术语"部分互 补的"或"不完全互补的"指的是反向平行多核巧酸链之间碱基的小于完全100%的任何比 对(例如，在多核巧酸双链体中存在至少一个错配或未匹配碱基)。部分互补链之间的双链 体通常比完全互补链之间的双链体更不稳定。
[0018] 术语"样品"指的是含有或推测含有核酸的任何组合物。运包括从个体分离的组 织或流体的样品，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋己液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官和 肿瘤，并且还指从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林固定石蜡包埋 的组织（FF阳T)和从其分离的核酸。为检测体细胞突变，样品通常包括实体肿瘤(原发性或 转移性）的部分（化agment)或在身体其它部位例如在循环血液中发现的肿瘤来源细胞。
[0019] 术语"多核巧酸"和"寡核巧酸"可交换地使用。"寡核巧酸"是有时用于描述较短 的多核巧酸的术语。寡核巧酸可W包含对应于指定的核巧酸序列的区域的至少6个核巧 酸，例如至少约10-12个核巧酸，或至少约15-30个核巧酸。
[0020] 术语"一级序列（primarysequence)"指的是在多核巧酸或寡核巧酸中的核巧酸 序列。核巧酸修饰诸如含氮碱基修饰、糖修饰或其它主链修饰不是一级序列的部分。标记， 诸如缀合至寡核巧酸的发色团也不是一级序列的部分。因此，两条寡核巧酸可W具有同样 的一级序列但是修饰和标记不同。
[0021] 术语"引物"指的是运样的寡核巧酸，其与祀核酸中的序列杂交，并且能够作为在 适合于运样的合成的条件下的沿着核酸互补链合成的起始点。如在本文中使用的，术语"探 针"指的是与祀核酸中的序列杂交并且通常被可检测地标记的寡核巧酸。探针可W具有修 饰，诸如3' -端修饰(其使得探针通过核酸聚合酶是不可延伸的)，和一个或多个发色团。具 有相同序列的寡核巧酸可W作为在一个测定中的引物和在不同测定中的探针。
[0022] 术语"经修饰的核巧酸"指的是核酸聚合物中的单元，其含有经修饰的碱基、糖或 憐酸基团，或在其结构中渗入非天然部分。非天然核巧酸的实例，包括具有经修饰的含氮碱 基的核巧酸，例如烷基化的或另外具有在设及Watson-化ick配对的常规含氮碱基中不存 在的基团的替代物。通过说明和非限制性的方式，经修饰的核巧酸包括具有被甲基、乙基、 苄基或下基-苄基取代的碱基的核巧酸。
[0023] 如在本文中使用的，术语"祀序列"、"祀核酸"或"祀"指的是被扩增、检测或两者 均进行的核酸序列的部分。
[0024] 术语"杂交的"和"杂交"指的是两条核酸之间的碱基配对相互作用，其导致双链 体的形成。不需要两条核酸在它们的全长上具有100%的互补性W实现杂交。
[00巧]本发明包括用于快速并准确确定患者样品中PI3KCA基因中一个或多个突变的存 在的方法和组合物。本发明能够检测选自H1047LH1047R、H1047Y、N345K、E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q54化和Q546K的突变W及同时询问上文列举的突 变的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 或 13 个。
[00%] 对多重处理（multiplexing)灵敏并且可经受检验的（amen油Ie)-种技术是在例 如美国专利号6, 627, 402中描述的等位基因特异性PCR(AS-PCR)。该技术在序列的野生型 变体的存在下检测核酸序列中的突变或多态性。在成功的等位基因特异性PCR中，扩增祀 核酸期望的变体，而没有扩增其它变体，至少没有达到可检测的水平。
[0027] 等位基因特异性PCR的辨别的一种量度是在设及两个等位基因的扩增反应中Ct 值之间的差异（ACt)。每个扩增反应通过在核酸扩增测定的背景下"生长曲线"或"扩增 曲线"是函数的图表进行表征，其中自变量是扩增循环的数目并且因变量是在扩增的每 个循环测量的扩增依赖性的可测量参数，诸如通过巧光团发出的巧光。通常，扩增依赖性 的可测量参数是杂交后或通过核酸聚合酶的核酸酶活性水解探针后由探针发出的巧光的 量，参见Holland等人，（1991)A'oc.絶(又 88:7276-7280 和美国专利号 5, 210, 015。生长曲线通过"阔值"（或Ct值）进行表征，所述"阔值"（或Ct值）是其中实现 可测量参数的预定量级的循环数。较低的Ct值代表更迅速的扩增，而较高的Ct值代表更慢 的扩增。在等位基因特异性反应的背景下，两个模板的Ct值之间的差异代表了反应中的等 位基因的辨别。
[0028] 在等位基因特异性PCR中，至少一条引物是等位基因特异的，使得引物延伸只有 (或优先）在当序列的特定变体存在时发生，并且在当另一个变体存在时不发生(或W较低 效率发生，即具有实质上的ACt)。成功的等位基因特异性引物设计是不可预测的技术。尽 管设计用于已知序列的引物是常规的，但不存在用于设计可W在非常相似的序列之间进行 辨别的引物的法则。当一个或多个等位基因特异性引物祀向在相同反应混合物中存在的一 个或多个多态性位点时，所述辨别是特别具有挑战的。
[0029] 通常，在引物中辨别的核巧酸，即仅与祀序列的一种变体匹配的核巧酸，是3'-端 核巧酸。然而，引物的3'端只是特异性的多个决定因素中的一个。例如，另外的错配也可 W影响辨别(参见美国专利申请公开号US20100099110)。另一个方法是包含非天然或经修 饰的核巧酸，其改变引物和祀序列之间的碱基配对(美国专利号6, 001，611)。降低的延伸动 力学和因此引物的特异性由多种因素影响，其包括错配的整体序列背景和在反应中存在的 其它核酸。运些外部因素对每个另外错配的影响W及单独的或组合的每个另外的非天然核 巧酸的影响是不可被预测的。本发明申请人测试了引物的多个变体并且发现，令人惊讶地， 某些变体对于它们在紧密相关的祀序列之间辨别的能力有显著差异。
[0030] 为了引物的成功延伸，在引物3'-端的互补性比在引物5'-端的互补性更关键 (Innis等人编辑.化7? (1990)AcademicPress,第 1 章，第9-11 页）。因此 本发明包括在表1-13中公开的引物W及其具有5' -端变化的等同物。
[0031] 在一个实施方案中，本发明包括用于检测选自H1047LH1047R、H1047Y、N345K、 E542K、E545A、E545G、E545K、G1049R、M1043I、Q546E、Q54化和Q546K的PI3KCA突变W及 同时询问上文列举的突变的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个的寡核巧酸。在一个实 施方案中，本发明包括选自沈QIDNO: 2、18、39、61、84、100、127、148、170、185、197、208和 219 (表1-13)的寡核巧酸化及与所述寡核巧酸至少90%相同并且具有其3'-端核巧酸的 变体（variations),其用于特异地检测人PI3KCA基因中的突变。如在表1-13中说明的， 具有与给定的寡核巧酸90%同一性的寡核巧酸包括具有与该寡核巧酸的1个、2个或3个 错配的那些。如在表1-13中进一步说明的，具有与给定的寡核巧酸90%同一性的寡核巧酸 还包括具有一个或多个非天然核巧酸的那些。如在表1-13中进一步说明的，错配和非天 然核巧酸通常在寡核巧酸3'-端部分出现，特别是在倒数第二的5个核巧酸内（within5 penultimatenucleotides)。然而，一些具有与给定的寡核巧酸90%同一'性的寡核巧酸还 包括在寡核巧酸中其它位置(例如在寡核巧酸的5' -部分中）具有1个、2个或3个错配的 那些。如在下文的实施例中证明的，本发明的寡核巧酸通过使用公式ACt=Ct(野生型） -Ct(突变体）确定的基本上正的（substantialpositive)ACt进行表征，表明野生型模 板的扩增比突变体模板的扩增可检测地更慢。 loom 表格说明 下划线的核巧酸与野生型和突变体序列两者均错配。W下缩写用于碱基经修饰的核巧 酸：A*和C*分别为N6-叔下基-苄基-脱氧腺嚷岭和M-叔下基-苄基-脱氧胞喀晚， r是M-乙基-脱氧胞喀晚；和C#是M-甲基-脱氧胞喀晚。 阳03引表1 :用于检测突变化04化的寡核巧酸
[0034] 表2 :用于检测突变化047R的寡核巧酸
阳03引表3 :用于检测突变化047Y的寡核巧酸
[0036]表4 :用于检测突变N345K的寡核巧酸
[0037]表5 :用于检测突变E542K的寡核巧酸
阳03引表6 :用于检测突变E545A的寡核巧酸
kG夹。
[0039]表7 :用于检测突变E545G的寡核巧酸
[0040]表8 :用于检测突变E545K的寡核巧酸
[0041]表9 :用于检测突变Q546K的寡核巧酸
[0042] 表10:用于检测突变Q546E的寡核巧酸
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