r>[0079] 在利用巧光探针的巧光原位杂交（FISH)程序的特定情况下，可利用各种不同 的光学分析检测杂交复合物。光谱检测方法在例如美国专利号5, 719, 024 ;Schroeck等（Science 273:494-497,1996);和Speicher等（化1:ure Genetics 12:368-375， 1996)中讨论。关于一般FI甜程序的进一步指导在例如Gall和Par化e(Methods in Enzymology21:470-480,1981)；Henderson(International Review of Cytology76:1-46， 1982)；和Angerer等，Genetic Engineering ：Principles and Methods (Setlow和 Hollaender编，Plenum Press,化￥ 中讨论。
[0080] 间接标记的检测通常包括结合伴体或第二试剂的检测。例如，间接标记如生物素 和其它半抗原（例如，洋地黄毒巧值IG)、DNP或巧光素）可通过与作为第二试剂的抗生物 素蛋白链菌素（即，在生物素的情况下）或抗体的相互作用来检测。在探针与目标结合后， 可通过使用例如直接标记的抗生物素蛋白链菌素或抗体来检测目标-探针复合物。或者， 未标记的第二试剂可与特异性地结合第二试剂的直接标记的"第试剂一起使用（例 如，可使用未标记的抗DIG抗体，其可W用对第一抗体的种类和类别特异性的标记的第二 抗体来检测）。用于第二试剂的标记通常为非同位素标记，尽管可使用放射性同位素标记。 典型的非同位素标记包括，例如，可与第二或第S试剂偶联的酶和巧光团。通常用于DNA诊 断的酶包括，例如，辣根过氧化物酶和碱性憐酸酶。
[0081] 取决于所使用的酶学标记的类型，酶标记的检测可例如通过检测颜色或染料沉积 (例如，用于碱性憐酸酶的对硝基苯基憐酸醋或5-漠-4-氯-3-吗I噪憐酸醋/氮蓝四挫，和 用于辣根过氧化物酶的3, 3'-二氨基联苯胺-NiCI2)、巧光（例如，用于碱性憐酸酶的4-甲 基伞花基憐酸醋）或化学发光（例如，来自LumigenInc.,DetroitMich.的碱性憐酸酶二 氧杂环下烧（dioxetane)底物LumiPhos530 或来自Tropix,Inc.的AMPPD和CSPD)来实 现。可用X射线或化Iaroid膜或通过使用单光子计数光度计（例如，用于碱性憐酸酶标记 的探针）进行化学发光检测。
[0082] 在某些实施方式中，使用数字增强或积分来检测来自探针上标记的信号。例如， 标记的检测可包括使用显微成像，其采用安装在显微镜（例如，双目、单目或立体显微镜） 的目镜管上的CCD相机。在一些实施方式中，使用图像扫描显微术完成标记的检测。例 如，计算机化图像扫描显微术的最新进展已显著提高了使用巧光显微术检测稀有细胞的能 力，从而允许在~6Xl〇5个阴性细胞的环境中检测1个阳性细胞（参见，例如，Mehes等， 切tometry42:357-362,2000)。已开发了先进的图像扫描软件，其不仅可W检测多种颜色， 而且可W检测可用于检测例如DNA水平上的易位的融合的或共定位的信号（MetaSystems Group,Inc.)。扫描速度通常取决于用于可靠地检测单个阳性细胞的参数的数量。图像扫描 还允许人工检查评分为阳性的细胞的图像W进行确认。已开发了用于自动化的、基于载片 的分析的先进图像扫描软件，其不仅可W检测多种颜色，而且可W检测可用于检测例如DNA 水平上易位的融合或共定位信号（MetaSystemsGroup,Inc.)。扫描速度通常取决于用于 单一阳性细胞的可靠检测的参数的数量。自动化的基于载片的扫描系统特别适合高通量测 定。
[0083] 在一个实施方式中，使用扫描载片显微镜，例如，使用Meta切te自动化生物成像 系统（MetaSystemGroup,Inc.)。该系统由下述组件组成：l)Ca;rlZeissAxioPlan2M0T 巧光显微镜，2)扫描8-位置平台，3)PC奔腾III处理器，4)Jai照相机，5)照相机接口，6) 平台控制，7)轨迹球和鼠标，和8)打印机。焦点分析从装载于显微镜上的载片装置开始。 随平台移动扫描载片，并捕获图像。在扫描整个载片后创建图库。基于对于阳性或阴性设 置的标准，图像分析产生阳性信号或阴性信号。如果为阴性，则重扫描载片进行稀有事件分 析。如果为阳性，对适当的巧光信号更换滤镜，并捕捉和分析5-7个平面。对于8个载片， 存在离开（walkaway)/过夜操作（标准或具有任选的托盘变换器的100个载片）。适应 性检测算法和自动曝光控制功能补偿不均匀的染色条件。可同时检测几种标志物。标准光 源覆盖从紫外到红外的广泛光谱。如果细胞巧光强度允许在1/1，000秒内检测，则高达每 秒1，000个细胞的扫描速度可用于检测稀有细胞。对于强信号，可使用较低的放大倍数W 增加扫描速度。
[0084] 或者，探针的检测可在不存在数字增强或积分的情况下进行。 阳0化]计数染色体的方法
[0086] 在特定实施方式中，本发明设及计数固定在载片上的细胞样品中的染色体的方 法。优选地，细胞是上皮细胞（例如，尿路上皮细胞、外周血细胞）、精细胞、卵母细胞、极体、 卵裂球、囊胚或其组合。在一个实施方式中，所述细胞粘附到玻璃显微镜载片上。
[0087]所述方法包括将所述样品覆盖在具有纤维基质的载片上，所述纤维基质包含玻璃 纤维，其中用于检测所述样品中的一种或多种祀染色体序列的巧光标记的合成DNA寡核巧 酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上。所述寡核巧酸探针包含与所述一种或多种祀染色体 序列中的核巧酸序列基本上互补的核巧酸序列。优选地，所述寡核巧酸探针是染色体特异 性的探针。在一个实施方式中，所述寡核巧酸探针具有约20至约50个核巧酸的长度，更优 选具有约30个核巧酸的长度。
[0088] 所述方法还包括使用水化缓冲液将所述基质水化W从所述基质释放所述探针。 在特定实施方式中，所述水化缓冲液包含甲酯胺、硫酸葡聚糖和盐（例如，巧樣酸钢盐水 (SSC))。优选地，所述水化缓冲液包含约30%甲酯胺、约10%至约20%硫酸葡聚糖和约 2XSSC。在另一个实施方式中，所述水化缓冲液包含碱（例如，化OH)并具有在约10至约 13范围内的抑值。
[0089] 所述方法还包括将所述样品与所述探针在足W允许所述探针与所述样品中的所 述祀染色体序列（如果存在）特异性杂交的严格条件下解育。所述探针与所述祀染色体序 列特异性杂交的适合条件可W由本领域技术人员确定，并包括，例如，在包含2XSSC、30% 甲酯胺和10-20%硫酸葡聚糖的杂交缓冲液中在37°C下杂交5-10分钟。其他优选的杂交 条件包括在包含6mM化0H、30%甲酯胺和20%硫酸葡聚糖的杂交缓冲液中在室溫下杂交 5-10分钟。优选地，用于水化纤维基质的水化缓冲液也用作杂交缓冲液。在一个实施方式 中，杂交在升高的溫度（例如，37°C)下进行。在替代的实施方式中，杂交在室溫下进行。
[0090] 计数染色体的方法还包括洗涂所述样品W除去未杂交的探针和非特异性杂交的 探针，和通过检测与所述样品中的祀染色体序列杂交的标记核酸探针来计数所述样品中具 有祀染色体序列的染色体的步骤。可W如本文所述的对于用于确定目标核酸是否存在于生 物样品中的方法中进行洗涂和检测。
[0091] 用于检测目标核酸的试剂盒
[0092] 在另一个实施方式中，本发明设及用于检测样品中的目标核酸的试剂盒。所述试 剂盒包括包含用于检测目标核酸的标记核酸探针的干燥纤维基质，和用于从所述基质释放 所述探针的水化缓冲液。所述标记核酸探针嵌入所述基质中或吸附到其上，并且包含与所 述目标核酸中的一个或多个核巧酸序列基本上互补的核巧酸序列。
[0093] 所述干燥纤维基质可W由天然存在的纤维或合成纤维组成。所述纤维可W是纺织 纤维或非纺织纤维。示例性的纤维包括，但不限于，玻璃纤维、羊毛纤维和植物纤维。在优 选实施方式中，所述纤维是玻璃纤维。在另一个实施方式中，所述纤维基质包含纤维素基材 料（例如，纤维素纤维）。适合的纤维素基材料包括，但不限于，纤维素、硝基纤维素、簇甲基 纤维素、人造丝和粘胶纤维。
[0094] 在特定实施方式中，所述干燥纤维基质是滤纸（例如，纤维素基滤纸、玻璃纤维 滤纸）。适合的滤纸是可商购的，其包括，例如，Whatman?纤维素和玻璃微纤维滤纸（GE Healthcare)。
[00巧]所述干燥纤维基质包括包含与目标核酸中的目标序列基本上互补的目标结合区 域的核酸（例如，DNA、RNA)探针。所述核酸探针嵌入所述干燥纤维基质中或吸附到其上。 优选地，所述探针是染色体特异性的探针。
[0096] 在本发明所述方法中使用的适合的探针包括，但不限于，DNA探针、RNA探针、肤核 酸（PM)探针、锁核酸（LNA)探针、吗嘟代探针、二醇核酸（GNA)探针和苏糖核酸（TM)探 针。运些探针可W是化学或生物化学修饰的和/或可含有非天然的或衍生的核巧酸碱基。 例如，探针可含具有经修饰的碱基（例如，5-甲基胞喀晚）和/或经修饰的糖基（例如， 2'0-甲基核糖基、2'0-甲氧基乙基核糖基、2'-氣核糖基、2'-氨基核糖基）的修饰核巧 酸。虽然优选的是线性探针，但是可用的探针可W是环状的或是支化的和/或包括能够形 成稳定二级结构（例如，茎-和-环和环-茎-环发夹结构）的结构域。
[0097] 优选地，所述探针是寡核巧酸探针。适合的寡核巧酸探针通常具有约20到约100 个核巧酸的长度，优选约20至约50个核巧酸的长度，并且更优选约30个核巧酸的长度。优 选地，本发明试剂盒中的寡核巧酸探针是单链DNA探针。
[0098] 在某些实施方式中，本发明试剂盒中的探针是被标记的（例如，包含一种或多种 可检测标记）。用于探针的示例性的可检测标记在本文中描述。优选地，本发明试剂盒中的 寡核巧酸探针包含一种或多种巧光团（例如，巧光素、罗丹明、得克萨斯红、藻红蛋白、切3、 切5、Alex 532、Alexa 546、Alexa日68或Alexa 594)。
[0099] 在一些实施方式中，所述纤维基质载有多种不同的标记探针。在运样的实施方式 中，每个探针对特定目标核酸是特异性的，并且包含区别于其他探针上存在的对于其他目 标核酸具有特异性的可检测标记。例如，每种探针可包含具有可光谱区分的发射波长的巧 光团。适用于具有多种不同标记探针的本发明试剂盒的巧光团包括，例如，Alexa488(在 492nm处具有最大激发和在520nm处具有最大发射）和Alexa546 (在555nm处具有最大激 发和在570nm处具有最大发射））。
[0100] 在一些实施方式中，所述干燥纤维基质包括嵌入所述基质中或吸附到其上的一种 或多种附加试剂。运样的附加试剂包括，例如，娃鱼精DNA、封闭试剂（例如，乳（例如，脱脂 乳）、白蛋白、酪蛋白）和抗微生物剂（例如，叠氮化钢、硫柳隶）或其组合。 阳101] 本发明所述试剂盒还包括水化缓冲液。在一些实施方式中，所述水化缓冲液也作 为杂交缓冲液起作用。在特定实施方式中，所述水化缓冲液包含甲酯胺、硫酸葡聚糖和盐 (例如，巧樣酸钢盐水（SSC))。所述水化缓冲液中甲酯胺的适合浓度包括，例如，在按体积 计约20%至约90 %范围内的浓度，例如，按体积计约60 %、约70 %或约80 %。所述水化缓 冲液中硫酸葡聚糖的适合浓度包括，例如，约3%至约20%。所述水化缓冲液中总盐浓度优 选在约0. 03M至约0. 09M的范围内。例如，所述水化缓冲液中SSC的浓度可W是，例如，在约 0.IX至约4.OX的范围内。优选地，所述水化缓冲液包含约30%甲酯胺、约10%至约20% 的硫酸葡聚糖和2XSSC。
[0102] 在另一个实施方式中，所述水化缓冲液包含碱（例如，化OH)，并且具有在约10至 约13范围内的抑值。当杂交在室溫下进行时，包含碱的水化缓冲剂是特别有利的。在所述 水化缓冲液中使用的适合的碱包括，但不限于，氨氧化钟、氨氧化领、氨氧化飽、氨氧化钢、 氨氧化锁、氨氧化巧、氨氧化裡、氨氧化钢、氨氧化儀、下基裡、二异丙基氨基裡、二乙基氨基 裡、氨基钢、氨化钢、双（立甲基甲娃烷基）氨基裡、碳酸钢和氨水或其组合。优选地，所述 碱是强碱。更优选地，所述碱是氨氧化钢。所述水化缓冲液的碱的适合浓度通常在约0.03 当量浓度（脚至约0. 17N的范围内，例如，约0. 05N、约0. 06N、约0. 07N、约0. 08N、约0. 09N 或约0. 1N。在特定实