用于检测dna杂交的可重复使用的长周期微光纤光栅的制作方法
【专利说明】用于检测DNA杂交的可重复使用的长周期微光纤光栅
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求美国临时专利申请序列号61/997，620的优先权，该美国临时专利申请在2014年6月6日提交并且它的公开内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
[0003]本发明涉及一种对用于检测脱氧核糖核酸杂交、具有提高的灵敏度的无标记、可重复使用的长周期微光纤光栅生物传感装置、其制造方法以及其用途。
【背景技术】
[0004]生物传感器具有广泛的应用，包括用于医疗诊断的生物标志物检测、以及食品和水中的病原体和毒素检测。一般生物传感器使用荧光免疫测定来检测分析物，然而，这种方法的缺点在于需要对抗原或靶DNA进行荧光标记。这需要额外的试剂并且可能干扰正常的生物过程。此外，这种方法成本高、复杂、并且不可能实时检测。
[0005]为了克服这些缺点，已经应用了许多方法来研发无标记的检测生物传感器。具体来说，得到很多关注的是光纤生物传感器，其中源于光纤的装置使用光场来测量生物物质，如细胞、蛋白质以及DNA。不同于它们对应的一般生物传感器，光纤生物传感器利用无标记的检测。由于它们的效率、电势灵敏度、检测速度以及小体积、对分析物的可变的和多重的检测，光纤生物传感器正越来越多地被应用于工业过程和环境监测、食品加工以及临床应用中。
[0006]许多光纤生物传感器是基于表面等离子体共振(SPR)现象。然而，在SPR生物传感器的情况下，生物传感器的SPR特性取决于金属、它的厚度以及生物分子。因此，需要仔细地设计并且制造SPR生物传感器，这会造成成本升高。为了克服这些缺点，已经设计出基于光纤光栅的生物传感器。特别地，设计出具有在共振波长下协助模式耦合的长周期光栅(LPG)的折射率的生物传感器，所述折射率对光纤外部介质的变化敏感。用于生物传感的LPG传感器的优势包括制造简单以及容易通过简单地调节光栅周期将共振波长很好地调节到光源的光谱内。其以实现检测生物分子(如DNA)的高灵敏度的可调谐性也使得LPG传感器成为灵敏的DNA生物传感器的理想候选者。
【发明内容】
[0007]在本发明中，提供了一种基于长周期微光纤光栅(LPMFG)的灵敏的DNA生物传感器，所述长周期微光纤光栅被写到包层蚀刻的或锥形的光纤上。LPMFG的包层被显著减少以增强纤芯基模与外部介质之间的相互作用以实现更高的灵敏度。本发明的生物传感器使用了 LPMFG的耦合模式特性的构思来确定病毒DNA是否附着到生物传感器的表面。LPMFG从纤芯模到包层模来耦合光的能力允许在光栅表面光学检测折射率的变化，从而提供监测生物分子相互作用的光学检测方法。LPMFG病毒传感器通过靶病毒ssDNA与固定探针ssDNA之间的杂交的生物分子相互作用来导致光栅表面上折射率的变化而起作用。
[0008]根据上述背景，本发明的目的在于提供一种微光纤中的无标记、可重复使用的长周期光栅装置及其制造方法，所述长周期光栅装置具有提高的灵敏度，用于检测和感测脱氧核糖核酸杂交。该制造微光纤中的无标记、可重复使用的长周期光栅装置的方法包括使用耦合器制造台(可商购获得的或任何常规的制造台)使单模光纤成为锥形，用氢焰软化并且使平移台对称地移动分开;使所述微光纤的两个单模光纤尾纤与发光二极管(LED)和光谱分析仪连接;使用聚焦脉冲式C02激光，以小的纵向拉伸应变在微光纤上进行扫描来沿着缩径的光纤(RDF)周期性地产生微锥形；以及重复扫描程序N次以制造具有N-1个周期的长周期光栅。
[0009]在一个实施方案中，由所述方法制造的长周期光纤光栅具有约45μπι的直径、约385μπι的栅距、约20个周期以及当被浸泡在具有约1.33的折射率的液体中时约1544.5nm的陷波。
[0010]在另一个实施方案中，用于检测脱氧核糖核酸杂交的提高的灵敏度是约0.055(每单位摩尔浓度的波长偏移)。
[0011]在又另一个实施方案中，所述脱氧核糖核酸是病毒脱氧核糖核酸。
[0012]在又另一个实施方案中，微光纤具有数百纳米至数微米的直径以及长于30mm的有效束腰长度。
[0013]在又另一个实施方案中，所述聚焦⑶2激光包含以下参数:脉冲宽度:2.0ys，重复率:10kHz，以及平均功率:约0.02W。
[0014]在另一个实施方案中，将扫描程序重复5至26次;所述扫描程序在以下参数下进行:扫描长度:5至10mm;扫描速度:3mm/s;和/或拉速:0.17mm/s。
[0015]在其它实施方案中，所述长周期光纤光栅具有5至24个周期。
[0016]在本发明的另一个方面，提供了一种使用本发明的可重复使用的长周期微光纤光栅装置对脱氧核糖核酸杂交进行无标记检测以及使所述装置再生的方法。所述方法包括提供对于与一种或多种靶DNA杂交具有特异性的脱氧核糖核酸探针;将所述脱氧核糖核酸探针固定在所述装置的光栅表面上以形成活性光栅表面;将所述靶DNA的脱氧核糖核酸样品递送到所述装置的所述活性光栅表面；以超高的灵敏度检测所述光栅表面处的折射率的变化;以及使所述装置的所述活性光栅表面再生。
[0017]在一个实施方案中，所述脱氧核糖核酸包含病毒脱氧核糖核酸。
[0018]在另一个实施方案中，重复使用所述可重复使用的长周期微光纤光栅，包括在杂交之后使用分别包含0.5%SDS溶液(pH 1.9)、10mM NaOH溶液、以及10mM HC1溶液的混合物使与探针DNA杂交的靶DNA的DNA双链体断裂，以再生所述活性光栅表面。
[0019]在又另一个实施方案中，所述活性传感器表面在重复所述再生之后保持10次连续测定而没有任何显著的性能损失。
[0020]在又另一个实施方案中，所述显著的性能损失低于10%的降低。
[0021]在又另一个实施方案中，将特异性脱氧核糖核酸探针固定在所述光栅表面上进一步包括将传感器表面用3-氨基丙基-三乙氧基甲硅烷(APTS)硅烷化，将所述装置浸入到辛二亚氨酸二甲酯(DMS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中以形成交联剂，以通过使所述活性光栅表面与含有所述特异性DNA探针的ssDNA的PBS—起孵育来固定所述探针的ssDNA。
【附图说明】
[0022]图1显示可商购的耦合器制造台。
[0023]图2显示用于制造微光纤中的LPG的C02激光系统的示意图。
[0024]图3显示在微光纤中制造以形成本发明的LPMFG的LPG:(a)显示沿着光纤的周期性的微锥形的显微镜图像；(b)显示具有在6.3μπι直径的微光纤上制成的两个微锥形的细节的显微镜图像；以及(c)显示具有在6.3μπι直径的微光纤上制成的两个微锥形的细节的SEM图像。
[0025]图4显示具有45μπι直径的锥形光纤。
[0026]图5显示直径为45μπι的长周期光栅的光谱。发现折射率灵敏度为922nm/RIU。
[0027]图6A显示LPG DNA传感器在H5禽流感DNA探针与ΙμΜ Η5禽流感DNA靶标杂交的情况下的波长偏移。灵敏度:3.60 X 10~-3(nm/M)。
[0028]图6B显示LPG DNA传感器在H5禽流感DNA探针与0.5nM H5禽流感DNA靶标杂交的情况下的波长偏移。灵敏度:4.00(nm/M)。
[0029]图7A显示LPG DNA传感器在H7禽流感DNA探针与ΙμΜ Η7禽流感DNA靶标杂交的情况下的波长偏移。灵敏度:3.70 X 10~-3(nm/M)。
[0030]图7B显示LPG DNA传感器在H7禽流感DNA探针与0.5nM H7禽流感DNA靶标杂交的情况下的波长偏移。灵敏度:4.40(nm/M)。
[0031]图8显示两条完全互补的ssDNA(探针ssDNA和靶病毒ssDNA)的DNA杂交的示意图。
[0032]图9显示基于DNA杂交的LPMFG病毒传感器的原理。
[0033]图10A显示LPG DNA传感器在H5禽流感DNA探针与0.5nM H5禽流