进行原位杂交的方法与试剂盒的制作方法
【专利说明】进行原位杂交的方法与试剂盒
[0001] 相夫申请
[0002] 本申请要求2012年10月31日提交的美国临时申请号为61/720, 665的权益。上 述申请的全部教导通过引用并入本文中。
[0003] 通过引用引入ASCII专本专件形式的材料
[0004] 本申请通过引用并入在此共同提交的W下ASCII文本文件中包含的序列表： 阳0化]a)文件名：43731005002沈化1ST. txt ;创建于2013年9月27日，大小为3邸。
[0006] 发巧背景
[0007] 原位杂交方法在医学病症（特别是癌症）患者的筛选和测试中广泛使用。成功的 原位杂交程序部分取决于使用适当的、精确测量的浓度的杂交探针。当使用不适当的高或 低浓度的杂交探针时，经常出现不准确的结果，包括患者误诊。
[0008] 标准原位杂交程序通常包括制备具有期望浓度的探针的杂交溶液。为实现运个目 的，使用微吸管从储备溶液中测量精确量的探针并加入到特定体积的杂交缓冲液中。微量 移液的错误因此可W导致具有次优浓度的探针的杂交溶液，从而当探针浓度过高时导致高 水平的背景信号，或当探针浓度过低时导致不足的可检测信号。
[0009] 因此，需要开发不要求使用微吸管来测量精确量的探针W制备具有特定探针浓度 的杂交溶液的简化和可靠的原位杂交程序。
【发明内容】
[0010] 在一个实施方式中，本发明提供了测定目标核酸是否存在于固体表面上的生物样 品中的方法。在运个实施方式中，所述方法包括W下步骤：a)将固体表面上的所述样品与 干燥纤维基质接触，其中用于检测所述目标核酸的标记的核酸探针嵌入所述基质中或吸附 到其上，和其中所述标记的核酸探针包含与所述目标核酸中的一个或多个不同核巧酸序列 基本上互补的核巧酸序列；b)将所述基质水化W从所述基质释放所述探针；C)将所述样品 与所述探针在足W允许所述探针与所述样品中的所述目标核酸（如果存在）特异性杂交的 严格条件下解育；d)洗涂所述样品W除去未杂交的探针和非特异性杂交的探针；和e)通过 测定所述标记的核酸探针是否与所述样品杂交来确定所述目标核酸是否存在于所述样品 中。
[0011] 在另一个实施方式中，本发明设及一种计数固定在载片上的细胞样品中的染色体 的方法。在运个实施方式中，所述方法包括W下步骤：a)将所述样品覆盖在具有干燥纤维 基质的载片上，所述干燥纤维基质包含玻璃纤维，其中用于检测所述样品中的一个或多个 祀染色体序列的巧光标记的合成DNA寡核巧酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上，和其中 所述探针包含与所述一个或多个祀染色体序列中的核巧酸序列基本上互补的核巧酸序列； b)使用杂交缓冲液将所述基质水化W从所述基质释放所述探针；C)将所述样品与所述探 针在足W允许所述探针与所述样品中的所述祀染色体序列（如果存在）特异性杂交的严格 条件下解育；d)洗涂所述样品W除去未杂交的探针和非特异性杂交的探针；和e)通过检测 与所述样品中的所述祀染色体序列杂交的标记核酸探针来计数所述样品中具有所述祀染 色体序列的染色体。
[0012] 在进一步的实施方式中，本发明设及用于检测样品中的目标核酸的试剂盒，其包 含用于检测所述目标核酸的标记的核酸探针的干燥纤维基质，其中所述标记的核酸探针嵌 入所述基质中或吸附到其上，和其中所述标记的核酸探针包含与所述目标核酸中的一个或 多个核巧酸序列基本上互补的核巧酸序列。在特定实施方式中，所述试剂盒进一步包含用 于从所述基质释放所述探针的水化缓冲液。
[0013] 本发明的原位杂交方法降低了微量吸液错误的可能性并确保使用适当的量和浓 度的探针。
[0014]附图简要说巧
[0015] 图IA和IB为在室溫下与嵌入滤纸圆片中的OligoFI甜探针组杂交的人外周血细 胞的图像，所述探针组用于染色体3 (红色）、6(绿色）、7 (浅绿色）和20 (金色）。
[0016] 图2为示出使用设及升高溫度的杂交步骤和盖玻片下的非嵌入探针的标准原位 杂交程序（蓝色，对照）或者使用设及室溫杂交步骤和嵌入滤纸圆片的探针的原位杂交程 序（绿色，圆片）对于染色体3 (红色）、6(绿色）、7 (浅绿色）和20 (金色）的OligoFISH 探针组获得的信噪比的柱状图。误差棒是平均值的标准误差。
[0017]发巧详沐 引定义
[0019] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通 技术人员通常理解的相同的含义。
[0020] 如本文中所使用，术语"室溫"或"RT"是指约18摄氏度至约25摄氏度范围的溫 度。
[0021] 术语"核巧酸"是指天然存在的核糖核巧酸或脱氧核糖核巧酸单体，W及非天然存 在的其衍生物和类似物。因此，核巧酸可包括，例如，包含天然存在的碱基（例如，A、G、C或 T)的核巧酸和包含修饰的碱基（例如，7-去氮杂鸟巧或肌巧）的核巧酸。
[0022] 关于核酸的术语"序列"是指通过共价键（例如，憐酸二醋键）连接的连续的核巧 酸系列。
[0023] 术语"核酸"是指具有多个核巧酸单体的聚合物。核酸可W是单链或双链的，且 可W是DNA(例如，CDNA或基因组DNA)、RNA或杂化聚合物（例如，DNA/RNA)。核酸可W 是化学地或生物化学地修饰的和/或可含非天然的或衍生的核巧酸碱基。核酸修饰包括， 例如，甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核巧酸、核巧酸间修饰如不带电的连接 (例如，麟酸甲醋、憐酸；醋、氨基憐酸醋（phosphoamidate)、氨基甲酸醋等）、带电的连接 (例如，硫代憐酸醋、二硫代憐酸醋等）、侧悬部分（例如，多肤）、嵌入剂（例如，P丫晚、补骨 脂素等）、馨合剂、烷基化剂和修饰的连接（例如，a异头核酸等）。核酸还包括在通过氨 键键合和其他化学相互作用结合于指定序列的能力上模拟核酸的合成分子。通常，核巧酸 单体通过憐酸二醋键连接，尽管核酸的合成形式可包含其他连接（例如，肤核酸（本文中 也称为"PM")，如Nielsen等，Science254，1497-1500，1991中所描述的）。核酸还可W 包括，例如，构象限制的核酸（例如，"锁核酸"或"LNA"，如Nielsen等，J.Biomol.Struct. Dyn. 17:175-91,1999中所描述的）、吗嘟代寡核巧酸（mo巧holinos)、二醇核酸（GNA)和苏 糖核酸（TM)。"核酸"不是指聚合物的任何特定长度，且因此可W基本上是任何长度，通常 从约6个核巧酸至约IO9个核巧酸或更长。在双链聚合物情况下核酸"可W指任一链或 两条链。
[0024] 术语"寡核巧酸"指通过共价连接如憐连接（例如，憐酸二醋、麟酸烷基和芳基醋、 硫代憐酸醋、憐酸立醋）和/或非憐连接（例如，肤、氨基横酸醋等）连接的长度通常为约 6至约100个核巧酸碱基的短核酸。
[0025] 术语"目标核酸"是指期望检测其在样品中的存在或不存在的核酸。
[00%] 术语"目标序列"是指能够与寡核巧酸探针上的互补序列（例如，基本上互补的序 列）形成氨键键合的双链体的目标核酸中的核巧酸序列。
[0027] 如本文中所使用，"互补的"是指两个不同的核酸链之间或同一核酸链的两个区域 之间的序列互补性。如果当W反向平行方式排列两个区域时，核酸的第一区域中的至少一 个核巧酸残基能够与第二区域中的残基碱基配对（即，氨键键合）而形成氨键键合的双链 体，则核酸的第一区域与相同或不同的核酸的第二区域是互补的。
[0028] 术语"基本上互补的"是指能够在严格杂交条件（包括本文中描述的等溫杂交条 件）下彼此碱基配对W形成稳定的氨键键合双链体的两条核酸链（例如，目标核酸的链和 互补的单链寡核巧酸探针）。一般来说，"基本上互补的"是指具有至少70%，例如，约75%、 80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 或 100% 互补性的两个核酸。
[0029]"重复序列"或"重复的序列"是指人类基因组中非编码的串联重复的核巧 酸序列，其包括，例如，来自a随体、随体1、随体2、随体3、0随体、T随体和端粒的 重复序列。重复序列是本领域中已知的，且例如在Allshire等，NucleicAcidsRes 17(12):4611-27(1989);Cho等，NucleicAcidsRes19 化）：1179-82(1991);Fowler等， NucleicAcidsRes15(9):3929(1987);Haaf等，Cell70(4):681-96(1992);Lee等， C虹omosoma109 巧）：381-9(2000);Maeda和Smithies,AnnuRevGenet20:81-108(1986); Meyne和Goodwin,化romosoma103(2):99-103 (1994) ;Miklos(1985).Localized highlyrepetitiveDNAsequencesinvertebrategenomes.Molecularevolutionary genetics.I.J.R.Macintyre.NY，PlenumPublishingCorp. : 241-321 (1985);Tagarro等， HumGenet93似：125-8(1994);Waye和Willard,PNASUSA86(16):6250-4(1989);和 Willard和Waye，JMolEvol25(3):207-14(1987)中描述。重复序列位于例如染色体 的着丝粒区域、近着丝粒（pericentromeric)区域、异染色质区域和端粒区域。共有重复 序列在例如Willard和Waye,JMolEvol25(3):207-14(1987)Jagarro等，HumGenet 93(2):125-8(1994);Vissel和Choo,NucleicAcidsRes. 15(16):6751 - 6752(1987);Cho 等，NucleicAcidsRes19 巧）：1179-82 (1991)中描述。
[0030] 如本文中所使用，术语"染色体特异性核酸序列"或"染色体特异性核巧酸序列"是 指对细胞基因组内的特定染色体具有特异性的核酸序列。
[0031] 术语"探针"是指包括与目标核酸中的目标序列基本上互补的目标结合区域且因 此能够与目标核酸形成氨键键合的双链体的寡核巧酸。通常，所述探针为单链探针，具有一 个或多个可检测标记W允许在与其互补目标杂交后检测所述探针。
[0032] 如本文中所使用，"目标结合区域"是指能够与互补目标核酸形成氨键键合的双链 体的寡核巧酸探针的一部分。
[0033] 如本文所用的，术语"可检测标记"是指表示其结合的相应分子（例如，探针）的 存在的部分。
[0034]"间接标记"是指使用与所述间接标记特异性结合的标记的第二试剂或配体结合 伴体来检测的部分或配体。
[0035]"直接标记"是指在不存在配体结合伴体相互作用的情况下可检测的部分。
[0036] 术语"生物样品"是指生物来源的材料（例如，细胞、组织、器官、流体）。
[0037] 在两个分子（无论是单体还是聚合分子）的连接的情况中"接头"表示插入在所 连接的两个分子之间且与它们邻接的分子（无论是单体还是聚合分子）。"接头"可用于连 接例如寡核巧酸探针序列与标记（例如，可检测标记）。所述接头可W是核巧酸接头（即在 非邻接序列之间并与它们邻接的核酸序列）或非核巧酸接头。
[003引术语"杂交体"是指通过互补的核巧酸之间的氨键键合形成的双链核酸分子。
[0039] 术语"严格性"是指影响杂合体的稳定性的杂交条件，例如，溫度、盐浓度、pH、甲酯 胺浓度等。运些条件按经验优化W使探针与目标核酸的特异性结合最大化，并使探针与目 标核酸的非特异性结合最小化。
[0040] 术语"巧光团"是指具有巧光性的化学基团。
[0041] 术语"任选"表示可包括或不包括所记载的步骤（例如，在本发明方法的情况下） 或组分（例如，在本发明试剂盒的情况下）。
[0042] 检测目标核酸的方法
[0043] 在一个实施方式中，本发明提供了测定目标核酸是否存在于固体表面上的生物样 品中的方法。在运个实施方式中，所述方法包括W下步骤：a)将固体表面上的所述样品与 干燥纤维基质接触，其中用于检测所述目标核酸的标记的核酸探针