一种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方法，包括：该方法主要根据核酸反应热力学最近邻模型，计算DNA以及RNA反应的热力学参数，从理论上阐明探针特异性的理论极限，同时计算出不同单碱基突变的特异性差异与热力学性质，并在计算机上模拟预测出不同的核酸反应结果；设计出具有理论优化过的具有高特异性的核酸探针。本发明基于热力学计算设计出的探针特异性达到了理论上最优结果；稳定性好，保存时间长；检测过程及其简单；且检测时间短；检测过程不受环境温度影响，同时不受溶液中盐离子浓度影响；该方法能够满足临床需求，在医学方面具有很好的应用前景。
【专利说明】-种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸杂交领域，特别设及一种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方 法。
【背景技术】
[0002] 核酸是一切生物细胞的基本成分，在生物体内编码和调节遗传信息的表达。对生 物体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等重大生命现象起着重要作用。核酸的生物重要性促 使核酸探针W及引物在生物技术如：聚合酶链反应（PCR),生物巧片（microarray)及巧光 原位杂交等方面的具有广泛的应用。
[0003] 核酸能够用于生物学，生物技术W及纳米生物技术方面的关键属性就是其具有可 预测性W及特异的Watson -化ick杂交互补特性。然而除非在烙解温度附近，许多正确碱 基配对的热力学增加会覆盖一些错配的热力学误差，而且较长核酸链之间的杂交也会产生 非特异。
[0004] 高温或化学变性通常被用于提高杂交的特异性。在高温或化学变性条件下，标准 的杂交自由能较弱，基于互补序列之间的结合力，略微不同的序列就可W被辨别。然而，在 多祀标杂交系统中许多不同的杂交反应必须同时进行，该个时候利用某一烙解温度附近的 杂交来提高特异性显然是不可行的。此外，烙解温度取决于杂交溶液中盐的浓度、核酸浓 度等一些因素，很难W此预测杂交的精确性。同样，化学变性也削弱了沃森-克里克碱基配 对原则，一样具有潜在的局限性。
[0005] 一般来说一个理想的核酸探针应该满足=个条件：高亲和力（能够牢固地和互补 祀标结合）、高选择性（与错配序列不结合）W及高稳定性（环境因素不容易影响，不同实 验室检测结果具有一致性），而该在实际的实践中很难全面满足。
[0006] 根据核酸特异性杂交在生物技术等方面的重要作用W及目前高特异性杂交的方 法仍存在一些缺陷。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方 法，该方法针对传统高特异性杂交检测中存在的问题和不足，采用热力学理论及链置换探 针高特异核酸杂交条件的优化，提出一种衡量高特异性杂交受温度影响程度的参数与计算 方法，为核酸的高特异性杂交W及单碱基突变特异性的检测提供有效的方法学依据。
[000引本发明的一种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方法，包括：
[0009] (1)针对预检测的目的祀标X，设计多个结构具有差别并与目的祀标相匹配的链 置换探针PC，与目的祀标序列的反应作为反应1，反应产物为P和XC，与具有单碱基突变的 祀标S的反应作为反应2,反应产物为P和SC ;分别计算反应1和反应2中每一种核酸分子 的标准吉布斯自由能A护、标准滴A 5°^及标准洽A ，并根据此计算出反应1和反应2的 标准吉布斯自由能变化量A t护，标准滴变化量A ,5°^及标准洽变化量A 结合各反应 物的初始浓度，最终分别计算出反应1与反应2的杂交产物产量；
[0010] (2)根据步骤（1)的杂交产物产量，选出倾向于反应1的探针；最后合成选出的探 针，实现目的祀标高特异性检测。
[0011] 本发明的技术方案是：
[0012] (1)对核酸序列的高特异性检测：首先依据核酸链置换探针的反应方程式，针对 该核酸序列计算出几种比较合理的探针设计方式。然后根据设计好的探针与祀标的实际反 应结果选出特异性最优的探针设计。从而达到对核酸序列的高特异性检测的目的。
[0013] (2)对单碱基突变的高特异性检测；首先依据核酸链置换探针的反应方程式，针 对该单碱基突变计算出几种比较合理的探针设计方式。然后根据单碱基突变本身的热力学 参数计算出该突变的温度特性，选择出检测的最适合的温度范围。最后根据实际的探针与 祀标反应结果，选择出最优化的探针设计和反应温度。从而达到高特异性检测单碱基突变 的目的。
[0014] 技术方案具体为；
[0015] (1)对核酸序列的高特异性检测：
[0016] 核酸链置换反应方程式为：
[0017] X+PC 一 P巧C 1
[0018] S+PC 一 P+SC 2
[0019] 其中X代表目的祀标，PC代表链置换探针，P和C分别代表链置换探针的两条核酸 链。X与PC经过反应，X置换出探针PC中的P链，从而形成反应产物XC与被释放的P链， 经过一定时间后，反应达到平衡，称该反应为反应1。W S代表具有单碱基突变的祀标，贝U S+PC - SC+P代表突变的祀标与探针PC的反应方程式，称该反应为反应2,反应过程与前述 相仿。
[0020] 第一步：根据预检测的核酸序列，设计出与之相匹配的链置换探针。
[0021] 计算出参与"反应1"和"反应2"中每一种核酸分子的标准吉布斯自由能A护，标 准滴AS"化及标准洽AH°。并根据此计算出，该反应1和反应2的标准吉布斯自由能变化 量Af护，标准滴变化量AtS°W及标准洽变化量A ftf，对已反应1，其计算公式如下：
[0022] ArG°(l) = AG°aC) + AG°(W-AG°a)-AG°(PC)
[0023] Aftfa) = AH° 狂C) + AH° (巧-AH°〇〇-AH°(PC)
[0024] ArS°(l) = AS° 狂C) + AS° (巧-AS°〇〇-AS°(PC)
[002引其中A货(1)代表"反应1"的标准自由吉布斯能变化量，Aftfa)为"反应1"的 标准洽变化量，AtS°(l)为"反应1"的标准滴变化量。A护狂C)、Atf狂C)和AS°aC)分 别为分子XC的标准吉布斯自由能、标准洽和标准滴。其他的参与反应分子的标准吉布斯自 由能，标准洽，标准滴表示方法类似。
[0026] 对于"反应2"，其标准吉布斯自由能变化量A t护(2)、标准洽变化量A (2)和标 准滴变化量A (2)的计算方法与"反应1"的计算方法相同。
[0027] 在得到各个反应方程式的标准吉布斯自由能变化量Af护、标准洽变化量和 标准滴变化量之后。可W进一步计算出"反应1"和"反应2"的杂交产量：
[002引
【权利要求】
1. 一种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方法，包括： (1) 针对预检测的目的靶标X，设计多个结构具有差别并与目的靶标相匹配的链置换 探针PC，与目的靶标序列的反应作为反应1，反应产物为P和XC，与具有单碱基突变的靶标 S的反应作为反应2,反应产物为P和SC ;分别计算反应1和反应2中每一种核酸分子的标 准吉布斯自由能AG°、标准熵AS°以及标准焓ΛΗ°，并根据此计算出反应1和反应2的标 准吉布斯自由能变化量AA ci,标准熵变化量Ajtl以及标准焓变化量△ 结合各反应物 的初始浓度，最终分别计算出反应1与反应2的杂交产物产量； (2) 根据步骤（1)的杂交产物产量，选出倾向于反应1的探针；最后合成选出的探针， 实现目的靶标高特异性检测。
2. 根据权利要求1所述的一种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方法，其特征在 于：所述步骤⑴中的反应1的标准吉布斯自由能AG°、标准熵AS°以及标准焓ΛΗ°的计 算公式为： ArG0(I) = Δ G0 (XC) + Δ G0 (P) - Δ G0 (X) - Δ G0 (PC)； ArH0(I) = Δ H0 (XC) + Δ H0 (P) - Δ H0 (X) - Δ H0 (PC)； ArS0(I) = Δ Sci(XC)+ Δ Sci(P)-A Sci(X)-A Sci(PC)。
3. 根据权利要求1所述的一种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方法，其特征在 于：所述步骤（1)中的杂交产物产量的计算公式为：
其中R为理想气体常数，T为反应温度。
4. 根据权利要求1所述的一种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方法，其特征在 于：所述步骤（1)中的目的靶标为已知单碱基突变，通过公式计算出单碱基突变的温度特 性，确定检测特异性最优的温度范围；通过溶液中盐离子浓度变化影响公式，选出受盐离子 浓度变化影响最小的链置换探针。
5. 根据权利要求4所述的一种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方法，其特征在 于：所述温度特性计算公式为：Δ ΛΗ = ArHtl⑵_ArH°(l) ; Λ AS = ArStl⑵-ArStl⑴；
6. 根据权利要求4所述的一种基于热力学优化的高特异性核酸杂交方法，其特征在 于：所述盐离子浓度变化计算公式为：AS°= AS°[lMNaCl]+0. 368XN/2Xln[Na+]。
【文档编号】C12Q1/68GK104513855SQ201410707763
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】毛红菊, 武振华, 白亚楠, 金庆辉, 赵建龙 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所