (CK8)阳性。CK8是一种上皮细胞特异性的中间纤维。
耐多药蛋白2 (MRP2)阳性。MRP2是一种负责将细胞内有机阴离 子^细胞输出至胆道的有机阴离子转运蛋白。
谷氨酸转运蛋白2 (EAAT2)阳性。
出现上述很多可能参与肝脏功能和代谢的分子表示ADHLSC细胞 系和肝脏表型有密切联系。
CD117阴性，CD117,也称为c-kit，是一种骨髓细胞类型上识别
HSC和MSC的细胞表面受体，从而表 艮大程度上未分化的干细胞。
CD34阴性。CD34是一种骨髓细胞上的细胞表面蛋白，标志着HSC 和内皮祖细胞。
CD45阴性。CD45也称为白细胞抗原，是一种造血镨系细胞(包括 造血干细胞)表达的酪氨酸磷酸酶。
CD105阴性。CD105,也称为SH2或endoglin，是一种粘附分子。 它也被认为是一种间充质干细胞标志物。
CD133阴性。CD133是一种造血干细胞标志物。
HLA-DR阴性。这些II类主要组织相容性复合体抗原是抗原提呈细 胞P艮制性表达的膜异二聚体。
Oct-4阴性。Oct-4是一种仅由多能干细胞表达的转录因子，并且是 维持未分化状态所必须的。
细胞角蛋白19 (CK19)阴性。CK19广泛用作胆道细胞即胆管细胞 的标志物。
细胞色素P 2B6 (CYP2B6)阴性。CYP2B6参与内-和异生物素代谢。
CD54:细胞间粘附分子-1 (ICAM-1)， 一种膜糖蛋白。
不意图以任何方式限制，本发明人根据其对细胞标志物的知识提出 了以下对上述数据可能的解释这些标志物组合定义了一种原初的细胞 系，其表达间充质谱系标志物(CD卯、CD73、波形蛋白、CD44)以;SJf 脏分化途径特有的标志物(CD29和白蛋白、a-l抗胰蛋白酶、HNF4、MRP2 转运蛋白)。通过免疫荧光和RT-PCR检测到存在白蛋白强烈反对被星状 细胞污染的可能。ADHLSC似乎既不是多能未分化间充质干细胞(CD45 阴性、CD34阴性、CD117阴性、Oct-4阴性)，也不是肝脏星状细胞(白 蛋白阳性)。ADHLSC镨系与肝镨系一致(CD29阳性、表达白蛋白和a-l 抗胰蛋白酶)但不表达典型的胆道标志物(CK19和7阴性)。因此，本发 明的细胞和细胞系，可以以一种但不是限制的方式，被表征为具有肝细胞 祖细胞特征的间充质干细胞系。
w/M-SC7D小葳移控、逸欢#^瘦逸织必#
一百万个ADHLSC (30 %活性)注射到6-至14日龄uPA+/+-SCID
小鼠的脾脏。移植前，小鼠未显示可检测出的血清白蛋白。在苏木精和曙
红(HE)染色的4pm-厚肝脏切片上进行小鼠肝脏样品的免疫组化分析用 于组织病理学的整体评价。对于免疫染色，室温下用第一抗体将肝脏切片 孵育过夜。用过氧化物酶标记的聚合物和底物发色剂孵育切片后进行检测 (Envision画DAB系统，Dako, Carpinteria, CA )。用苏木精复染。
用于这种目的的转基因小鼠模型与具有免疫缺陷病(SCID)的肝脏 病理(uPA)相结合。ADHLSC悬液的脾脏移植后，让uPA+/+-SCID小鼠 恢复10个星期。移植有ADHLSC的uPA/SCID小鼠肝脏的分析表示这些 细胞能够移植(图4 )并分化为成熟肝细胞(图5 )。此外，在这些移植10
周后的移植小鼠血清中检测到AJ&L白蛋白，表达的甲胎蛋白水平(肿瘤发
生育的标志物)仍然检测不到。
如显#^见察所示移植的细胞没有过度增殖，表示没有致瘤集落并且 致瘤标志物曱胎蛋白和Ki67的表达水平正常。正常表达水平基本上相当 于正常肝细胞中测量的表达水平，并且低于致瘤性改造的人肝脏细胞系如 H印G2中测量的表达水平。
实施例2
一个用本发明源自肝脏的祖细胞或干细胞、包含所述祖细胞或干细 胞的细胞系和/或细JJW (尤其要说的是，包括但不限于，LMBP 6452CB 系)、或其后代(任选地被遗传改造)的示例性处理可以如下。
通过连续注射注入细胞，优选不超过25至50xl(^个细胞/kg，优选 间隔4小时，或间隔8小时，或超过8小时直至1周，或超过1周。持续 数日注射250 x 1(^个细胞/kg，或500 x 1(^个细胞/kg的总细胞量，优选一 周或优选两周。需要的话重复系列注射，每隔一个月、或每隔六个月、或 每隔一年或更长。
在放射性和或超声引导下、经穿刺针、或经皮下导管、或经 Port-a-cath R装置、或经Broviac R装置经由外科插入至任何引流至门静 脉的血管(优选肠系膜下静脉、或结肠静脉)通过直接穿刺进入门静脉。 导管可以在原位留存数小时，优选数天，优选数周，或优选数月直至2年， 或优选更长时间以便需要的时候重复输注。
免疫抑制始于输注当天，优选前一天，优选使用他克莫司(FK506) 及类固醇。他克莫司的血液水平优选最初阶段8ng/ml， 3个月后6ng/ml， 6个月后4ng/ml，然后保持在4ng/ml左右。类固醇优选给予强的松或强的
松龙，优选最初阶段在第1天5mg/kg，在第2天4mg/kg，在第3天3mg/kg, 在第4天2mg/kg,在第5天lmg/kg，然后在3个月时逐步减少到0.25mg/kg, 并在6个月时停止。替代的免疫抑制可以包括，单独或联合(施用)，环孢 素A、抗IL2受体抗体、抗胸腺细胞球蛋白、或任何^A淋巴细胞的多克 隆或单克隆抗体、霉酚酸酯mofetyl或硫唑嘌呤或任何抗代谢药物、环孢 素、雷帕霉素(rapamune)或任何其他神经钩蛋白(calcineurin)抑制剂。
权利要求
1.来源于成年肝脏的分离的祖细胞或干细胞，其特征在于它共表达肝细胞标记物白蛋白(ALB)以及至少一个间充质标志物，优选一个、一个以上或全部的标志物CD90、CD73、CD44、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)。
2. 权利要求l的分离的祖细胞或干细胞，其还表达选自CD29、甲 胎蛋白(AFP)、 a-l抗胰蛋白酶、HNF-4和MRP2转运蛋白中的一个或更多个其它肝脏或肝细胞标志物。
3. 权利要求1或2中任一项的分离的祖细胞或干细胞，其共表达 肝细胞标志物白蛋白(ALB)、至少一个肝脏标志物CD29或曱胎蛋白(AFP)以及至少一个间充质标志物，优选一个、 一个以上或全部的标 志物CD卯、CD73、 CD44、波形蛋白和a-平滑肌肌动蛋白(ASMA)。
4. 权利要求3的分离的祖细胞或干细胞，其还表达一个或更多个 肝细胞标志物a-l抗胰蛋白酶或MRP2转运蛋白。
5. 权利要求1至4中任一项的分离的祖细胞或干细胞，其对CD90、 CD29和CD44呈阳性，任选地也对CD73呈阳性，并且是白蛋白阳性、 波形蛋白阳性以及a-平滑肌肌动蛋白阳性。
6. 权利要求1或2中任一项的分离的祖细胞或干细胞，其中所述 细胞至少对CD45、 CD34、 CD117呈阴性，优选对Oct-4也呈阴性，并 且对CK-19呈阴性。
7. 权利要求1至6中任一项的分离的祖细胞或干细胞，其中所述 细胞具有间充质样形态，优选包括以下任一项或全部单层生长、扁平 形状、宽细胞质以及具有一或两个核仁的卵形细胞核。
8. 权利要求1至7中任一项的分离的祖细胞或干细胞，其中所述 细胞能分化成肝细胞或肝细胞样细胞，而不分化成中胚层细胞类型。
9. 细胞系或细胞群，其包含权利要求1至8中任一项所述的分离 的肝脏祖细胞或干细胞，以及其后代。
10. 权利要求1至8中任一项的肝脏祖细胞或干细胞、或者权利要 求9的祖细胞或干细胞系或细胞群，其中所述祖细胞或干细胞是人的。
11. 分离的人成体肝脏祖细胞或干细胞和细胞系，于2006年2月 20日根据布达佩斯条约保藏在比利时微生物合作保藏中心(BCCM)， 其保藏号为LMBP6452CB，其亚系，包括克隆亚系，及其后代。
12. 获得分离的祖细胞或干细胞或包含所述祖细胞或干细胞的细胞 群的方法，该方法包括(a)解离成体肝脏或其一部分，以从所述成体 肝脏或其一部分形成原代细胞群，(b)将所述原代细胞群铺板到细胞能 够粘附的基底上，和(c)将来自该原代细胞群的已经粘附到所述基底 上的细胞持续培养至少7天，优选至少10天、至少13天或至少15天。
13. 权利要求12的方法，其中在步骤(c)之后将所述细胞传代至 少一次、优选至少两次。
14. 分离的成体肝脏祖细胞或干细胞、其细胞系和/或包含所述细 胞的细胞群，其可以用权利要求12或13中任一项的方法获得或者直接 由所述方法获得。
15. 权利要求14的分离的成体肝脏祖细胞或干细胞、其细胞系和/ 或包含所述细胞的细胞群，其中所述方法包括(a)从对象解离、优选 通过两步胶原酶法解离成体肝脏或其一部分，所述对象优选是脊推动 物、哺乳动物、更优选是人对象，以从所述成体肝脏或其一部分形成原 代细胞群；(b )将所述原代细胞群铺板到Williams Medium E培养基中 的包被I型胶原的基底上，所述培养基包含胎牛血清(优选10%(v/v))、 EGF(优选25ng/ml )、胰岛素(优选lOjig/ml )、和地塞米松(优选ljiM);(c)持续24小时使来自所述原代细胞群的细胞粘附到所述基底上，随 后将培养基更换为具有(b)中组成的新鲜培养基；(d)在两周时间(优 选15天)中在(c)中所述培养基中培养细胞；(e)将培养基更换为包 含高葡萄糖和FCS (优选10%)的DMEM，继续培养细胞，由此本发 明的祖细胞或干细胞出现并增殖；(f)任选地且优选地，使细胞达到约 70%汇合，将细胞传代至少一次且优选至少两次，其中所述细胞铺板到(b)中的基底上并在(e)中的培养基中培养。
16. —种组合物，其包含权利要求1至8、 lO或ll、 14、 15中任 一项所述的肝脏祖细胞或干细胞或者权利要求9至11、 14、 15中任一 项所述的细胞系或细胞群。
17. 权利要求16的组合物，其中所述肝脏细胞是人肝脏细胞或哺 乳动物肝脏细胞。
18. 治疗肝脏疾病的方法，包括施用有效量的权利要求1至8、 10 或ll、 14、 15中任一项所述的肝脏祖细胞或干细胞或者权利要求9至 11、 14、 15中任一项所述的细胞系或细胞群。
19. 权利要求1至8、 lO或ll、 14、 15中任一项所述的肝脏祖细 胞或干细胞或者权利要求9至11、 14、 15中任一项所述的细胞系或细 胞群、或者其后代，包括已分化后代，优选肝细胞或肝细胞样细胞，所 述细胞用于治疗。
20. 权利要求1至8、 lO或ll、 14、 15中任一项所述的肝脏祖细 胞或干细胞或者权利要求9至11、 14、 15中任一项所述的细胞系或细 胞群，或其后代，包括已分化后代，优选肝细胞或肝细胞样细胞，在制 备用于治疗肝脏疾病的药物中的用途。
21. 权利要求18的方法或者权利要求20的用途，其中所述肝脏疾 病包括苯丙酮尿症和其他氨基酸代谢疾病、血友病和其他凝血因子缺 陷、家族性高胆固醇血症和其他脂质代谢紊乱、尿素循环障碍、糖原贮 积病、半乳糖血症、果糖血症、酪氨酸血症、蛋白质和碳水化合物代谢 缺陷、有机酸尿症、线粒体疾病、过氧化物酶体和溶酶体失常、蛋白质 合成异常、肝细胞转运蛋白缺陷、糖基化缺陷、肝炎、肝硬化、先天性 代谢障碍、急性肝功能衰竭、急性肝感染、急性化学毒性、慢性肝功能 衰竭、胆管炎、胆汁性肝硬化、Alagille综合征、a-l-抗胰蛋白酶缺乏症、 自身免疫性肝炎、胆道闭锁、肝癌、肝嚢性病变、脂肪肝、半乳糖血症、 胆结石、Gilbert综合征、血色病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、 以及其他病毒感染型肝炎、紫质症、原发性硬化性胆管炎、Reye氏综 合征、结节病、酪氨酸血症、I型糖原贮积症、或威尔森氏症。
22. —种药物组合物，其包含权利要求1至8、 lO或ll、 14、 15 中任一项所述的肝脏祖细胞或干细胞或者权利要求9至11、 14、 15中 任一项所述的细胞系或细胞群以及可药用载体。
23. 实施体外毒性测试的方法，其包括使测试药剂接触权利要求1至8、 lO或ll、 14、 15中任一项所述 的肝脏祖细胞或干细胞或者权利要求9至11、 14、 15中任一项所述的 细胞系或细胞群，并且如果有的话观察该测试药剂对所述肝脏细胞群的 至少一种影响。
24. 权利要求23的方法，其中所述至少一种影响包括对细胞存活、 细胞功能或者对二者的影响。
25. 实施体外药物代谢研究的方法，其包括(i)使测试药剂接触 权利要求1至8、 lO或ll、 14、 15中任一项所述的肝脏祖细胞或干细 胞或者权利要求9至11、 14、 15中任一项所述的细胞系或细胞群，和(ii)如果有的话，在预定测试时间以后观察与该测试药剂有关的至少 一种变化。
26. 权利要求25的方法，其中所述至少一种变化包括所述测试药 剂在结构、浓度或二者的变化。
27. 包含基座的肝脏辅助装置，所述基座容纳权利要求1至8、 10或ll、 14、 15中任一项所述的肝脏祖细胞或千细胞或者权利要求9至 11、 14、 15中任一项所述的细胞系或细胞群。
28. 治疗基因表达错误的方法，其包括(i)将基因的功能性拷贝 导入权利要求1至8、 lO或ll、 14、 15中任一项所述的肝脏祖细胞或 干细胞或者权利要求9至11、 14、 15中任一项所述的细胞系或细胞群， 以提供已转化群体；和(ii)将所述已转化群体的至少一部分导入患者 的肝脏，其中该患者需要该基因的功能性拷贝。
29. 用于治疗基因表达错误的组合物，其包含已转化的权利要求l 至8、 lO或ll、 14、 15中任一项所述的肝脏祖细胞或干细胞或者已转 化的权利要求9至11、 14、 15中任一项所述的细胞系或细胞群，其中 已经导入了基因的功能性拷贝。
30. 用于治疗基因表达错误的药物组合物，其包含权利要求1至8、 lO或ll、 14、 15中任一项所述的肝脏祖细胞或干细胞或者权利要求9 至ll、 14、 15中任一项所述的细胞系或细胞群、以及可药用载体，其 中所述细胞中已经导入了基因的功能性拷贝。
31. 增强损伤或患病肝脏再生的方法，其包括向所述肝脏施用有效 量的权利要求1至8、 lO或ll、 14、 15中任一项所述的肝脏祖细胞或 干细胞或者权利要求9至11、 14、 15中任一项所述的细胞系或细胞群。
32. 测试用于治疗肝脏感染的有效药剂的方法，其包括(i)用目 标传染原感染权利要求1至8、 lO或ll、 14、 15中任一项所述的肝脏 祖细胞或干细胞或者权利要求9至11、 14、 15中任一项所述的细胞系 或细胞群，以提供被感染群体，(ii)使所述被感染群体接触预定量^l测 试药剂，和(iii)如果有的话，观察这种接触对所述已感染群体的影响。
33. 权利要求32的方法，其中所述传染原包括微生物。
34. 权利要求32的方法，其中所述传染原包括一或多种病毒、细 菌、真菌、或其组合。
35. 权利要求32的方法，其中所观察的影响包括对病毒传染原之 病毒复制的影响。
36. 权利要求35的方法，其中所述病毒传染原包括肝炎病毒。
37. 生产目标蛋白质的方法，其包括将编码目标蛋白质的功能基因 导入权利要求1至8、 lO或ll、 14、 15中任一项所述的肝脏祖细胞或 干细胞或者权利要求9至11、 14、 15中任一项所述的细胞系或细胞群， 在转录、翻译以及任选地翻译后修饰有效发生的条件下培养所述肝脏细 胞群，和收获所述目标蛋白质。
38. 权利要求37的方法，其中所述肝脏细胞是人肝脏细胞。
39. 权利要求38的方法，其中所述目标蛋白质包括疫苗抗原。
全文摘要
本发明涉及分离的肝脏祖细胞干细胞，及其细胞群，其中所述祖细胞干细胞来源于成体肝脏尤其是人类的肝脏。本发明还涉及所述祖细胞干细胞在医学、肝病学、肝脏代谢出生缺陷、移植、传染性疾病、肝脏衰竭中的用途。本发明还涉及分离这些细胞的方法、其培养物、分化前后表征、及其在移植、人类疾病的动物模型、毒理学和药理学中的用途。
文档编号C12N5/08GK101356264SQ200680048822
公开日2009年1月28日 申请日期2006年12月14日 优先权日2005年12月21日
发明者穆斯塔法·纳吉米, 艾蒂安·索卡尔 申请人:鲁汶大学