专利名称：凡纳滨对虾诺达病毒现场快速检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于海洋生物病原检测技术领域，具体涉及一种凡纳滨对虾诺达病毒 (Penaeus vannamei Nodavirus, PvNV)的现场快速高灵敏检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
凡纳滨对虫下诺达病毒(Penaeus vannamei nodavirus,PvNV)是一种无囊膜的RNA 病毒，呈二十面体状，直径约为22nm，其基因组由两条单链RNA组成(其中RNA-I长3111bp， RNA-2长1183bp)；该病毒能引起凡纳滨对虾的肌肉坏死，对虾感染该病毒后的症状与感染了传染性肌肉坏死病毒(Infectious Myonecrosis Virus, IMNV)后的症状非常相似，主要表现为为病虾尾部出现白色、不透明的病理损伤，组织病理学表现为骨骼肌肌肉呈多病灶坏死、血细胞纤维化，此外横纹肌、淋巴器官及结缔组织中可见嗜碱性的胞浆包涵体；该病毒的感染可引起对虾50%以上的死亡率。2004年在伯利兹首次发现该病毒；研究发现，发病区域的鸟类粪便、藤壶、红树林蟹、小型浮游动物、食蚊鱼、养殖凡纳滨对虾中均能检测到该病毒。目前，除伯利兹外，其他国家和地区尚未见有该病毒存在的报道，2010年以来，我国南方多省连续出现养殖凡纳滨对虾大批死亡的情况，发病对虾呈现“肌肉坏死和白浊”等症状，具体病原尚未明确，不排除与PvNV有关。所以研究并建立PvNV的快速检测预警技术， 加强虾苗种和成虾检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，有效切断病毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展就显得尤为迫切和重要。目前，PvNV检测还主要依赖于病理切片法、电镜观察法、抗体杂交法和RT-PCR检测法。病理切片法不能直接对病毒进行检测，只能利用发病的组织病理征兆进行检测，并且还局限于在实验室内进行；电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长、准确性低；用抗体检测法检测PvNV虽然在速度上优于病理切片法， 但其灵敏度较低，在PvNV尚未引发感染或感染的极早期很难用抗体法检测出来；PvNV的 RT-PCR检测法，虽然克服了前面几种方法的缺点，在实验室条件下能实现对PvNV的相对快速、准确检测，但由于常规的RT-PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，使得 RT-PCR检测法难以用于现场的快速检测，这大大限制了 RT-PCR检测方法在生产中的推广应用。进行凡纳滨对虾诺达病毒早期检测并采取预防措施是水产养殖中降低凡纳滨对虾诺达病毒流行风险、减少发病照成巨额经济损失的有效手段，所以建立简单、快速、高灵敏的检查方法，并开发适于现场应用的凡纳滨对虾诺达病毒检测试剂盒就尤为必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种凡纳滨对虾诺达病毒现场快速检测试剂盒及检测方法， 即一种适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的凡纳滨对虾诺达病毒检测方法，并将检测方法标准化；同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，使PvNV的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便，以克服现有技术的不足。
本发明利用针对PvNV的衣壳蛋白基因中保守区段设计的环介导等温扩增4条特异引物、一种反转录酶和一种DNA聚合酶，无需单独对目的核酸(RNA)进行反转录，在恒定温度下保温一段时间即可同步完成对目的核酸的反转录和扩增，实现对PvNV的快速和高灵敏检测。同时本发明对FTA卡制备样品核酸的标准步骤进行了优化，能有效缩短样品制备时间。本发明的环介导等温扩增引物，其序列如下上訪字引物 1 upper primer ISEQ ID NO 1 GCGTTCCCAATAACTAGACAAACCTTTTGACCGTATACTTGTTAAGCAA下訪字引物 1 downstream primer 1 SEQ ID NO 2 ATAAGTGGTTATCAGCTGTAGCCCTTTTTCAATATACATGACAAACTGACAG上游引物2 upper primer2 SEQ ID NO 3 TCTACTAGTATCGTTACTCCAG下游引物 2 downstream priemr 2 SEQ ID NO 4 GATCGTCGAGAGGATCAG 。本发明的检测试剂盒包括(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；(2)漂洗管，内装蒸馏水；(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料，扩增反应液组成成分如下扩增引物的上游引物1和下游引物1各1 2 μ M，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0. 1
0.4“] ，(^1 、(1111\( ^13和(1013各0.8 2.OmMjMgCl2 4 10mM，Betaine (甜菜碱)0. 6
1.2M, Tris-HCl 10 40mM，KCl 10 20mM，MgSO4 1 4mM，(NH4)2SO4 6 12mM，Triton X-1000. 05% 1. 0%，反转录酶1 20U，Bst DNA聚合酶2 20U ；染料可以选金属离子与钙黄绿素形成的配合物，也可以选核酸染料，只需其中一种即可；金属离子与钙黄绿素形成的配合物预混于扩增反应液中，核酸染料为分子生物学研究中常用的核酸染料，包括但不限于 SYBR Green、GelRed, GelGreen, GoldView 、GeneFinder 等，核酸染料预先粘附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管盖子内侧；(5)阴性对照管，内装无凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，内装吸附了凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。本发明的检测试剂盒用于检测水体、饵料中是否存在诺达病毒。用本发明上述检测试剂盒检测PvNV的方法，按下列步骤进行(1)取样品组织约0. 02 1. Og置于采样管中，用研磨棒将样品组织磨碎至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品组织将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置1 20min ；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗管3 5min以洗涤FTA膜片；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于55 65°C条件下保温40 70min ；(6)将扩增检测管上下反复甩动l-3min ；(7)用力向下甩动扩增检测管，使管内混有染料的扩增反应液集聚于扩增检测管底部，用眼睛观察反应液，如果反应液呈现绿色则表示该样品的PvNV检测结果为阳性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的PvNV检测结果为阴性。在上述步骤中，从第(4)步开始应将作为阴性对照的无凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片、作为阳性对照的吸附了凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片，以及吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测。本发明在试剂盒中汇集PvNV现场快速检测所需的FTA膜片、TE缓冲液、扩增反应液、染料等试剂和研磨棒、牙签、吸管等器材，使得PvNV的检测能够快速有序地进行，实现了检测过程的程序化和标准化，使得操作规范、不易出错；本发明依据优选的PvNV衣壳蛋白保守区序列所设计的扩增引物能有效检测PvNV的所有毒株，而与其他病毒的衣壳蛋白又无同源性，检测特异性非常好；采用醇类物质对取样后的FTA膜片进行快速干燥处理，使得样品核酸的制备时间大大缩短；采用内置染料的方法，在反应结束后不用打开反应管即可直接对反应液进行染色，避免了打开反应管再添加染料使后续待检样品被扩增产物污染而造成假阳性的结果，从而大大提高了该方法在检测中应用的可靠性。。
具体实施例方式本发明依据优选的PvNV衣壳蛋白保守区序列所设计的扩增引物能有效检测PvNV 的所有毒株，而与其他病毒的衣壳蛋白又无同源性，检测特异性非常好。同时，为了进一步缩短检测时间、消除检测过程中可能发生的污染、简化检测步骤，使检测实验能够在养殖现场开展，本发明对PvNV的检测方法进行了优化。在用FTA卡制备样品核酸的标准步骤中， 需要将被样品勻浆液润湿的FTA膜片在室温下干燥至少一个小时，然后才能进行漂洗；本发明通过在被样品勻浆液润湿的FTA膜片上滴加亲水性且易挥发的醇类物质(主要是叔醇、伯醇和仲醇)，使润湿的FTA膜片在室温条件下仅需几分钟即可完成干燥过程，大大缩短了样品核酸制备的时间。在利用等温扩增方法检测病原时，目前普遍采用扩增反应结束后向反应管中添加核酸染料以判断检测结果的方法；由于等温扩增反应的产物量非常大， 这种打开反应管再添加核酸染料的方法极易导致后续待检样品被污染而使检测结果出现假阳性；有报道和专利采用在扩增反应试剂中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)的方法消除污染风险，但却增加了成本；本发明通过在用于扩增反应的小管内预置染料的方法，可有效消除污染风险，又不增加成本。本发明含有两种方法将染料预置于扩增反应的小管， 其一是将金属离子与钙黄绿素形成的配合物(即染料)与扩增反应液预先混合，置于扩增反应小管内；其二是先将核酸染料粘附到扩增反应管的内侧上方或盖子内侧，等扩增反应结束后再通过上下反复震荡使扩增反应液和核酸染料混合；这样反应结束后无须打开扩增反应管就能完成扩增产物的染色，消除了打开扩增反应管再添加核酸染料过程中反应液可能溅出造成后续待检样品被污染的风险。在用FTA卡制备样品核酸的标准步骤中，需要用 Whatman公司(英国)专门的纯化试剂反复漂洗FTA膜片；本发明无需专门的纯化试剂，采用普通的蒸馏水漂洗即可完成FTA膜片的纯化，不仅简化了检测的操作步骤，还降低了实验成本。为了使该检测方法在生产现场具有更强的实用性，本发明在上述优化整个检测方法的基础上，将检测PvNV病毒所需的试剂及器材进行了组装、配套，使之标准化，形成了检测试剂盒。以下通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1本发明的检测试剂盒由以下部件组成(可检测4个样品的包装)(1)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；(2)漂洗管，6个，每个管内装有Iml的蒸馏水；(3)核酸变性管，6个，每个管内装有20μ L的TE缓冲液(含IOmM Tris-HCl和 ImM EDTA,ρΗ8· 0)；(4)扩增检测管，6个，每个管内装有24 μ L扩增反应液和1 μ L的染料，扩增反应液组成成分如下扩增引物的上游引物1和下游引物1各1. 6 μ Μ，扩增引物的上游引物 2 和下游引物 2 各 0. 2 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 1. 4mM, MgCl2 8mM, Betaine (甜菜碱)1· 2M，Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgS042mM, (NH4)2SO4 IOmM, Triton X-1000.1%，反转录酶5U，Bst DNA聚合酶8U ；染料为50 μ M钙黄绿素和氯化锰形成的配合物；(5)阴性对照管，1个，内装无凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，1个，内装吸附了凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，1管，内装500 μ L无水乙醇；(S)FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(1个)分别封装于无菌袋中；(9)包装盒(1个)，内装一块有多个小孔的海绵块，海绵块上有小孔4X6个；(10)使用说明书，1份。实施例2本发明的检测试剂盒也可由以下部件组成(可检测4个样品的包装)(1)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；(2)漂洗管，6个，每个管内装有Iml的蒸馏水；(3)核酸变性管，6个，每个管内装有20μ L的TE缓冲液(含IOmM Tris-HCl和 ImM EDTA,ρΗ8· 0)；(4)扩增检测管，6个，每个管内装有25 μ L扩增反应液和IyL的核酸染料，扩增反应液组成成分如下扩增引物的上游引物1和下游引物1各1. 6 μ Μ，扩增引物的上游引物 2 和下游引物 2 各 0. 2 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 1. 4mM, MgCl2 8mM, Betaine (甜菜碱)1· 2M，Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 1 OmM, Triton X-1000.1%，反转录酶5U，Bst DNA聚合酶8U ；核酸染料1 μ L，成分为稀释10倍的GeneFinder ，且核酸染料已粘附固定于扩增检测管的管盖内侧。(5)阴性对照管，1个，内装无凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，1个，内装吸附了凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，1管，内装500 μ L无水乙醇；(S)FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(1个)分别封装于无菌袋中；(9)包装盒(1个)，内装一块有多个小孔的海绵块，海绵块上有小孔4X6个；(10)使用说明书，1份。实施例3使用本发明的检测试剂盒检测凡纳滨对虾诺达病毒的方法
(1)取样品组织约0. Ig置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置IOmin ；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min ；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，57°C保温 60min ；(6)将扩增检测管上下反复甩动2min ；(7)然后用力向下甩动扩增检测管，用眼睛观察扩增反应液，如果呈现绿色则表示该样品的PvNV检测结果为阳性，如果呈现橙黄色则表示该样品的PvNV检测结果为阴性。在上述步骤中从第4步开始，应将无凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片、吸附了凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。结果发现，本发明设计的环介导等温扩增引物可以准确的检测带有凡纳滨对虾诺达病毒核酸的阳性样品，在实际检测中没有出现假阳性和假阴性的结果。实施例4使用本发明试剂盒检测饵料中病毒存在情况使用实施例1或实施例2中的检测试剂盒，按下列步骤进行(1)取凡纳滨对虾鲜饵料约0. Ig置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置IOmin ；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min ；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，57°C保温 60min ；(6)将扩增检测管上下反复甩动2min ；(7)然后用力向下甩动扩增检测管，用眼睛观察扩增反应液，如果呈现绿色则表示该样品的PvNV检测结果为阳性，如果呈现橙黄色则表示该样品的PvNV检测结果为阴性。在上述步骤中从第4步开始，应将无凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片、吸附了凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。实施例5利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备虾病毒核酸为了验证本发明中快速核酸制备方法制备核酸的效果，分别利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法分别从感染PvNV的虾中制备病毒核酸。
首先利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备病毒核酸(1)取约10-20毫克的虾附肢放入1. 5mL离心管中，加入100 μ L份PBS缓冲液，用研磨棒将附肢研磨成浆状；(2)用吸液管将研磨的组织勻浆液加到FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加 25μ L (3)将加好样品的FTA卡室温放置干燥至少一个小时；
(4)用一个钻取工具从所上述干燥后的FTA卡上取下直径约2. Omm的圆片，放进 1. 5mL离心管中；(5)在上述离心管中加入200 μ L PTA纯化试剂(Whatman产品编号WG120204)，
静置5分钟；(6)用吸液管将离心管内的PTA纯化试剂全部吸出；(7)重复步骤(5)——(6)两次；(8)在上述离心管中加入 200μ L TE 缓冲液(IOmM Tris-NCl,0. ImM EDTA, ρΗ 8. 0)，静置5分钟；(9)用吸液管将离心管内的TE缓冲液全部吸出；(10)重复步骤⑶——(9)两次；(11)将上述离心管内的圆片在室温下干燥大约一个小时，圆片即可用于核酸的扩增了。利用本发明中快速核酸制备方法按下面的步骤制备虾病毒核酸(1)取约10-20毫克的虾附肢放入1. 5mL离心管中，用研磨棒将虾附肢研磨成浆状；(2)用吸液管将研磨的组织勻浆液加到3个FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加 5 μ L ；(3)将3个FTA卡上分别滴加100 μ L甲醇、无水乙醇和异丙醇，室温放置3 5分钟；(4)用一个钻取工具从所上述3个PTA卡上分别取下直径约2. Omm的圆片放进 1. 5mL离心管中；(5)在上述离心管中加入800 μ L灭菌水，剧烈震荡3分钟；(6)取出离心管内的圆片即可用于核酸的扩增了。从上述过程中可以看出，采用Whatman-PTA卡标准核酸制备方法大约需要2个多小时才能完成核酸制备，而采样本发明的快速核酸制备方法大约只需要6 10分钟就可以完成核酸制备；所以与Whatman-FTA卡标准核酸制备方法相比，本发明的快速核酸制备方法具有操作简单、快速的优点。实施例6Whatman-PTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备虾病毒核酸的效果对比用实施例5中Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备的虾病毒核酸分别作为模板，进行等温扩增反应，每个扩增反应中含25 μ L扩增反应液，扩增反应液组成成分如下扩增引物的上游引物1和下游引物1各1. 5 μ Μ，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.3“] ，(^1 、(1111\( ^13和(1013各1. 5mM,MgCl2 7mM, Betaine (甜菜碱)1·3Μ，Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgSO4 2mM, (NH4)2SO4 IOmM, Triton X-1000. 1%, 反转录酶2U，Bst DNA聚合酶8U ；等温扩增反应条件为58°C保温60分钟，然后90°C保持 5分钟；最后将每个反应管中的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果发现，利用本发明快速核酸制备方法(制备核酸过程中采用了甲醇、无水乙醇和异丙醇等挥发性醇类作为快速干燥液)制备的核酸均可以有效用作等温扩增反应的模板，并且扩增效果略好于采用 Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备的核酸的扩增效果。
综上所述，本发明检测试剂盒及其检测方法不仅可以应用于虾组织样品中PvNV 的检测，还可应用于虾饵料、养殖水体中PvNV的检测。本发明中所述的PTA膜片是英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片；将FTA 卡片裁切成尺度为长X宽不小于1毫米Xl毫米的纸片或打孔成直径不小于1毫米的纸片即可制成FTA膜片。本发明的试剂盒所使用的试剂和材料引物由上海生物工程有限责任公司合成； 乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜碱(Betaine)、dATP、dGTP、d6TP和dTTP、 KCUMgSO4, (NH4)2SO4, MgCl2, Triton X-100购自上海生物工程有限责任公司；无水乙醇、甲醇、异丙醇、钙黄绿素、氯化锰等购自国药集团化学试剂北京有限公司；等温扩增用的Bst DNA聚合酶、反转录酶等购自NEB公司；核酸染料GeneFinder 购自厦门百维信生物科技有限公司。本发明将目的核酸(RNA)的反转录和扩增结合起来同步进行，节省了时间，仅需 1. 5 2小时就可完成PvNV的检测；并且检测过程无需昂贵的仪器设备如离心机、PCR仪和凝胶成像系统，仅需水浴锅或金属浴甚至更简单的保温装置即可；而且检测结果非常容易判别；与PvNV已有检测技术相比，本发明的检测方法成本非常低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高，可以替代凡纳滨对虾诺达病毒之前的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法、抗体检测法和RT-PCR检测法；本发明的检测试剂盒不仅可在实验室内使用，也可在野外的生产现场使用，对加强PvNV的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。
权利要求
1.用于检测凡纳滨对虾诺达病毒的环介导等温扩增引物，其引物序列分别为SEQID NO :1 4。
2.—种凡纳滨对虾诺达病毒现场快速高灵敏检测试剂盒，其特征是该检测试剂盒包括(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；(2)漂洗管，内装蒸馏水；(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料，扩增反应液由以下组份组成扩增引物的上游引物1和下游引物1各1 2 μ M，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0. 1 0. 4 μ M， dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 0. 8 2. OmM, MgCl2 4 10mM，甜菜碱 0. 6 1. 2M, Tris-HCl 10 40mM，KCl 10 20mM，MgS04 1 4mM，(NH4) 2S04 6 12mM，Triton X-100 0· 05% 1. 0%，反转录酶1 20U，具有链置换活性的DNA聚合酶2 20U ；(5)阴性对照管，内装无凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，内装吸附了凡纳滨对虾诺达病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液；(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管；其中上游引物1、下游引物1、上游引物2和下游引物2的序列分别为SEQ ID N0:1 4。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于上述染料为钙黄绿素。
4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于上述染料为分子生物学中应用的核酸染料。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于上述的分子生物学中应用的核酸染料
6.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于所述的快速干燥液是亲水性且易挥发的醇类物质。
7.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于上述扩增检测管内的染料与扩增反应液混合或粘附于扩增检测管内。
8.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于所述的FTA膜片是由英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片裁切成的尺度不小于1平方毫米的纸片。
9.权利要求2所述的试剂盒用于养殖水体或饵料中诺达病毒的检测。
10.权利要求9所述的诺达病毒的检测，其特征在于该方法包括下列步骤(1)取凡纳滨对虾鲜活饵料约0.Ig置于采样管中，快速将样品磨碎至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置1 20min；(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗管3 5min以洗涤FTA膜片；(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于55 65 °C条件下保温40 70min ；(6)将扩增检测管上下反复甩动l-3min；(7)向下甩动扩增检测管，直接观察扩增反应液颜色，如果扩增反应液呈现绿色则表示该样品的凡纳滨对虾诺达病毒检测结果为阳性，如果扩增反应液呈现橙黄色则表示该样品的凡纳滨对虾诺达病毒检测结果为阴性。
全文摘要
本发明涉及一种凡纳滨对虾诺达病毒的快速高灵敏检测试剂盒及检测方法。本发明的检测试剂盒包括采样管、内装蒸馏水的漂洗管、内装TE缓冲液的核酸变性管、内装扩增反应液和染料的扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、FTA膜片及其快速干燥液等。本发明的检测方法具有比RT-PCR检测方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，并且成本低，使用方便，检测更准确、快速、灵敏度极高，且对人和环境都非常安全，可以替代已有的相关检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法不仅可在室内的实验室使用，也可在野外的生产现场使用，对于加强凡纳滨对虾诺达病毒监测、防止其大规模爆发流行意义重大，具有很高的推广应用价值。
文档编号C12N15/11GK102329894SQ201110300050
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者刘莉, 张庆利, 杨冰, 王勤涛, 黄倢 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所