专利名称：一种通过阶梯离心分离脐带血造血干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离脐带血造血干细胞的方法，尤其是一种通过阶梯离心分离脐带血造血干细胞的方法。
背景技术：
脐血分离技术是建立脐血库和进行脐血移植研究的关键环节，它直接关系到脐血样本冻存的终体积、造血干/祖细胞分离率、细胞冻存复苏后的干细胞回收率、细胞的有效活性维持以及下一步研究的成败。脐血分离的目的主要是去除脐血中的红细胞、血小板和部分血浆，收集富含脐血干/祖细胞的有核细胞(NC)，通过分离使脐血浓缩和纯化，提高脐血干/祖细胞的浓度，以满足研究和保存的需要。目前脐血分离技术包括羟乙基淀粉(HEQ沉淀法、Percoll溶液密度梯度离心法、 单克隆抗体加流式细胞仪分析法、免疫磁珠分选法或氯化铵溶解法等。Derming-Kendall 等对淋巴细胞液(Ficoll)分离、密度梯度离心分离、NH4C1溶解法、甲基纤维素法、明胶分离法、羟乙基淀粉(HEQ沉降法等不同脐血分离方法的分离效果进行详细的分析和比较后认为，3%明胶沉降法的分离效果最好，其CD34+细胞的回收率和集落(CFU-C)回收率最高， 分别达到86%和92%。溶解法次之，但其终体积较大因而实际应用价值不大。Ficoll和 Percoll密度梯度离心法，虽然应用较广泛，但其对技术的要求较高而且费用相对较贵。而且Ficoll法单次分离脐血量较小，在分离血量多的样本时，使用的离心管数多，工作量大， 很容易造成污染，因此不适宜大批量脐血的分离。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种一次离心且不需转移的通过阶梯离心分离脐带血造血干细胞的方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种通过阶梯离心分离脐带血造血干细胞的方法，所述离心采用一次离心，分两步进行，第一步离心条件设定为5-15°C、离心力25-80g、离心5-10分钟；第二步离心条件设定为5_15°C，离心力 400-1000g，离心 10-20 分钟。具体地，包括如下步骤(1)将采集袋中的脐带血充分摇勻，消毒，按比例加入羟乙基淀粉(HEQ，将血袋放在微电脑采液控制器上，充分混勻；(2)用气袋填充脐带血袋周围，使脐带血袋处于垂直状态，置于离心杯中配平、进行梯度离心，第一步离心条件设定为5-15°C、25-80g、离心5-10分钟；第二步离心条件设定为 5-15°C，400-1000g，离心 10-20 分钟；(3)离心完毕后，采集袋中的脐带血分为三层，上层为血浆，中层为脐带血造血干细胞，下层为红细胞，分别将上层的血浆和下层的红细胞放出，采集袋中即为富集的脐带血造血干细胞。
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优选，第一步离心条件设定为10°C、50g、离心7分钟；第二步离心条件设定为 747g，10°C，离心 15 分钟。本发明的有益效果是采用梯度离心法分离脐带血造血干细胞，降低了干细胞在二次离心时需转移到转移袋中带来的污染危险。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细说明本发明通过阶梯离心分离脐带血造血干细胞的方法，所述离心采用一次离心，分两步进行，第一步离心条件设定为5-15°C、离心力25-80g、离心5-10分钟；第二步离心条件设定为5-15°C，离心力400-1000g，离心10-20分钟。具体地，包括如下步骤(1)将采集袋中的脐带血充分摇勻，消毒，按比例加入羟乙基淀粉(HEQ，将血袋放在微电脑采液控制器上，充分混勻；(2)用气袋填充脐带血袋周围，使脐带血袋处于垂直状态，置于离心杯中配平、进行梯度离心，第一步离心条件设定为5-15°C、25-80g、离心5-10分钟；第二步离心条件设定为 5-15°C，400-1000g，离心 10-20 分钟；(3)离心完毕后，采集袋中的脐带血分为三层，上层为血浆，中层为脐带血造血干细胞，下层为红细胞，分别将上层的血浆和下层的红细胞放出，采集袋中即为富集的脐带血造血干细胞。优选，第一步离心条件设定为10°C、50g、离心7分钟；第二步离心条件设定为 747g，10°C，离心 15 分钟。下面对本发明进行详细说明1.将采集袋中的脐带血充分摇勻。用碘酒消毒采集袋取样部位1次，75%酒精消毒2次。用无菌剪刀剪开消毒部位，抽取血样本进行细胞计数和有核细胞活率检测。2.按比例加入HES (羟乙基淀粉)。公式为HES体积/脐带血重量(含抗凝剂) =1/5，即加入HES的数量=脐带血重量(含抗凝剂)X 0.2 (ml)。3.将血袋放在微电脑采液控制器上，充分混勻10分钟。4使用梯度离心法制备有核细胞4. 1用气袋填充脐带血袋周围，使脐带血袋处于垂直状态，置于离心杯中。4. 2配平、进行梯度离心。第一步离心条件设定为10°C、50g(g为离心力单位)、离心7分钟；第二步离心条件设定为747g，10°C，离心15分钟。5.离心完毕后，小心地将离心后的脐带血袋垂直放在血浆分浆夹上，将血袋下端的管道穿过血液分浆夹底部的开口。6.用止血钳夹住采集袋下端管道。用碘酒消毒采集袋取样部位一次，75%酒精消毒两次。用无菌剪刀剪开消毒部位，连接转移袋，松开止血钳放出红细胞。待红细胞界面据采集袋底部Icm时，夹住止血钳。记录放出红细胞的重量。热合管道。7.用止血钳夹住采集袋顶端管道，用碘酒消毒采集袋取样部位一次，75 %酒精消毒两次。用无菌剪刀剪开消毒部位，连接转移袋，松开止血钳放出血浆，当采集袋中剩余血体积到33ml时，夹住止血钳。
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8.松开血浆夹，取下采集袋，使管道内的血浆回流。采集袋中即为富集的脐带血造血干细胞。9.充分混勻采集袋中的脐带血，抽取样品分做有核细胞计数、苔盼蓝拒染、⑶34+ 细胞检测、干祖细胞培养等检测。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种通过阶梯离心分离脐带血造血干细胞的方法，其特征在于，所述离心采用一次离心，分两步进行，第一步离心条件设定为5-15°C、离心力25-80g、离心5-10分钟；第二步离心条件设定为5-15°C，离心力400-1000g，离心10-20分钟。
2.根据权利要求1所述的通过阶梯离心分离脐带血造血干细胞的方法，其特征在于， 包括如下步骤(1)将采集袋中的脐带血充分摇勻，消毒，按比例加入羟乙基淀粉，将血袋放在微电脑采液控制器上，充分混勻；(2)用气袋填充脐带血袋周围，使脐带血袋处于垂直状态，置于离心杯中配平、进行梯度离心，第一步离心条件设定为5-15°C、25-80g、离心5-10分钟；第二步离心条件设定为 5-15°C，400-1000g，离心 10-20 分钟；(3)离心完毕后，采集袋中的脐带血分为三层，上层为血浆，中层为脐带血造血干细胞， 下层为红细胞，分别将上层的血浆和下层的红细胞放出，采集袋中即为富集的脐带血造血干细胞。
3.根据权利要求2所述的通过阶梯离心分离脐带血造血干细胞的方法，其特征在于， 第一步离心条件设定为10°C、50g、离心7分钟；第二步离心条件设定为747g，10°C，离心15 分钟。
全文摘要
本发明公开了一种通过阶梯离心分离脐带血造血干细胞的方法，所述离心采用一次离心，分两步进行，第一步离心条件设定为5-15℃、离心力25-80g、离心5-10分钟；第二步离心条件设定为5-15℃，离心力400-1000g，离心10-20分钟。本发明采用梯度离心法分离脐带血造血干细胞，降低了干细胞在二次离心时需转移到转移袋中带来的污染危险。
文档编号C12N5/0789GK102321583SQ20111030017
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者张昊, 曹禹, 杨俊晔, 林莹, 武文杰, 王福喜, 贺雪萍, 韩俊领, 鲁瑞周 申请人:协和干细胞基因工程有限公司