专利名称：罗氏沼虾诺达病毒核酸点杂交检测的方法
技术领域：
本发明属于虾类病害检测技术领域，具体涉及一种罗氏沼虾诺达病毒核酸点杂交检测的方法，适用于罗氏沼虾肌肉白浊病病原的诊断。
参考文献(1)Arcier J.M.，Herman F.，Lightner D.V.，Redman R.M.，Mari J.&Bonami J.R.(1999).A viral disease associated with mortalities in hachery-reared postlarvaeof the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii.Diseases ofAquatic Organisms，38，177-181.
(2)Bonami J.R.(2002)A new viral disease in the giant freshwater prawnMacrobrachium rosenbergii.World Aquaculture 2002.Annual Meetings of theWorld Aquaculture Society and the China Society of Fisheries，April 23-27，2002.Beijing Convention Center，Beijing China.Abstract，p.79.
(3)钱冬 杨国梁 刘问等。罗氏沼虾苗肌肉白浊病病原研究。水生生物学报，2002，26472-476(4)Romestand B.& Bonami J.R.(2002)A sandwich enzyme linked immunosorbentassay(S-ELISA)for detection of MrNV in the giant fresh water prawnMacrobrachium rosenbergii.Journal of Fish Diseases，(in press).
(5)Tung C.W.，Wang C.S.& Chen S.N.(1999)Histological and electronmicroscopic study on Macrobrachium muscle virus(MMV)infection in the giantfreshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii(de Man)，cultured in Taiwan.Journal of Fish Diseases，22，1-5.
参考资料(1)、(2)(3)和(5)主要侧重于罗氏沼虾肌肉白浊病的病原研究，在组织病理、病毒的超微结构和生化特征的水平上对病毒进行描述。资料(4)报道了一种罗氏沼虾诺达病毒的免疫检测方法，该方法操作简单、快速，但灵敏度低。
为了达到以上目的，本发明采取以下技术方案(1)制备试剂盒试剂盒含有所有检测程序中的必要成分，包括病毒核酸探针、样品处理液、杂交液，封闭液、抗地高辛抗体、洗涤液、显色剂、阳性对照、阴性对照、1.5ml离心管、杂交膜、杂交带、研磨小棒。
(2)建立最佳的杂交反应体系。包括组织取材部位(整个幼苗或附肢)，最佳探针浓度(30-50ng/ml)，杂交温度(42℃)，杂交液系统(杂交液采用50％甲醛，0.05M磷酸钠2×SSC，2％封闭液，7％十二烷基硫酸酸钠，0.1％十二烷基肌氨酸钠)。
本发明主要技术难点(1)特异性病毒核酸探针的制备。地高辛探针的制备用多聚酶链反应扩增(PCR)方法。在100μl反应体积内加入10μl 10x缓冲液，7μl 25mM氯化镁，10μl地高辛核甘酸混合物，2μl l0μM的上下游质粒通用引物(上游引物cgccagggttttcccagtcacgac；下游引物gagcggataacaatttcacacagg)，1μl耐高温核糖核甘酸聚合酶(Tag DNA聚合酶)，1μl含罗氏沼虾诺达病毒基因组(cDNA)片段的质粒DNA(10-50ng)。PCR结束后，在PCR产物中加入10μl 200μM乙二胺四醋酸，pH8.0、1μl 4M氯化俚和2倍体积的无水乙醇沉淀并干燥DNA，然后溶在50μl的无菌蒸馏水中。
(2)组织样品处理。(整个幼苗或成虾的附肢)，放入1.5ml的离心管内，加入样品处理液(1∶10重量/体积)，用研磨小棒研磨直至组织被研碎。低速离心(3000g)后取上清1μl按1∶5稀释，70℃处理15min并迅速放置冰上。
(3)点杂交程序的优化。首先是探针浓度的确定，合适的探针浓度为30-50ng/ml杂交液；其次是杂交液的选择，杂交液采用50％甲醛，0.05M磷酸钠2xSSC，2％封闭液，7％十二烷基硫酸酸钠，0.1％十二烷基肌氨酸钠；再次是杂交温度的选择，根据杂交液成分和病毒核酸性质，42℃为最佳杂交温度。
本发明与现有技术相比有以下优点灵敏度高，能检测出少于26ng的病虾组织中的诺达病毒和少于2.5ng的病毒RNA；样品处理程序简单；不需要特殊昂贵的仪器；成本低；可以同时检测多个样品。
(2)探针的制备地高辛探针的制备用常规PCR方法，将PCR产物标记上地高辛。扩增引物来自质粒通用引物，构建罗氏沼虾诺达病毒cDNA文库。
(3)样品处理称取样品(幼苗整个或成虾的鳃)，放入1.5ml的离心管内，加入样品处理液(1∶10重量/体积)，样品处理液为焦碳酸二乙酯处理的缓冲液，缓冲液配方为0.02M三氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，0.4M氯化钠(NaCl)，pH7.4)，用研磨小棒研磨直至组织被研碎。低速离心(3000g)后取上清1μl按1∶5稀释，70℃处理15min并迅速放置冰上。
取不同稀释度的点杂交样品1μl，点在带正电荷的尼龙膜上，紫外灯下处理3min。
(4)预杂交和杂交将杂交膜放入杂交带内，加入预杂交液使杂交膜被溶液覆盖，预杂交液为50％甲醛，0.05M磷酸钠2×SSC，2％封闭液，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.1％十二烷基肌氨酸钠，封闭好杂交带，在42℃预杂交1-4小时。然后用预杂交液稀释探针(30-50ng/ml)，向杂交带内加入探针杂交液，42℃杂交过夜。
(5)洗涤将杂交膜放在干净的平皿内，用洗涤液在室温条件下洗涤2次，洗涤液为2×SSC，0.1％SDS，每次15min。将杂交膜重新放回干净的杂交带内，用洗涤液，洗涤液为0.1×SSC，0.1％SDS，在68℃洗涤2次，每次15min。
(6)封闭弃洗涤液，洗涤液为0.1×SSC，0.1％SDS，加入缓冲液，缓冲液为1％封闭液，室温下孵育30min。
(7)抗体抗原反应用缓冲液稀释抗地高辛抗体(1∶5000稀释)，缓冲液为1％封闭液，放入杂交带内，室温下孵育30min。
(8)洗涤取出杂交膜放在干净的平皿内，用缓冲液在室温下连续洗涤2次，缓冲液为100mM马来酸(Maleic acid)，150mM Nacl，pH7.5(20℃)，每次15min。
(9)显色用缓冲液配置显色底物(2ml缓冲液中加入9ul氯化硝基四氮唑蓝盐(NBT)和7ul 5-溴-4氯-3吲哚磷酸盐(BCIP)。缓冲液为100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM MgCl2，pH9.5，将杂交膜放在干净的杂交带内，放入显色底物覆盖杂交膜，在避光处显色(30min-2hr)。肉眼观察结果，显棕色为弱阳性反应，蓝紫色为强阳性反应。
(10)终止反应弃显色液，加入终止液。终止液为100mM Tris-Hcl；1mM乙二胺四乙酸(EDTA)；pH9.5(20℃)。记录结果。
权利要求
1.一种罗氏沼虾诺达病毒核酸点杂交检测的方法，包括下列步骤(1)制备试剂盒包括病毒核酸探针、样品处理液、杂交液，封闭液、抗地高辛抗体、洗涤液、显色剂、阳性对照、阴性对照、1.5ml离心管、杂交膜、杂交带、研磨小棒；(2)探针的制备地高辛探针的制备用常规PCR方法，将PCR产物标记上地高辛，扩增引物来自质粒通用引物，构建罗氏沼虾诺达病毒cDNA文库；(3)样品处理称取样品，放入1.5ml的离心管内，加入样品处理液，用研磨小棒研磨直至组织被研碎，低速离心后取上清1μl按1∶5稀释，70℃处理15min并放置冰上；(4)预杂交和杂交将杂交膜放入杂交带内，加入预杂交液使杂交膜被溶液覆盖，封闭好杂交带，在42℃预杂交1-4小时，然后杂交带内加入探针杂交液，42℃杂交过夜；(5)洗涤将杂交膜放在干净的平皿内，用洗涤液在室温条件下洗涤2次，将杂交膜重新放回干净的杂交带内，加入洗涤液在68℃洗涤2次，每次15min；(6)封闭弃洗涤液，加入1％封闭液，室温下孵育30min；(7)抗体抗原反应用缓冲液稀释抗地高辛抗体，放入杂交带内，室温下孵育30min；(8)洗涤取出杂交膜放在干净的平皿内，用缓冲液在室温下连续洗涤2次；(9)显色用缓冲液配置显色底物，将杂交膜放在干净的杂交带内，放入显色底物覆盖杂交膜，在避光处显色，肉眼观察结果，显棕色为弱阳性反应，蓝紫色为强阳性反应；(10)终止反应；弃显色液，终止液，记录结果。
全文摘要
本发明公开了一种罗氏沼虾诺达病毒核酸点杂交检测的方法，其步骤是首先是探针的制备；其次是样品处理；第三是预杂交和杂交；第四洗涤；第五是封闭；第六是抗体抗原反应；第七是洗涤；第八是显色反应；最后终止反应。本发明灵敏度高，成本低，适合于罗氏沼虾肌肉白浊病病原的诊断以及亲虾、幼苗和成虾的健康状态检测。
文档编号C12P19/34GK1438330SQ0311873
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月6日 优先权日2003年3月6日
发明者石正丽, 宝纳米·简·罗伯特 申请人:中国科学院武汉病毒研究所