施方式中，所述溶液包含约0. 07N的化0H，其等同于0. 07M化0H。 阳103]在一些实施方式中，试剂盒可包括附加的、任选的组分，例如，变性缓冲液（例如， 包含化OH和醇的缓冲液）、洗涂缓冲液、第二检测试剂、染色体DNA的染色剂、抗稱色剂、说 明书、实验方案或其组合。通常，所述试剂盒是区室化的W便于使用，并且可包括一个或多 个装有试剂的容器。在一个实施方式中，所有试剂盒组分包装在一起。或者，所述试剂盒的 一种或多种单独组分可W在与其他试剂盒组分分开的独立包装中提供（例如，水化缓冲液 可W与纤维基质分开包装）。
[0104] 在一些实施方式中，本发明的试剂盒包括变性缓冲液，其包含碱（例如，NaOH)和 醇。所述变性缓冲优选包括约0. 03N至约0. 17N的碱，例如，约0. 05N、约0. 06N、约0. 07N、约 0. 08N、约0. 09N或约0.IN的碱。优选地，所述变性缓冲液包含约0. 07N的化OH(即，0. 07M 的化OH)。在变性缓冲液中使用的示例性的碱包括，例如，氨氧化钟、氨氧化领、氨氧化飽、氨 氧化钢、氨氧化锁、氨氧化巧、氨氧化裡、氨氧化钢、氨氧化儀、下基裡、二异丙基氨基裡、二 乙基氨基裡、氨基钢、氨化钢、双甲基娃烷基）氨基裡、碳酸钢和氨或其组合。优选地， 所述碱是碱金属碱。更优选地，所述碱是氨氧化钢。所述变性缓冲液还包括至少一种醇，其 浓度为按体积计约50 %至约90 %，例如，按体积计约60 %、约70 %或约80 %。优选地，所述 醇W按体积计约70%的浓度存在。在所述变性缓冲液中使用的示例性的醇特别地包括，例 如，乙醇、甲醇、丙醇、下醇、戊醇和异戊醇，或其混合物。在特定实施方案中，所述变性缓冲 液包含约70 %的乙醇。
[01化]本发明的试剂盒可任选地包括一种或多种洗涂缓冲液。通常，所述一种或多种洗 涂缓冲液各自包含最终浓度为约0. 03M至约0. 09M的一种或多种盐（例如，钢盐、裡盐或钟 盐）。在特定实施方式中，所述洗涂缓冲液包括巧樣酸钢和氯化钢。所述洗涂缓冲液还可W 包含洗涂剂，其包括，但不限于，十二烷基硫酸钢（SDS)。所述洗涂缓冲液中SDS的适合浓度 通常在约0.01%至约1.0%SDS的范围内，优选约0. 1%SDS。另外，本发明试剂盒中的洗 涂缓冲液可任选地包括甲酯胺。在一个实施方式中，所述试剂盒包括包含1.864mM化OH和 2XSSC的洗涂缓冲液。 阳106] 任选地，本发明的试剂盒中可包括用于检测标记探针的一种或多种试剂。运样的 试剂或其他本领域技术人员公认用于检测分析中的成分对应于探针上标记的类型。在一个 实施方式中，所述试剂盒包括用于检测探针上的间接标记的第二试剂（例如，标记有巧光 团的抗生物素蛋白链菌素）。 7] 本发巧的示例连施方式描沐化下 阳10引实施例：使用纤维基质上的核酸探针进行的原位杂交法
[0109] 材料和方法：
[0110] 制备包含在纤维基质上的探针的组合物 阳111] 使用1/2"打孔器切割如alitative 1(纤维素）和GF/A(玻璃纤维）Whatman过 滤圆片。对于染色体3、6、7和20特异性的未稀释的寡核巧酸探针的混合物W 6-9 y L体积 沉积在每种类型圆片的中央。在烘箱中在60°C下加热圆片30分钟。在室溫下避光储存圆 片。
[0112] 在原位杂交之后检测包含上皮细胞的生物样品中的目标核酸
[0113] 来自外周血细胞的细胞遗传学载片在室溫下使用等溫变性溶液（Cellay，Inc, Cambridge,M)变性10分钟，然后在85%和100%的醇中各脱水1分种，并惊干。如上所 述制备具有嵌入的探针的纸圆片并放置在各个载片的期望杂交区域中的细胞上。在盖玻片 下在杂交溶液（10%葡聚糖、30%甲酯胺、2XSSC)中在37°C下使用非嵌入探针进行杂交， 或者在室溫下使用嵌入滤纸圆片的探针进行杂交，所述滤纸圆片在包含20%葡聚糖、30% 甲酯胺、6.OmMNaOH的杂交缓冲液中水化。对于室溫方法，使用己氏移液管在每个纸圆盘的 顶部加入适当体积的在水中稀释的杂交缓冲液。然后在37°C加热载片10分钟，或者在室溫 下放置载片10分钟。在杂交之后，在2XSSC中在室溫下伴随揽拌洗涂载片5分钟W除去 圆片，然后在等溫洗涂溶液（Cellay，Inc,Cambridge,MA)中在室溫杂交下洗涂5分钟W除 去未杂交的和非特异性杂交的探针。载片在2XSSC中简单冲洗并在用抗稱色剂、DAPI和 盖玻片封片之前干燥。封片的载片在被分析之前在载片支架上放置至少10分钟。
[0114] 统计
[0115] 在测量各巧光体的信噪比后，将信噪比平均，并如下计算在95%置信水平的平均 值的标准误差： 阳116]
[0117] 其中，对于95%置信水平，Z= 1. 96,SD=标准偏差，n=细胞数（200)。 阳11引 结果
[0119] 使用上文所述的程序，嵌入滤纸圆片的染色体特异性探针组被成功地用于原位杂 交程序W检测人外周血细胞中的染色体特异性目标核酸（图IA和1B)。当分别在升高的 溫度（37°C)下使用非嵌入探针进行杂交或者在室溫下使用嵌入滤纸圆片的探针进行杂交 时，运些方法产生了类似的结果（图2;将升高的溫度（蓝色，对照）与室溫（绿色，圆片） 比较）。 阳120] 本文中引用的所有专利、公布的申请和参考文献的相关教导通过引用W它们的整 体引入。 阳121] 虽然已参考其示例性实施方式具体地示出并描述本发明，但本领域技术人员将理 解，在不背离所附权利要求所涵盖的本发明范围的情况下，可在其中进行形式和细节上的 各种改变。
【主权项】
1. 确定目标核酸是否存在于固体表面上的生物样品中的方法，其包括以下步骤： a) 将所述固体表面上的样品与干燥的纤维基质接触，其中用于检测所述目标核酸的标 记的核酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上，和其中所述标记的核酸探针包含与所述目标 核酸中的一个或多个不同核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列； b) 将所述基质水化以从所述基质释放所述探针； c) 将所述样品与所述探针在足以允许所述探针与如果存在于所述样品中的所述目标 核酸特异性杂交的严格条件下孵育； d) 洗涤所述样品以去除未杂交的和非特异性杂交的探针；和 e) 通过测定所述标记的核酸探针是否与所述样品杂交来确定所述目标核酸是否存在 于所述样品中。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维基质包含玻璃纤维、羊毛纤维、合成纤维 或植物纤维。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述纤维基质包含纤维素基材料。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述纤维素基材料选自纤维素、硝基纤维素、羧甲 基纤维素、人造丝或粘胶纤维。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中选自鲑鱼精DNA、封闭试剂和抗微生物 剂或其组合的一种或多种附加试剂嵌入所述基质中或吸附到其上。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在步骤b)中将包含约30%甲酰胺、 约10 %至约20 %硫酸葡聚糖和2XSSC的水性杂交缓冲液加入到所述基质中以水化所述基 质。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述标记的核酸探针是DNA寡核苷酸 探针。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸探针具有约20至约50个核苷 酸的长度。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸探针具有约30个核苷酸的长 度。10. 根据权利要求7、8或9所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸探针是合成产生的。11. 根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述标记的核酸探针包含至少一个 直接标记。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述直接标记是荧光体。13. 根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述生物样品结合或粘附到所述固 体载体。14. 根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含上皮细胞。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述上皮细胞选自尿路上皮细胞和外周血细胞 或其组合。16. 根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含选自精细胞、卵 母细胞、极体、卵裂球和囊胚或其组合的细胞。17. 根据权利要求1-5和7-16中任一项所述的方法，其中所述方法的步骤c)在约19 摄氏度至约25摄氏度范围内的温度下进行。18. 根据权利要求17所述的方法，其中在步骤b)中将包含约I. 0-5.OmMNaOH并具有 在约10至约13范围内的pH值的杂交缓冲液加入到所述基质中以水化所述基质。19. 根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述生物样品被固定在玻璃载片 上。20. -种计数固定在载片上的细胞样品中的染色体的方法，其包括以下步骤： a) 将所述样品覆盖在具有纤维基质的载片上，所述纤维基质包含玻璃纤维，其中用于 检测所述样品中的一个或多个靶染色体序列的荧光标记的合成DNA寡核苷酸探针嵌入所 述基质中或吸附到其上，和其中所述探针包含与所述一个或多个靶染色体序列中的核苷酸 序列基本上互补的核苷酸序列； b) 使用杂交缓冲液将所述基质水化以从所述基质释放所述探针； c) 将所述样品与所述探针在足以允许所述探针与如果存在于所述样品中的所述靶染 色体序列特异性杂交的严格条件下孵育； d) 洗涤所述样品以去除未杂交的探针和非特异性杂交的探针；和 e) 通过检测与所述样品中的所述靶染色体序列杂交的标记核酸探针来计数所述样品 中具有所述靶染色体序列的染色体。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述严格条件包括将所述样品与所述探针在约 19摄氏度至约25摄氏度范围内的温度下孵育。22. 根据权利要求20或21所述的方法，其中选自鲑鱼精DNA、封闭试剂和抗微生物剂 或其组合的一种或多种附加试剂嵌入所述基质中或吸附到其上。23. 根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸探针具有约30 个核苷酸的长度。24. 根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述细胞是上皮细 胞、精细胞、卵母细胞、极体、卵裂球或囊泡或其组合。25. 用于检测样品中的目标核酸的试剂盒，其包含： a) 包含用于检测所述目标核酸的标记的核酸探针的干燥纤维基质，其中所述标记的核 酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上，和其中所述标记的核酸探针包含与所述目标核酸中 的一个或多个核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列； b) 用于从所述基质释放所述探针的水化缓冲液。26. 根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述纤维基质包含玻璃纤维、羊毛纤维、合成 纤维或植物纤维。27. 根据权利要求25或26所述的试剂盒，其中所述纤维基质包含纤维素基材料。28. 根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述纤维素基材料选自纤维素、硝基纤维素、 羧甲基纤维素、人造丝或粘胶纤维。29. 根据权利要求25-28中任一项所述的试剂盒，其中选自鲑鱼精DNA、封闭试剂和抗 微生物剂或其组合的一种或多种附加试剂嵌入所述基质中或吸附到其上。30. 根据权利要求25-29中任一项所述的试剂盒，其中所述水化缓冲液包含约30%甲 酰胺、约10%至约20%硫酸葡聚糖和2XSSC。31. 根据权利要求25-29中任一项所述的试剂盒，其中所述水化缓冲液包含约 L0-5.OmMNaOH并具有在约10至约13范围内的pH值。32. 根据权利要求25-31中任一项所述的试剂盒，其中所述标记的核酸探针是合成DNA 寡核苷酸探针。33. 根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述DNA寡核苷酸探针具有约20至约50个 核苷酸的长度。34. 根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述DNA寡核苷酸探针具有约30个核苷酸的 长度。35. 根据权利要求25-34中任一项所述的试剂盒，其中所述标记的核酸探针包含至少 一个焚光标记。
【专利摘要】本发明涉及使用嵌入干燥的纤维基质中或吸附到其上的核酸探针在固体表面的生物样品上进行原位杂交的方法与试剂盒。例如，可以使用在滤纸或玻璃纤维圆片上以干燥形式提供的荧光标记寡核苷酸探针来进行荧光原位杂交(FISH)。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105229166
【申请号】CN201380068639
【发明人】J·奥里驰-科斯塔, E·埃文, M·吉尔德亚
【申请人】塞雷公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2013年10月16日
【公告号】EP2914737A1, US8877441, US20140120535, US20150064701, WO2014070460A1, WO2014070460A8