核酸杂交分子的洗脱分选方法

专利名称：核酸杂交分子的洗脱分选方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸片段的分选方法，特别是涉及一种主要用于分离重复次数不同的微 卫星DNA片段的分选方法。
背景技术：
在分子生物学的研究中，经常需要用包含特定序列的核酸探针与待分选的核酸片段杂交， 来捕获包含其互补序列的核酸片段，并且在一定的条件下洗脱，以获得符合条件的目的片段。 对于被探针捕获在固相基质上的核酸片段，在通常情况下，先用变性能力低(低温、高离子 强度)的洗脱液预洗脱，清除不能被探针杂交却吸附在固相基质上的核酸片段，再用变性能 力强(高温、低离子强度、碱性)的洗脱液将杂交在探针上的核酸片段一次洗脱回收。
该方法在mRNA纯化、消减杂交、微卫星DNA富集等方面已经被广泛应用，特别是用 于微卫星DNA片段的富集，国内外有很多相关的报道，主要有 HEIKE HADRYS, JANNE TIMM, BRUNO STREIT and SANDRA GIERE. A panel of microsatellite markers to study sperm precedence patterns in the emperor dragonfly Anax imperator (Odonata: Anisoptera)[J]. Molecular Ecology Notes, 2007,7:296—298。 JA GALARZA， GF TURNER, E MACPHERSON， J CARRERAS-CARBONELL and C RICO. Cross-amplification of 10 new isolated polymorphic microsatellite loci for red mullet (Mullus barbatus) in striped red mullet (Mullus surmuletus) [J]. Molecular Ecology Notes, 2007,7:230-232。 MASSIMILIANO BABBUCCI, ANNA MARIA PAPPALARDO, VENERA FERRITO, FEDERICA BARBISAN， TOMASO PATARNELLO and CONCETTA TIGANO. Isolation and characterization of eight polymorphic microsatellite markers in Aphanius fasciatus (Teleostei: Cyprinodontidae)[J]. Molecular Ecology Notes, 2007,7:293-295。 R UESUGI and MH OSAKABE. Isolation and characterization of microsatellite loci in the two-spotted spider mite, Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae) [J]. Molecular Ecology Notes, 2007,7:209-292。沈富军，等.Dynal磁珠富集大熊猫微卫星标记.遗传学报，2005， 32(5): 457-462。[6]夏军红，等.黄鳍鲷基因组微卫星的分离.中国水产科学，2007,14(2): 321-325。 [7]李琪，等.长牡蛎(Crassostrea gigas)微卫星克隆快速分离及特性分析.海洋与湖沼， 2004,35(4): 364-370。周建林，等.红麻微卫星DNA的分离.湖南师范大学自然科学学报，2006, 29(1): 78-82。刘军，等.珍稀濒危树种毛红椿微卫星DNA分离及SSR反应体系优化.中国生物工程 杂志，2006,26(12): 50-55。佟广香，等.哲罗鱼基因组微卫星富集文库的构建与分析.中国水产科学，2006, 13(2): 181-186。
上述研究采用的微卫星DNA的回收方法都是传统的3步骤法捕获探针杂交、低强度 变性液的预洗脱和高强度变性液的洗脱回收。各个预洗脱步骤有所不同预洗脱次数从4次 (文献[4])到12次(文献[5])，预洗脱液温度从30'C (文献[7])到68'C (文献[IO])，预洗 脱液离子强度从0.06xSSC (文献[9]到3xSSC (文献[IO])。
上述研究的回收效率也各不相同，但普遍偏低。根据特异性的目的片段占总产物的比例 的统计结果，该比例(文献[1 10])分别为18%， 9%, 11%， 47%， 9%， 60.4%， 20.5%， 19%， 34%， 36%，平均不足30%。而其中特异性比例较高的总是预洗脱液变性能力强的在 文献[6]和[10]中，预洗脱液温度高达58'C和68'C，则特异性比例达到60.4%和36%;在文献 [4]和[9]中，预洗脱液离子强度低至O.lxSSC和0.06xSSC，则特异性比例达到47%和34%。 非特异性的核酸片段由于可以和探针不完全杂交而被部分保留下来。
上述研究中获得的特异性的目的片段还存在特异性低的问题。测序结果表明，其中很大 一部分的特异性的目的片段和探针的匹配程度低，如文献[4]中，作者使用长度30个核苷酸 的核酸捕获探针，但是获得的微卫星的长度绝大部分不到20个核苷酸，这种微卫星位点的应 用价值有限，主要是因为等位基因数目少，限制了其应用价值。这种低特异性的核酸片段由 于可以和探针不完全杂交而被大量保留下来。
上述研究还不同程度的存在重复产物的问题。 一般而言，在特异性的目的片段当中，总 是存在20% (文献[4])到30% (文献[6])的比例的重复。有效的解决方法是，把回收的产物 分成若干份，分别收集特异性的目的片段，就可以将重复产物的比例降到2% (文献[5p。
需要解决的问题是
洗脱产物特异性低以及特异性的目的片段的比例低，是传统的洗脱方法存在的缺陷。因 为部分非目的核酸片段的序列和目的核酸片段的相似，所以可以和探针不完全杂交。这些非目的核酸片段和目的核酸片段一样，可以在预洗脱时保留在固相基质上，而在第二次洗脱时 被洗脱下来，对目的核酸片段的分选有很大的干扰。因此，提高预洗脱液的变性能力对提高
目的核酸片段的特异性十分关键。但是，因为许多非目的核酸片段和目的核酸片段的序列相 似，二者和探针形成的杂交分子的熔点相近，所以在传统的洗脱方法中，确定预洗脱液的变 性能力是个两难的选择。变性能力太低，无法有效清除干扰的非目的核酸片段，变性能力太 高，会使目的核酸片段在预洗脱时被一起清除。因此，估算不同核酸片段形成的杂交分子的 熔点对确定预洗脱液的变性能力非常重要。
此外，很多情况下由于目的核酸片段本身并非单一产物而是一大类别，和探针完全匹配 或者不完全匹配的核酸片段都可以接受。匹配程度不同的核酸片段需要被分别回收，来满足 不同的应用价值，同时也有助于降低重复产物的比例。但是这些仅仅依靠传统的洗脱方法无 法完成。

发明内容
本发明旨在提供一种可提高目的核酸片段的特异性、估算杂交分子的熔点、分选匹配程 度不同的核酸片段，兼顾产量和特异性的核酸杂交分子的洗脱分选方法。 本发明包括以下步骤
2)根据所需要的核酸片段的类型确定核酸片段的特征序列，合成核酸捕获探针；
2) 将核酸捕获探针与待分选的核酸片段退火形成杂交分子，然后固定在固相基质上，或 者先把核酸捕获探针固定在固相基质上，然后再与待分选的核酸片段退火形成杂交分子；
3) 先用低洗脱强度的洗脱液漂洗杂交分子，以获取与探针匹配程度较低的核酸片段，之 后逐渐提高洗脱强度，以获取与探针匹配程度较高的核酸片段；
4) 从最低洗脱强度开始，将步骤3)的一系列梯度的洗脱液依次漂洗固相基质，回收每 一步的洗脱液；
5) 检测每一步的回收洗脱液的核酸片段产量，排除无产物的回收液，在有产物的一系列 回收液中，最高洗脱强度设为上临界洗脱强度；
若对核酸片段特异性要求很高，则只收集上临界洗脱强度下的回收产物，即与探针最匹 配的特异性核酸片段，完成核酸杂交分子的洗脱分选；
若对核酸片段特异性要求不是很高，则继续以下步骤；
6) 将每个梯度的回收产物分别构建文库，通过菌落PCR、菌落载体测序或菌落杂交的方 法分析各个洗脱梯度的产物与探针的匹配程度，估算杂交分子的熔点，了解洗脱不同匹配程 度的核酸片段所需要的不同洗脱强度；7) 确定因特异性太低而无法适用的核酸片段的范围，以及所对应的洗脱强度的范围，该 洗脱强度的上界设为下临界洗脱强度；
8) 从下临界洗脱强度到上临界洗脱强度重新设置一系列洗脱强度梯度的洗脱液，其中低 于下临界洗脱强度的梯度可以合并，高于上临界洗脱强度的梯度可以合并，若需要根据核酸 片段与核酸探针匹配程度的高低对核酸片段进行分别回收，则下临界洗脱强度与上临界洗脱 强度之间需要设置密集的梯度；否则，可以合并下临界洗脱强度与上临界洗脱强度之间的梯 度；
9) 将包含特定序列的捕获探针与待分选的核酸片段杂交，然后将杂交分子固定在固相基 质上；或者先将捕获探针固定在固相基质上，然后将待分选的核酸片段杂交在捕获探针上， 然后从下临界洗脱强度开始，将步骤8)的一系列梯度的洗脱液依次漂洗固相基质，回收每 一步的洗脱液；
10) 根据步骤6)的结果得知各个洗脱梯度的产物的特异性，分别收集不同梯度下的洗 脱产物，达到对同类核酸片段的分级分选，应用于不同的实验需求，即完成核酸杂交分子的 洗脱分选。
在步骤2)中，所述固相基质可选自硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、磁珠、硅胶、硅珠 等中的一种。
在步骤3)中，所述低洗脱强度的洗脱液最好为室温下的6xSSC，所述逐渐提高洗脱强 度的最高洗脱强度的洗脱液最好为98'C下的超纯水，高洗脱强度的离子强度低于低洗脱强度 的离子强度，或者高洗脱强度的温度高于低洗脱强度的温度，或者高洗脱强度的pH值高于 低洗脱强度的pH值。
在步骤5)中，所述核酸片段特异性要求很高是指核酸片段与核酸探针的匹配程度为 80% 100%。所述核酸片段特异性要求不是很高是指核酸片段与核酸探针的匹配程度小于 80%。
本发明涉及的机理是
1) 待分选的核酸片段，包括DNA片段和RNA片段，以及DNA和RNA的衍生物。这 些核酸片段可以是从生物体中直接获取的，也可以使人工合成的。
2) 待分选的核酸片段在序列上的共有特征为特征序列。特征序列的存在与否是鉴定核酸 片段类型的依据，具有特征序列的核酸片段得以采用，没有特征序列的核酸片段不予采用， 特征序列长的核酸片段优先采用。例如polyA序列是mRNA的特征序列，CA重复序列是 CA/TG型微卫星DNA片段的特征序列，GA重复是GA/TC型微卫星DNA片段的特征序列。特征序列是合成核酸捕获探针的根据。
3) 待分选的核酸片段是单链分子，如果待分选的核酸片段是双链分子，那么在杂交前必 需用70 99'C的高温使其变性成为单链分子。核酸捕获探针也是单链分子。待分选的核酸分 子和核酸捕获探针可以在一定条件下退火杂交，也可以在一定条件下变性分离，这是可逆的
过程。而核酸捕获探针可以固定在固相基质上，这是不可逆的过程。例如带生物素标记的
核酸捕获探针可以以很高的亲和力与带抗生物素蛋白的固相基质结合。
4) 两条核酸分子单链根据碱基互补配对的原则杂交形成双链的核酸杂交分子，碱基之间
的氢键维系双链之间的亲和力。两条核酸分子单链的互补程度越高，配对的区域越大，亲和 力就越高，就需要高的温度才能使双链变性分离，即核酸杂交分子的熔点高。但是如果待分 选的目的核酸分子的实际特征序列可能存在长度不足或者碱基变化的情况，导致与核酸捕获 探针不能完全互补配对，于是目的核酸分子与核酸捕获探针的亲和力下降，即核酸杂交分子 的熔点低。
5) 相同的核酸杂交分子，在不同的介质中的熔点是不同的。 一般来说，提高离子强度， 会使核酸杂交分子的熔点提高；提高pH值，会使核酸杂交分子的熔点降低。在温度恒定的 情况下，降低离子强度可以使核酸杂交分子的熔点降低，使原本形成双链的核酸杂交分子变 性分离，与通过提高温度使核酸杂交分子变性分离的效果类似。
6) 低温、高离子强度的溶液可以使低熔点的核酸杂交分子变性分离，却不能使高熔点的 核酸杂交分子变性分离，称为洗脱强度低；高温、低离子强度的溶液可以使低熔点和高熔点 的核酸杂交分子变性分离，称为洗脱强度高。
7) 将待分选的目的核酸片段和探针退火形成杂交分子。其中有些核酸片段和探针匹配程 度较低，亲和力也低，形成的杂交分子熔点也低，只需要低洗脱强度的溶液就可以变性分离； 而有些核酸片段和探针匹配程度较高，亲和力也高，形成的杂交分子熔点也高，需要高洗脱
强度的溶液才可以变性分离。核酸片段的匹配程度的范围可以涵盖从低于5%到100%的区间。
8) 对于熔点不同的核酸杂交分子的混合物。先用低洗脱强度的溶液漂洗，可以使低熔点 的核酸杂交分子变性分离，获得的核酸分子单链的互补程度低，特异性低；再用高洗脱强度 的溶液漂洗，可以使高熔点的核酸杂交分子变性分离，获得的核酸分子单链的互补程度高， 特异性高。逐渐提高洗脱强度，获得的核酸分子单链的特异性也随之逐渐提高。
9) 对于一定长度的核酸捕获探针，形成的核酸杂交分子的熔点有一个上限，就是100% 互补配对的核酸杂交分子的熔点。当洗脱强度达到这个熔点时，所有核酸杂交分子都可以变 性分离，继续提高洗脱强度也不能获得新的核酸单链。本发明所述的核酸杂交分子的洗脱分选方法主要应用于特异性核酸片段的优选，不同匹 配程度的核酸片段的熔点和洗脱强度的估算，以及不同匹配程度的核酸片段的分选。
本发明所述的核酸杂交分子的洗脱分选方法应用于基因组DNA微卫星片段的富集，获 得一系列的微卫星DNA片段。不同的洗脱条件下可以获得不同匹配程度的产物，对于以短 片段重复为探针序列的微卫星杂交分子而言，较高的匹配程度意味着重复次数较多的微卫星 片段，重复次数越多的微卫星片段可以开发出的微卫星标记的多态性也越高。梯度洗脱方法 的最高洗脱强度下获得的微卫星DNA片段具有很高的重复次数，适用于高度多态的微卫星 座位的开发；洗脱强度越低，获得的微卫星DNA片段的重复次数就越少，但产量越高；根 据洗脱产物的分析结果，得知分选重复次数不同的微卫星DNA片段所需要的洗脱强度，设 计更简化且更精确的洗脱强度梯度；从不同梯度的产物中收集重复次数不同的微卫星DNA 片段，可以应用于不同的目的，达到分级分选的效果。
具体实施例方式
以TG型微卫星DNA片段的分选为例，核酸杂交分子的洗脱分选方法的实施步骤为 1 )杂交。用限制性内切酶Sau3AI将基因组DNA消化，连接相应的AFLP接头成为AFLP 片段。在50^L的体系中，将300ng的AFLP片段和15pmol的5'端带生物素标记的DNA探 针杂交。该探针序列为5，-ATACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC-3，，以捕获含TG重复序列的AFLP片段。杂交在热循环仪中进行，程序为 95'C下保持10min，每min降温0.3'C，直到37'C为止。杂交产物用DNA回收试剂盒纯化， 去除多余的探针。
2) 捕获。100nL的体系中，含有步骤l)的杂交产物、6xSSC、 0.1%SDS、 O.Olmg的包 被了链亲和素的磁珠。43"下孵化30min，期间不时振荡防止磁珠下沉凝聚。
3) 磁珠漂洗。用6xSSC、 0.1% SDS的漂洗液50(HiL在6(TC下漂洗磁珠10min，重复1 次；用1.5xSSC、 0.1% SDS的漂洗液500pL在60。C下漂洗磁珠10min，重复1次；用6xSSC、 无SDS的漂洗液500nL在室温下漂洗磁珠lmin，重复3次。
4) 目的片段的梯度洗脱。用lxSSC的洗脱液200nL在64'C下漂洗磁珠10min，收集洗 脱液；用0.5xSSC的洗脱液200pL在64'C下漂洗磁珠10min，收集洗脱液；用0》SSC的洗 脱液200nL在64'C下漂洗磁珠10min，收集洗脱液；用O.lxSSC的洗脱液200^iL在64'C下 漂洗磁珠10min，收集洗脱液；用超纯水200pL在64'C下漂洗磁珠10min，收集洗脱液；用 超纯水200nL在69'C下漂洗磁珠5min，收集洗脱液;用超纯水200pL在74'C下漂洗磁珠5min， 收集洗脱液；用超纯水200pL在79'C下漂洗磁珠5min，收集洗脱液；用超纯水200pL在84°C下漂洗磁珠5min，收集洗脱液；用超纯水20(^L在89'C下漂洗磁珠5min，收集洗脱液；用 超纯水200pL在94'C下漂洗磁珠5min，收集洗脱液;用超纯水200pL在98 °C下漂洗磁珠5min， 收集洗脱液。
5) 回收产物的检测。每个梯度各取lpL的回收洗脱液做模板，根据AFLP接头设计引物， 进行PCR扩增，电泳检测PCR产物。lxSSC、 0.5xSSC、 0.2xSSC、 O.lxSSC这4个洗脱梯度 有产物，电泳检测显示PCR产物为弥散的DNA条带，64'C及以上各个温度的超纯水洗脱液 无产物，电泳检测无条带。
6) 最优片段的筛选。排除无产物的洗脱梯度，O.lxSSC是最高的洗脱强度。回收0.1xSSC 洗脱强度下的PCR产物，连接pMD19-T载体，转化，制备成碱基系列TG重复序列的富集 文库。以pMD19载体序列的通用引物M13/-47和M13/-48分别搭配CA/TG型微卫星的特征 序列的引物(5'-TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-3')做PCR检测文库，发现100%的菌落含有 TG重复序列，表现为很强的阳性。同时，载体测序的结果证实，所有的菌落都含有TG重复 序列，且TG重复次数多大于23次。在非梯度洗脱方法获得的产物中，真正含有TG重复的 不到50%，其中大部分又因为重复次数太少而不具备开发微卫星标记的价值，相对于同类的 非梯度洗脱方法，本发明使用的梯度洗脱方法表现出极高的特异性。
7) 杂交分子的熔点分析。步骤5)的检测结果表明碱基系列AC重复23次的探针和碱 基系列TG重复23次及以上的DNA片段形成的100%匹配杂交分子，在O."SSC洗脱强度 下的熔点约64。C。该洗脱强度为上临界洗脱强度，可以获得最完美的产物。64。C的超纯水及 以上更高的洗脱强度下，探针已经完全变性，无法获得产物。64'C的0,2xSSC及更低的洗脱 强度下，获得的产物是TG重复低于23次、和探针不完全杂交的DNA片段，通过文库扫描 证实这一点。其中64。C的0.2xSSC的洗脱强度下，获得的产物的TG重复在10次以上。而 64'C的0.5xSSC和lxSSC的洗脱强度下，获得的产物的TG重复很多不足10次。于是，将 64'C的0.5xSSC设为下临界洗脱强度。因此，64'C的超纯水及以上更高的洗脱强度梯度可以 取消或者合并；64'C的0.5xSSC以下的洗脱强度梯度可以合并；64'C的0."SSC的洗脱强度 以下可以划分成更密集的梯度，通过文库扫描得知不同匹配程度的产物所需要的不同洗脱强 度，满足更精细的分析和分选要求。
8) 同类DNA片段的分级分选。根据步骤7)文库扫描的结果分析，64'C的0，2xSSC的 洗脱强度下，产物含有TG重复次数虽然低于23，但还是可以满足微卫星位点开发的要求， 因此，64'C的0.2xSSC的洗脱强度和64'C的O.lxSSC的洗脱强度下的产物被分别用于构建文 库，来开发不同的微卫星位点。本步骤使虽不能100%和探针匹配却仍然有很高价值的核酸片段得以采用，相对于步骤6)，本步骤在基本保证产物特异性的前提下最大程度地提高了产量。 相对于同类的非梯度洗脱方法，本发明使用的梯度洗脱分选方法使不同的核酸片段依据其特 征序列与探针序列的相似程度，被不同的梯度洗脱回收，实现对同类核酸片段的分选，在一 定程度上缓解了文库中重复克隆造成的困扰。如果对分选有更高的要求，可以在0.1xSSC和 0.2xSSC之间，以及0.2><88(:和0.5><88(:之间插入更多的洗脱强度梯度，实现更精细的分选。 以下给出核酸杂交分子的洗脱分选方法的应用实例。
(1) 豹纹鳃棘舻基因组TG型微卫星DNA片段的分选。64。C时采用lxSSC、 0.5xSSC、 O.lxSSC、超纯水4个洗脱梯度，64'C以上每5'C设置一个超纯水洗脱梯度，直到98'C。 PCR 检测结果显示，lxSSC、 0.5xSSC、 O.lxSSC这3个洗脱梯度有产物，64'C及以上各个温度的 超纯水洗脱液中无产物。用O.lxSSC洗脱梯度产物制备成TG重复序列的富集文库，文库中 950/。的菌落含有TG重复序列，载体测序的结果证实，TG重复次数多大于16次。用0.5xSSC 和lxSSC的洗脱梯度的混合产物制备成TG重复序列的富集文库，文库中不到30%的菌落含 有TG重复序列，载体测序的结果证实，TG重复次数多在12次以下。将O.lxSSC的富集文 库的微卫星序列开发为分子标记，应用于豹纹鳃棘鲈种群遗传学的研究。
(2) 杂交分子的熔点分析和洗脱液梯度的调整。根据豹纹鳃棘鲈基因组TG型微卫星 DNA片段的分选结果得知64'C时，AC重复23次的探针和TG重复23次及以上的DNA片 段形成的100%匹配杂交分子在0.5xSSC中不能完全解链，在O.lxSSC中可以完全解链。这 便于调整洗脱液梯度的设置在0.5xSSC和O.lxSSC之间加入一个0.2xSSC的洗脱液梯度， 合并64'C以上的各个超纯水梯度。
(3) 条纹斑竹鲨基因组TG型微卫星DNA片段的分选。根据豹纹鳃棘鲈基因组TG型 微卫星DNA片段的分选结果调整洗脱液梯度的设置64'C时采用1xSSC、0.5xSSC、0.2xSSC、 O.lxSSC 4个洗脱梯度，64'C以上设置一个98'C的超纯水洗脱梯度。PCR检测结果显示， lxSSC、 0.5xSSC、 0.2xSSC、 O.lxSSC这4个洗脱梯度有产物，而超纯水洗脱液中无产物。 用O.lxSSC洗脱梯度产物制备成TG重复序列的富集文库，文库中100%的菌落含有TG重复 序列，载体测序的结果证实，TG重复次数多大于22次。用0.2><88(:洗脱梯度产物制备成丁0 重复序列的富集文库，文库中85y。的菌落含有TG重复序列，载体测序的结果证实，TG重复 次数多在10到22次之间。用0.5xSSC和lxSSC的洗脱梯度的混合产物制备成TG重复序列 的富集文库，文库中不到30o/。的菌落含有TG重复序列，载体测序的结果证实，TG重复次数 多在12次以下。分别将O.lxSSC和0,2xSSC的富集文库的微卫星序列开发为分子标记，应 用于条纹斑竹鲨种群遗传学的研究。
权利要求
1.核酸杂交分子的洗脱分选方法，其特征在于包括以下步骤1)根据所需要的核酸片段的类型确定核酸片段的特征序列，合成核酸捕获探针；2)将核酸捕获探针与待分选的核酸片段退火形成杂交分子，然后固定在固相基质上，或者先把核酸捕获探针固定在固相基质上，然后再与待分选的核酸片段退火形成杂交分子；3)先用低洗脱强度的洗脱液漂洗杂交分子，以获取与探针匹配程度较低的核酸片段，之后逐渐提高洗脱强度，以获取与探针匹配程度较高的核酸片段；4)从最低洗脱强度开始，将步骤3)的一系列梯度的洗脱液依次漂洗固相基质，回收每一步的洗脱液；5)检测每一步的回收洗脱液的核酸片段产量，排除无产物的回收液，在有产物的一系列回收液中，最高洗脱强度设为上临界洗脱强度；若对核酸片段特异性要求很高，则只收集上临界洗脱强度下的回收产物，即与探针最匹配的特异性核酸片段，完成核酸杂交分子的洗脱分选；若对核酸片段特异性要求不是很高，则继续以下步骤；6)将每个梯度的回收产物分别构建文库，通过菌落PCR、菌落载体测序或菌落杂交的方法分析各个洗脱梯度的产物与探针的匹配程度，估算杂交分子的熔点，了解洗脱不同匹配程度的核酸片段所需要的不同洗脱强度；7)确定因特异性太低而无法适用的核酸片段的范围，以及所对应的洗脱强度的范围，该洗脱强度的上界设为下临界洗脱强度；8)从下临界洗脱强度到上临界洗脱强度重新设置一系列洗脱强度梯度的洗脱液，其中低于下临界洗脱强度的梯度合并，高于上临界洗脱强度的梯度合并，若需要根据核酸片段与核酸探针匹配程度的高低对核酸片段进行分别回收，则下临界洗脱强度与上临界洗脱强度之间需要设置密集的梯度；否则，合并下临界洗脱强度与上临界洗脱强度之间的梯度；9)将包含特定序列的捕获探针与待分选的核酸片段杂交，然后将杂交分子固定在固相基质上；或者先将捕获探针固定在固相基质上，然后将待分选的核酸片段杂交在捕获探针上，然后从下临界洗脱强度开始，将步骤8)的一系列梯度的洗脱液依次漂洗固相基质，回收每一步的洗脱液；10)根据步骤6)的结果得知各个洗脱梯度的产物的特异性，分别收集不同梯度下的洗脱产物，达到对同类核酸片段的分级分选，应用于不同的实验需求，即完成核酸杂交分子的洗脱分选。
2. 如权利要求1所述的核酸杂交分子的洗脱分选方法，其特征在于在步骤2)中，所述固相基质选自硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、磁珠、硅胶、硅珠中的一种。
3. 如权利要求1所述的核酸杂交分子的洗脱分选方法，其特征在于在步骤3)中，所述 低洗脱强度的洗脱液为室温下的6xSSC，所述逐渐提高洗脱强度的最高洗脱强度的洗脱液为 98'C下的超纯水。
4. 如权利要求1所述的核酸杂交分子的洗脱分选方法，其特征在于在步骤3)中，高洗 脱强度的离子强度低于低洗脱强度的离子强度，或者高洗脱强度的温度高于低洗脱强度的温 度，或者高洗脱强度的pH值高于低洗脱强度的pH值。
5. 如权利要求1所述的核酸杂交分子的洗脱分选方法，其特征在于在步骤5)中，所述 核酸片段特异性要求很高是指核酸片段与核酸探针的匹配程度为80% 100%。
6. 如权利要求1所述的核酸杂交分子的洗脱分选方法，其特征在于在步骤5)中，所述 核酸片段特异性要求不是很高是指核酸片段与核酸探针的匹配程度小于80%。
全文摘要
核酸杂交分子的洗脱分选方法，涉及一种核酸片段的分选方法，特别是涉及一种主要用于分离重复次数不同的微卫星DNA片段的分选方法。提供一种可提高目的核酸片段的特异性、估算杂交分子的熔点、分选匹配程度不同的核酸片段，兼顾产量和特异性的核酸杂交分子的洗脱分选方法。将包含特征序列核酸捕获探针和待分选的核酸片段杂交，并固定在固相基质上，用洗脱液漂洗以获得产物。逐渐提高洗脱液的洗脱强度，便获得特异性越来越高的产物。分析不同洗脱强度下产物的特异性，以便分别收集特异性不同的产物，实现对同类核酸片段的分选。
文档编号C12N15/10GK101654671SQ20091011235
公开日2010年2月24日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者丁少雄, 曾华嵩, 颖 王, 苏永全 申请人:厦门大学