在人pi3kca (pik3ca)基因中检测突变的方法和组合物的制作方法
【专利说明】在人PI3KCA(PIK3CA)基因中检测突变的方法和组合物 发明领域
[0001] 本发明设及癌症诊断学和用于癌症治疗的伴随诊断学。特别地，本发明设及用于 突变检测的方法和组合物，其可用于诊断和预后，W及预期癌症治疗的效力。 阳00引发明背景 憐脂酷肌醇3-激酶（PI3K)是胞内脂质激酶，其调节控制细胞增殖和生存、黏着和运 动性的信号传递通路（Vivanco和Sawyers, (2002)巧6如〇邱山。砂ZinosifoiJ-jfi打ase 如曲3"cancer,Pfe1:ureRev.Cancer2:489)。PI3KCA(PIK3CA)是 PI3K基因家族的成员，其编码激酶PllOa的催化亚基。该基因对瘤形成具有独特的相 关性：在全部测试的PI3K基因中，只有PI3KCA被发现在多种癌症中突变。在一个研究 中，在32%的结肠癌、27%的成胶质细胞瘤、25%的胃癌、8%的乳腺癌和4%的肺癌中发现了 PI3KCA基因中的体细胞突变（Samuels等人（2004)化細/rew/e打〇/邸/紅。口打Si打 (Ae尸/施尚洗/76inA歴ancancers,Science304:554)。随后的研究报告突变还在子宫 癌（24%)、卵巢癌（10%)和宫颈癌（10%)中（Brana和Sui, (2012)Ciinicai沁化>知/?胎打f ofphosphatidylinositol3~kinaseinhibitorsforcancertreatment,BMCMedicine 2012， 10:161)。
[0003] PI3K通过特异激活Akt蛋白质将胞内Akt/mTOR通路激活。遗传方法显示通 过突变体PI3KCA的该通路的组成性激活（constitutiveactivation)促成了对EGFR革己向治疗的抗性（Berns等人（2007) ^ 打ai洗打eficSjOjOroacAiofe打化打es thePI3KpathwayasamajordeterminantoftrastuzumabresistanceinbreastCa打cer,CancerCell12:395)。同时，证明完整的（非突变的）PI3KCA活性可W通过特 异的抑制剂进行抑制，从而克服了通路中去调节的（disregulated)上游元件的效果(例 如EGFR)，并且最化已经开发了祀向PI3KCA(PllOa)自身的治疗剂庙Weic化ar化等 人（2010)StrategiesforOvercomingInherentandAcquiredResistancetoEGFR InhibitorsbyTargetingDownstreamEffectorsintheRAS/PI3KPathway，Current CancerDrugTargets, 10:824;和Br曰n曰和Sui, (2012)Clinicaldevelopmentof phosphatidylinositol3-kinaseinhibitorsforcancertreatment,BMCMedicine 2012，10:161 中综述)。
[0004] 总之，运些研究证明了对于检测PI3KCA基因中体细胞突变W向寻求祀向癌症治 疗的患者进行个人化医疗保健的方法和工具的需求。 阳0化]至今，已鉴定了PI3KCA基因中超过30个体细胞突变(美国专利号8, 026, 053)。大 多数突变聚集在外显子9和20中。然而，许多临床显著的突变已被报告也在外显子1、4和 7中。诊断测定应当祀向尽可能多的运些突变。此外，精确的辨别搞特异性)是需要的，因 为测定的结果将决定患者的癌症治疗过程。
[0006] 发明概述 本发明包括用于检测人PIK3CA基因中每个突变H1047LH1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q54化和Q546K的寡核巧酸，所述寡核 巧酸与W下：SEQIDNO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208和219中的一个 至少90%相同并且具有其3' -端核巧酸。
[0007] 在另一个实施方案中，本发明是测定样品的人PIK3CA基因中一个或多个突变 H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L 和Q546K的存在的方法，其包括将样品与每个突变的一个等位基因特异性核巧酸寡核巧酸 接触，所述寡核巧酸与选自沈QIDNO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208、 219的寡核巧酸具有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核巧酸。在该实施方案的变 化中，寡核巧酸选自沈QIDNO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和 228。
[0008] 在还另一个实施方案中，本发明是用于检测在PIK3CA基因中一个或多个突变 H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L 和Q546K突变的一组寡核巧酸，其包含与沈QIDNO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、 185、197、208和219具有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核巧酸的两个或多个寡 核巧酸的组合。在该实施方案的变化中，寡核巧酸选自SEQIDNO: 8、21、46、78、93、113、 141、166、170、194、199、217和 228。
[0009] 在还另一个实施方案中，本发明是用于检测在PIK3CA基因中一个或多个突变 H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L 和Q546K的反应混合物，其包含对每个突变的一个等位基因特异性寡核巧酸，所述寡核巧 酸与选自SEQIDNO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208、219的寡核巧酸具 有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核巧酸。在该实施方案的变化中，反应混合物 包含W下中的一个或多个：SEQIDNO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、199、217和 228。
[0010] 在还另一个实施方案中，本发明是在患者中评估癌症的方法，其通过使用对每个 突变的一个等位基因特异性寡核巧酸在患者样品中检测PIK3CA基因中的一个或多个突变 H1047L、H1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q546L 和Q546K，所述寡核巧酸与选自沈QIDNO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、 208、219的寡核巧酸具有至少90%同一性并且具有与其相同的3-端核巧酸。在该实施方案 的变化中，一个或多个寡核巧酸选自：SEQIDNO: 8、21、46、78、93、113、141、166、170、194、 199、217 和 228。
[0011] 附图简述 O 阳〇1引发明详述 定义 为促进该公开的理解，提供了在本文中使用的术语的如下定义。
[0013] 术语"X[n]Y"指的是错义突变，其导致在氨基酸序列内的第[n]位上氨基酸X至 氨基酸Y的取代。例如，术语"H1047R"指的是在第1047位的组氨酸被精氨酸取代的突变。
[0014] 术语"等位基因特异性引物"或"AS弓I物"指的是杂交至祀序列的多于一种变体， 但是能够在祀序列的变体之间辨别的引物，因为所述引物只对变体中的一种在合适条件下 通过核酸聚合酶有效地延伸。对祀序列的其它变体，延伸是效率较低的或无效率的。
[0015] 术语"通用引物"指的是包含等位基因特异性引物的引物对的第二引物。通用引 物不是等位基因特异性的，即，其不在等位基因特异性引物辨别的祀序列的变体之间进行 辨别。
[0016] 关于癌症的术语"评估"指的是推断癌症的状态或状况W及确定对诊断程序或治 疗的需要，评价治疗的潜在效力，监控主体的癌症，或设及癌症的治疗或诊断的任何其它步 骤或方法。
[0017] 术语"互补的"或"互补性"是根据有关Watson-化ick碱基配对原则的多核巧酸 的反向平行链使用的。术语"完全互补的"或"100%互补的"指的是在反向平行链之间具有 全部碱基的Watson-化ick配对的互补序列，即，在多核巧酸双链体中的任何两个碱基之间 没有错配。然而，甚至在不存在完全互补性下双链体在反向平行链之间形成。