嵌入所述基质中或吸附 到其上，和其中所述标记的核酸探针包含与所述目标核酸中的一个或多个不同核巧酸序列 基本上互补的核巧酸序列；b)将所述基质水化W从所述基质释放所述探针；C)将所述样品 与所述探针在足W允许所述探针与所述样品中的所述目标核酸（如果存在）特异性杂交的 严格条件下解育；d)洗涂所述样品W除去未杂交的探针和非特异性杂交的探针；和e)通过 测定所述标记的核酸探针是否与所述样品杂交来确定所述目标核酸是否存在于所述样品 中。
[0044] 生物样品在固体表面上并可W粘附或连接到所述表面上。适合的固体表面包括， 但不限于，显微镜载片（例如，玻璃载片、塑料载片、石英载片）、盖玻片和多孔（multiwall) (例如，微量滴定）板。优选地，生物样品粘附或连接到玻璃载片上。对于本发明方法适合 的生物样品包括，例如，染色体制剂（P：化paration)、细胞（例如，培养的细胞）、组织、器官、 血液、脊髓液、淋己液、眼泪、唾液、疲、尿液、精液、羊水、毛发、皮肤和肿瘤（例如，活组织检 查）。优选地，所述生物样品包括含有染色体DNA的细胞。优选的细胞包括上皮细胞、精细 胞、卵母细胞、极体、卵裂球和囊胚。在【具体实施方式】中，所述生物样品包括尿路上皮细胞 (例如，人尿路上皮细胞）。优选地，所述生物样品从动物（例如，非人哺乳动物、人）获得。 在特定实施方式中，所述生物样品从人获得。
[0045] 在一个实施方式中，生物样品可包括单一目标核酸，或在替代的实施方式中，包括 多种目标核酸（例如，两种或更多种不同的目标核酸）。目标核酸可W是DNA或RNA，并可 包括基因内的、基因间的和/或转基因的核巧酸序列。因此，目标核酸可W是内源性基因组 核巧酸序列或者人工或外源的（例如，转基因的）核巧酸序列。通常，目标核酸包含染色体 特异性核巧酸序列。示例性的染色体特异性核巧酸序列示于表I中。
[0046] 表1.示例性的染色体特异性核酸序列。
[0048]目标核酸可包括独特的或重复的核巧酸序列。优选地，所述目标核酸包括重复的 基因组序列，例如，特定人染色体（旨P，染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、X染色体或Y染色体）的重复序列。适合的重复序列包括，但不限 于，着丝粒重复序列、近着丝粒重复序列、异染色质重复序列、端粒重复序列、a随体重复序 列、0随体重复序列、丫随体重复序列和随体1、2或3重复序列。在一些实施方式中，所述 目标核酸包括特异性序列（例如，特异性重复序列）内约20至约50个连续核巧酸的目标 序列。 W例通常，本发明的方法中使用的生物样品为固定的样品（例如，固定的细胞样品、固 定的组织样品、染色体涂片）。各种适合的固定剂是本领域已知的，且包括，例如，酸性丙酬 溶液、各种醒溶液（例如，甲醒、多聚甲醒和戊二醒）和酸性醇溶液。用于染色体制剂的特 定固定剂的实例例如在化ask等（Science230:1401-1402,1985)中描述。所述生物样品 可在溶液中或在固体载体上制备（例如，固定）。
[0050] 所述生物样品可W任选地预处理W使所述样品中的核酸更容易接近探针。运种 预处理可包括，例如，用一种或多种蛋白酶（例如，蛋白酶K、膜蛋白酶、胃蛋白酶、胶原蛋白 酶）和/或弱酸（例如，0.02-0. 2N肥1、25%至75%乙酸）处理生物样品、用核糖核酸酶处 理生物样品W除去残留RNA、样品的洗涂剂透化、样品热变性和样品熟化。其它预处理步骤 包括样品化学变性。在一个实施方式中，生物样品在非碱变性缓冲液（例如，70%甲酯胺） 中在升高的溫度（例如，72° °C)下变性。在另一个实施方式中，生物样品在包含至少一种 碱（例如，化OH)和至少一种醇（例如，乙醇）的溶液中在室溫下变性。优选地，所述碱/醇 溶液包含约0. 07N碱和约70%乙醇。
[0051] 根据本发明，所述生物样品与含有核酸探针的干燥纤维基质接触。所述干燥纤维 基质可W由天然存在的纤维或合成纤维构成。所述纤维可W是纺织纤维或非纺织纤维。示 例性的纤维包括，但不限于，玻璃纤维、羊毛纤维和植物纤维。在优选实施方式中，所述纤维 是玻璃纤维。在另一个实施方式中，所述纤维基质包含纤维素基材料（例如，纤维素纤维）。 适合的纤维素基材料包括，但不限于，纤维素、硝基纤维素、簇甲基纤维素、人造丝（rayon) 或粘胶纤维。
[0052] 在特定实施方式中，所述干燥纤维基质是滤纸（例如，纤维素基滤纸、玻璃纤维 滤纸）。适合的滤纸是可商购的，其包括，例如，Whatman?纤维素和玻璃微纤维滤纸（GE Healthcare)。
[0053] 干燥纤维基质含有用于检测目标核酸的标记核酸探针。优选地，所述探针是染色 体特异性的探针。所述探针可W在基质上、连接于基质、粘附于基质、沉积到基质上、嵌入基 质中或吸附到基质上。制备含有核酸的纤维基质的方法是本领域已知的。
[0054] 在一个实施方式中，在所述基质置于样品上之前，所述核酸探针在嵌入基质中或 吸附到基质上后变性。例如，在所述探针已经沉积到所述基质上后，可W加热所述纤维基质 到适合的溫度（例如，l〇〇°C)W使探针变性。同时，干燥（如脱水）所述基质W防止探针 复性。一旦基质已经干燥，变性的探针直到所述基质再水化才可W复性。
[0055]可用于本发明方法中的探针包含与样品中的目标核酸的核巧酸序列（例如，目标 序列）基本上互补的核巧酸序列，也称目标结合区域。虽然通常是期望的，但是探针中的目 标结合区域不要求具有与目标核酸100%的互补性。例如，在一些实施方式中，可用于本发 明方法中的探针可包含与目标核酸中的核巧酸序列至少约70%、约80%、约90%、约95% 或约99 %互补的核巧酸序列。
[0056] 在特定实施方式中，本发明方法中所使用的探针是寡核巧酸探针（例如，单链DNA 寡核巧酸探针）。典型的寡核巧酸探针是线性的，且大小范围为约20至约100个核巧酸，优 选地，约30至约50个核巧酸。在特定实施方式中，寡核巧酸探针长度为约30个核巧酸。
[0057]用于本发明方法中的合适的探针包括，但不限于，DNA探针、RNA探针、肤核酸 (PM)探针、锁核酸（LNA)探针、吗嘟代探针、二醇核酸（GNA)探针和苏糖核酸灯NA)探 针。运种探针可W是化学地或生物化学地修饰的和/或可含有非天然的或衍生的核巧酸碱 基。例如，探针可含有具有修饰的碱基（例如，5-甲基胞喀晚）和/或修饰的糖基（例如， 2'O-甲基核糖基、2'O-甲氧基乙基核糖基、2'-氣核糖基、2'-氨基核糖基）的修饰核巧 酸。虽然优选的是线性探针，但可用的探针可W是环状的或分支的和/或包括能够形成稳 定的二级结构（例如，茎-和-环和环-茎-环发夹结构）的结构域。
[0058] 制备可用于本发明方法中的探针的方法是本领域所公知的，且其包括，例如， 生物化学方法、重组方法、合成方法（例如，化学合成）和半合成方法。在一个实施方 式中，本发明方法中使用的寡核巧酸探针是通过化学合成制备的。合成的寡核巧酸 探针可使用用于核酸合成的已知方法（参见，例如，Glick和化sternak，Molecular Biotechnology:Principles和ApplicationsofRecombinantDNA(ASMPress1998))来 制备。例如，可使用溶液相或固相技术。合成程序通常是自动的，且可包括，例如，亚憐酷胺 法、亚憐酸S醋法、H-憐酸醋法或憐酸S醋法。
[0059] 可用于本发明方法中的探针可进一步包含一种或多种可检测标记。根据本发明适 合使用的标记是本领域中已知的，且通常包括按照其化学性质提供（无论是W直接方式还 是间接方式）允许探针检测的可识别信号的任何分子。因此，例如，可通过常规方式，例如 使用特定的报告分子、巧光团、放射性物质或酶（例如，过氧化物酶、憐酸酶）来标记探针。 在特定实施方式中，本发明方法中使用的探针包括一个或多个巧光团作为可检测标记。
[0060] 适合于连接于探针的可检测标记可W是间接标记或直接标记。示例性的间接标记 包括，例如，半抗原、生物素或其他可特异性结合的配体。对于间接标记，配体结合伴体通常 具有直接标记，或者，也可W间接地标记。作为半抗原的间接标记的实例包括二硝基苯酪 值NP)、洋地黄毒巧、生物素和各种巧光团或染料（例如，巧光素、DY490、DY590、Alexa405/ Cascade蓝、Alexa488、BodibyFL丹酷、俄勒冈绿、巧光黄、四甲基罗丹明/罗丹明红和得 克萨斯红）。作为间接标记，通常使用抗半抗原抗体作为配体结合伴体来检测半抗原。然 而，也可W使用可选择的配体结合伴体（例如，在生物素的情况下，可使用例如抗生物素抗 体或抗生物素蛋白链菌素作为配体结合伴体）来检测半抗原。此外，在某些实施方式中，还 可W直接检测半抗原（例如，在巧光素的情况中，可使用抗巧光素抗体或直接巧光检测）。
[0061] 示例性的"直接标记"包括，但不限于，巧光团（例如，巧光素、罗丹明、得克萨斯 红、藻红蛋白、切3、切5、0￥巧光体江111〇1')值7〇111；[。8 61]1地，扣]1曰，德国）、416皿532、416又曰 546、Alexa568或Alexa594)。其它直接标记可包括，例如，放射性核素（例如，3H、35S、 32P、1251和140,酶如碱性憐酸酶、辣根过氧化物酶或0-半乳糖巧酶、生色团（例如，藻 胆蛋白）、发光剂（例如，化学发光剂和生物发光剂）和铜系元素馨合物（例如，Eu3+或化3+ 的络合物）。在巧光标记的情况下，巧光团不限定于单一种类的有机分子，但包括无机分 子、有机和/或无机分子的多分子混合物、晶体、杂聚合物等。例如，包封在二氧化娃壳内的 CdSe-CdS核-壳纳米晶体可容易地衍生化W用于与生物分子偶联度ruchez等，Science, 281:2013-2016,1998)。类似地，高巧光的量子点（硫化锋覆盖的砸化儒）与生物分子共价 偶联W用于超灵敏的生物检测中（Warren和Nie,Science, 281:2016-2018,1998)。
[0062] 探针标记可例如在合成过程中或者在合成后例如使用5'-端标记来进行，其包括 使用末端转移酶将标记的核巧酸酶促添加至探针的5'-端。可通过使用"链终止"核巧酸来 添加单一的标记核巧酸。或者，可使用非终止的核巧酸而导致添加多个核巧酸W形成"尾"。 对于合成标记，可在化学合成过程中将标记的核巧酸（例如，亚憐酷胺核巧酸）并入所述探 针中。标记可添加至探针的5'-端、3'-端或两端（参见，例如，美国专利号5, 082, 830)， 或者在ODN内部的碱基位置处。
[0063]标记核酸的其它方法利用基于销的标记。运类方法包括通用连接系统扣LS， Kreatech Biotechnology B.V，阿姆斯特丹，荷兰）。基于销的标记法W及应用描述 在下述文献中，例如，美国专利号5, 580, 990、5, 714, 327和6, 825, 330 ;国际专利公 开号WO 92/01699、WO 96/35696和WO 98/15546 ;胎rnandez-Santoset等，Anal. 畑em. 77:2868-2874,2005;Raap等，BioTechniques 37:1-6,2004 !Heetebrij等， QiemBioQiem 4:573-583,2003 ;Van de Rijke等，Analytical Biochemistry 321:71-78， 2003 ;Gupta等，Nucleic Acids Resea;rch31:el3,2003;Van Gijlswijk等，Clinical 化emistiT 48:1352-1359,2002 ;Alers等，Genes,化romosomes&Cancer 25:301-305， 1999 ;Wiegant等，Cytogenetics和Cell Genetics 87:7-52,1999 ;Jelsma等，Journal of NIH Research 5:82,1994 ;Van Belkum等，BioTechniquesl6:148-153,1994和Van Belkum 等，Journal of Virological Methods45:189-200,1993。
[0064] 标记的核巧酸也可使用交联剂或间隔物（spacer)连接至探针。交联剂可W是同 型双官能的或异型双官能的。适合的同型双官能交联剂包括，例如，在每端具有NHS醋的 胺反应