通过基于结构的探针切割的核酸靶鉴定的制作方法
【专利说明】通过基于结构的探针切割的核酸靶鉴定发明领域
[0001]本发明涉及核酸检测领域。特别地，本发明提供了执行靶核酸的高流通量多路检测的方法。
[0002]发明背景
用于检测靶核酸的许多方法是已知的。目前可获得的用于核酸检测的同质测定包括TaqMan?、Ampliflour?、染料结合、等位基因选择动态PCR和Scorp1n?引物测定。由于需要不同染料用于待检测的每种靶核酸，这些测定操作不容易多路化，并且因此在其改善潜力方面有限。为了克服此类局限性，几项近期研究已公开了含有可切割“标签”部分的寡核苷酸探针的使用，所述可切割“标签”部分可以容易分离且检测(例如参见Chenna等人，美国专利申请公开号2005/0053939 ；Van Den Boom，美国专利号8，133，701)。然而，来自这些研究的结果显示存在能够准确地使检测标签与靶核酸关联的问题，并且仍存在执行靶核酸的高流通量多路检测的准确方法的需要。
[0003]发明概述
本发明提供了用于核酸序列检测的新方法。在该方法中，在PCR期间通过DNA聚合酶的5’核酸酶活性产生与扩增区内的靶核酸结合的，来自寡核苷酸探针的独特的鉴定性可切割片段。这通过具有附着至探针5’末端的非互补“翼(flap)”区来实现。靶核酸的身份可以通过鉴定独特的可切割片段进行确定。例如，这可以容易地通过质谱法来完成。由于具有独特和可容易分辨质量的可能可切割片段的极大数目，核酸靶的快速高流通量多路检测因此成为可能。
[0004]因此，在一个方面，本发明提供了检测样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方法，其包括下述步骤:
(a)通过使包含靶核酸的样品与下述接触制备反应混合物:(i)一对寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物包含与靶核酸序列的一条链中的区域互补的序列，且引发第一延伸产物的合成，并且其中第二寡核苷酸引物包含与所述第一延伸产物中的区域互补的序列，且引发与所述第一延伸产物互补的核酸链的合成，和(ii)包含至少两个不同部分的寡核苷酸探针，第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，其中所述第一部分在由所述寡核苷酸引物对结合的靶核酸序列内退火，并且其中所述第一部分在3’末端处封闭，以阻止通过核酸聚合酶的延伸，并且阻止通过3’至5’核酸外切酶的切割；并且附着至第一部分的5’末端的包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者的第二部分，包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含核酸外切酶抗性修饰；
(b)在允许所述寡核苷酸引物对和所述寡核苷酸探针对靶核酸序列退火，并且由所述寡核苷酸引物对合成引物延伸产物，同时核酸聚合酶的5’至3’核酸酶活性能够切割退火的寡核苷酸探针，且从其中释放含有寡核苷酸探针的第二部分，连同或不连同来自寡核苷酸探针的第一部分的另外核苷酸的片段的条件下，用具有5’至3’核酸酶活性的核酸聚合酶扩增所述靶核酸序列； (C)用3’至5’核酸外切酶处理含有寡核苷酸探针的第二部分的所述片段，所述3’至5’核酸外切酶切割所述片段直至核酸外切酶抗性修饰，从而产生具有独特的质量可区别大小的单一片段；和
(d)通过质谱法检测单一片段的存在或不存在，从而检测样品中靶核酸序列的存在或不存在。在一些实施方案中，步骤(d)之前为纯化所述反应混合物用于去除质谱法的污染物的步骤。
[0005]在该方法的一些实施方案中，在单一多路化反应中检测到两种或更多种靶核酸。在一些实施方案中，两种或更多种寡核苷酸探针用于检测单一多路化反应中的两种或更多种靶核酸。在一些实施方案中，核酸外切酶抗性修饰选自硫代磷酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物和倒转核苷酸。在一些实施方案中，检测步骤(d)之前为纯化所述反应混合物用于去除质谱法的污染物的步骤。在一些实施方案中，检测步骤(d)通过选自下述的质谱仪完成:基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALD1-TOF) MS、串联MS、电喷射电离飞行时间(ES1-TOF)、ES1-离子肼、液相层析(LC) -MS)、气相层析(GC) -MS)和离子迀移率(HO -MS0在一些实施方案中，核酸聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。
[0006]在另一个方面，本发明提供了检测样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方法，其包括下述步骤:
(a)通过使包含靶核酸的样品与下述接触制备反应混合物:(i)一对寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物包含与靶核酸序列的一条链中的区域互补的序列，且引发第一延伸产物的合成，并且其中第二寡核苷酸引物包含与所述第一延伸产物中的区域互补的序列，且引发与所述第一延伸产物互补的核酸链的合成，和(ii)包含至少两个不同部分的寡核苷酸探针，第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，其中所述第一部分在由所述寡核苷酸引物对结合的靶核酸序列内退火，其中第一部分还包含在5’末端处的修饰，这使得其对于通过单链特异性5’ -3’核酸外切酶的切割抗性，并且附着至第一部分的3’末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，且包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含使得其对于通过单链特异性5’ -3’核酸外切酶的切割抗性的修饰；
(b)在允许所述寡核苷酸引物对和所述寡核苷酸探针对靶核酸序列退火，并且由所述寡核苷酸引物对合成引物延伸产物，同时核酸聚合酶的5’至3’核酸酶活性能够切割退火的寡核苷酸探针，且从其中释放含有寡核苷酸探针的第二部分，连同或不连同来自寡核苷酸探针的第一部分的另外核苷酸的片段的条件下，用具有5’至3’核酸酶活性的核酸聚合酶扩增所述靶核酸序列；
(c)用单链特异性5’-3’核酸外切酶处理含有寡核苷酸探针的第二部分的所述片段，所述单链特异性5’ -3’核酸外切酶切割所述片段直至核酸外切酶抗性修饰，从而产生具有独特的质量可区别大小的单一片段；和
(d)通过质谱法检测单一片段的存在或不存在，从而检测样品中靶核酸序列的存在或不存在。在一些实施方案中，步骤(d)之前为纯化所述反应混合物用于去除质谱法的污染物的步骤。
[0007]在该方法的一些实施方案中，在单一多路化反应中检测到两种或更多种靶核酸。在一些实施方案中，两种或更多种寡核苷酸探针用于检测单一多路化反应中的两种或更多种靶核酸。在一些实施方案中，核酸外切酶抗性修饰选自硫代磷酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物和倒转核苷酸。在一些实施方案中，检测步骤(d)之前为纯化所述反应混合物用于去除质谱法的污染物的步骤。在一些实施方案中，检测步骤(d)通过选自下述的质谱仪完成:基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALD1-TOF) MS、串联MS、电喷射电离飞行时间(ES1-TOF)、ES1-离子肼、液相层析(LC) -MS)、气相层析(GC) -MS)和离子迀移率(HO -MS0在一些实施方案中，核酸聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。
[0008]在另一个方面，本发明提供了包含寡核苷酸探针的组合物，其中所述寡核苷酸探针包含至少两个不同部分，其中第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，使得所述第一部分能够与靶核酸序列的所述区域结合，并且其中所述第一部分在3’末端处封闭，以阻止所述寡核苷酸探针通过DNA聚合酶的延伸，并且阻止通过3’至5’核酸外切酶的切割；并且附着至第一部分的5’末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，并且包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含核酸外切酶抗性修饰。
[0009]在一些实施方案中，寡核苷酸探针的第二部分中的核酸外切酶抗性修饰包含不可切割的核苷酸类似物，其选自硫代磷酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物、倒转核苷酸或任何其他修饰，所述修饰致使寡核苷酸片段在修饰附着点外对于核酸外切切割抗性。在其他实施方案中，寡核苷酸探针的第二部分包含非核苷酸，其可以是任何有机部分或重复单元(例如(CH2-CH2-0) η等)。
[0010]在另一个方面，本发明提供了包含寡核苷酸探针的组合物，其中所述寡核苷酸探针包含至少两个不同部分，第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，其中所述第一部分在由所述寡核苷酸引物对结合的靶核酸序列内退火，其中第一部分还包含在5’末端处的修饰，这使得其对于通过单链特异性5’_3’核酸外切酶的切割抗性，并且附着至第一部分的3’末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，并且包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含使得其对于通过单链特异性5’ -3’核酸外切酶的切割抗性的修饰。
[0011]在一些实施方案中，寡核苷酸探针的第二部分中的核酸外切酶抗性修饰包含不可切割的核苷酸类似物，其选自硫代磷酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物、倒转核苷酸或任何其他修饰，所述修饰致使寡核苷酸片段在修饰附着点外对于核酸外切切割抗性。在其他实施方案中，寡核苷酸探针的第二部分包含非核苷酸，其可以是任何有机部分或重复单元(例如(CH2-CH2-0) η等)。
[0012]附图简述
图1代表本发明的方法的举例说明性描述。
[0013]图2代表质谱图，其显示在寡核苷酸T9JTTTGC的核酸外切酶I消化后的寡核苷酸片段，其中J是2’ -O-甲基-尿苷(A)、HEG间隔物(B)或丙二醇间隔物(C)。
[0014]图3代表在PCR扩增反应中的EGFR Τ790Μ突变体5’ -翼探针片段的LC-MS，以及在不具有(A)或具有(B)通过核酸外切酶I的后续消化后的提取离子层析图(EIC)。
[0015]发明详述定义
如本文使用的，术语“样品”包括包含核酸的样本或培养物(例如微生物培养物)。术语“样品”还意欲包括生物和环境样品。样品可以包括合成起源的样本。生物样品包括全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊髓液、脊髓液、灌洗液(例如支气管、胃、腹膜、导管、耳、关节镜)、活组织检查样品、尿、粪便、痰、唾液、鼻粘膜、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、乳汁、乳房流体、胚胎细胞和胎儿细胞。在一个优选实施方案中，生物样品是血液，并