一种用于荧光原位杂交ffpe组织切片的预处理液及预处理方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理方法以及预处理液。所述预处理液包括预处理液I和预处理液II；所述预处理液I的组分为烷基酚聚氧乙烯醚(TX?10)和/或乙基苯基聚乙二醇；所述预处理液II的组分包括烷基酚聚氧乙烯醚(TX?10)和/或乙基苯基聚乙二醇，还包括乙二胺四乙酸(EDTA)和/或柠檬酸缓冲液。本发明采用预处理液I和预处理液II在高于石蜡熔点的水性环境下利用乳化剂亲水又亲油的特性直接溶解乳化石蜡，完成了水化和通透，简化了步骤并节省了时间。预处理液II还可以打破甲醛固定导致的蛋白间交联，使FFPE组织更易被蛋白酶消化，显著的降低组织自发荧光和背景。
【专利说明】
一种用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理液及预处理方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理方法以及预处理液。
【背景技术】
[0002]荧光原位杂交是一种在20世纪80年代放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子遗传技术，以荧光素标记取代放射性同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。FISH具有安全、快速、灵敏度高及同时显示多种颜色等优点。
[0003]在进行荧光原位杂交实验时使用传统方法通常需要对FFPE样本切片进行脱蜡、复水、硫氰酸纳处理、蛋白酶消化、2X SSC漂洗及酒精脱水干燥等步骤，全程步骤复杂且耗时较长(图1)，此外传统的处理方法中需要使用二甲苯及硫氰酸钠等有毒试剂，这都极大增加了实验操作人员的健康风险以及实验废弃物对环境造成严重污染。
[0004]此外，在荧光原位杂交实验中组织本身产生的自发荧光也对实验结果产生着很大的干扰，尤其是探针片段标记较小时；这些自发荧光通常由组织细胞内源的核黄素、脂褐素、网状纤维、胶原蛋白和弹性蛋白等引起。在对某些代谢旺盛的组织细胞或存在大量胶原蛋白和弹性蛋白或网状纤维的组织进行荧光原位杂交时，其杂交结果在荧光显微镜下呈现较强的自发荧光和背景，严重影响结果判读，而传统的处理方法并不能很好的解决这一问题。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理方法以及预处理液。
[0006]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为:
[0007]一种用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理液，包括预处理液I和预处理液II。
[0008]上述方案中，所述预处理液I为乳化剂溶液，所述乳化剂为烷基酚聚氧乙烯醚(TX-10)和/或乙基苯基聚乙二醇。
[0009]上述方案中，所述预处理液II的组分包括乳化剂，所述乳化剂为烷基酚聚氧乙烯醚(TX-10)和/或乙基苯基聚乙二醇。
[0010]上述方案中，所述预处理液I和预处理液11中乳化剂的质量浓度均为0.1?1 %。
[0011]上述方案中，所述预处理液II的组分还包括其他组分，所述其他组分为乙二胺四乙酸(EDTA)和/或柠檬酸缓冲液。
[0012]上述方案中，所述乙二胺四乙酸(EDTA)在预处理液II中的浓度为10?lOOmM，所述柠檬酸缓冲液在预处理液II中的浓度为5?lOOmM，pH值4.8?6.2。
[0013]一种用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理方法，包括如下步骤:
[0014](I)烤片:将组织切片放置在65°C的烤片机上烤片3?5min;
[0015](2)预处理液I处理:将组织切片浸入预热至68°C的预处理剂I中5min;
[0016](3)预处理液II处理:取出预处理液I中的组织切片，在吸水纸上沥干残余的预处理液I，再将组织切片浸入预热至72°C的预处理液II中lOmin，每隔2?3min上下震荡玻片一次；
[0017](4)将组织切片浸入到预热至68°C的去离子水中洗涤30s;
[0018](5)取出组织切片并浸入现配的预热至37°C的胃蛋白酶工作液中，消化5?15min;
[0019](6)完成消化后将组织切片浸入2 X SSC溶液中Imin;
[0020](7)重复步骤(6)，然后取出组织切片依次通过70Vt% (体积浓度)、85Vt%、100￥丨％酒精各21^11梯度脱水；
[0021](8)取出组织切片后自然晾干，用于后续荧光原位杂交实验。
[0022]上述方案中，所述胃蛋白酶工作液的组分包括:2wt%胃蛋白酶，0.02M HCL，所述胃蛋白酶的酶活为3500U/mg。
[0023]上述方案中，所述2 X SSC溶液的pH为6.8?7.2。
[0024]本发明所述制备方法中，步骤(5)中消化程度可以通过在普通的明场显微镜下观察，若消化不足则将需要再将切片浸入消化液中消化数分钟，再次观察;若消化过度则应重新进行实验。
[0025]本发明所述制备方法中，步骤(2)和(3)共同完成了石蜡切片脱蜡、复水及打破蛋白交联通透组织的作用。
[0026]本发明的有益效果如下:(I)本发明采用了预处理液I和预处理液II在高于石蜡熔点的水性环境下利用乳化剂的亲水又亲油的特征直接溶解乳化石蜡并且完成了水化和通透的作用，简化了传统的脱蜡步骤并节省了时间(将处理时间由传统的2.5小时缩短到40?50分钟)。(2)本发明采用的预处理液II还可以打破甲醛固定导致的蛋白间交联，以使FFPE组织更易被蛋白酶消化，可以显著的降低组织的自发荧光和背景。(3)本发明摆脱了传统的脱蜡剂二甲苯，整个操作过程无毒无害且无异味无需在通风橱中进行;本发明简化的操作步骤以及水性的脱蜡剂更适用于自动化仪器操作且实验产生的废液对环境友好无污染。
【附图说明】
[0027]图1为传统预处理方法和本发明所提供预处理方法耗时对比。
[0028]图2为使用本发明所述预处理液及预处理方法处理乳腺癌FFPE组织样本，并使用Vysis HER2基因扩增检测试剂盒为检测探针进行原位杂交实验，切片经严格洗涤后封片镜检的结果。
[0029]图3为使用传统预处理方法处理乳腺癌FFPE组织样本，并使用VysisHER2基因扩增检测试剂盒为检测探针进行原位杂交实验，切片经严格洗涤后封片镜检的结果。
[0030]图4为使用本发明所述预处理液及预处理方法处理肺癌FFPE组织样本，并使用Vysis ALK融合基因检测试剂盒为检测探针进行原位杂交实验，切片经严格洗涤后封片镜检的结果。
[0031]图5为使用传统预处理方法处理乳腺癌FFPE组织样本，并使用ALK融合基因检测试剂盒为检测探针进行原位杂交实验，切片经严格洗涤后封片镜检的结果。
【具体实施方式】
[0032]为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0033]实施例1
[0034]本实施例选取乳腺癌FFPE组织样本作为测试样本，采用本发明所述预处理方法进行预处理，包括如下步骤:
[0035](I)烤片:将组织切片放置在65°C的烤片机上烤片3?5min;
[0036](2)预处理液I处理:将组织切片浸入预热至68°C的预处理剂I中5min;所述预处理液I成份为lwt%乙基苯基聚乙二醇和0.5wt%烷基酚聚氧乙烯醚。
[0037](3)预处理液II处理:取出预处理液I中的组织切片，在吸水纸上沥干残余的预处理液I，再将组织切片浸入预热至72°C的预处理液II中lOmin，每隔2?3min上下震荡玻片一次;所述预处理液II成份为0.5wt%乙基苯基聚乙二醇和1mM梓檬酸缓冲液(pH 6.2)。
[0038](4)将组织切片浸入到预热至68°C的去离子水中洗涤30s;
[0039](5)取出组织切片并浸入现配的预热至37°C的胃蛋白酶工作液(2%胃蛋白酶(3500U/mg)、0.02M HCL)中，消化5?15min;
[0040](6)完成消化后将组织切片浸入2 X SSC溶液(PH=6.8?7.2)中Imin;
[0041](7)重复步骤(6)，取出组织切片依次通过70%、85%、100%酒精各2min梯度脱水；
[0042](8)取出组织切片后自然晾干，用于后续荧光原位杂交实验。
[0043]使用VysisHER2基因扩增检测试剂盒为检测探针，对本实施例预处理后的干燥的乳腺癌FFPE组织切片进行荧光原位杂交，具体操作步骤如下:
[0044](I)取预处理后的干燥FFPE组织样本切片，加入1uL上述Vysis HER2基因扩增检测试剂盒为检测探针，盖上盖玻片并用橡皮胶封片；
[0045](2)将封片后的切片置于杂交仪中设置杂交程序:83°C变性5min，37°C杂交过夜；
[0046](3)取出过夜杂交的玻片，小心撕去橡皮胶并轻轻取下盖破片，将玻片浸入预热至65 0C 的洗涤液中(0.3% NP40，0.4 X SSC)洗涤 5min ；
[0047](4)取出玻片，浸入室温的漂洗液(0.1% NP40，2 X SSC)中洗涤2?3min ；
[0048](5)取出玻片后浸入70%酒精中洗涤2?3min，取出后室温晾干;荧光显微镜下观察乳腺癌FFPE组织样本的实验结果，分析信号强度及背景如图2所示。
[0049]对比例I
[0050]选取乳腺癌FFPE组织样本作为测试样本，采用传统的用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理方法进行预处理，包括如下步骤:
[0051 ] (I)烤片:将组织片置于65°C下过夜烘烤；
[0052](2)脱蜡:将组织切片浸入二甲苯中室温脱蜡2次，每次15分钟；
[0053](3)将切片浸入100%乙醇中5分钟；
[0054](4)将组织切片依次室温下置于100%乙醇，85%乙醇，70%乙醇中各2分钟复水；
[0055](5)将组织切片室温浸入去离子水3分钟，用无绒纸巾试干；
[0056](6)将组织切片置于80°C0.1M HCL溶液中20min;
[0057](7) 50°C下用5 % (w/v)硫氰酸钠处理组织切片30分钟；
[0058](8)室温下于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟；
[0059](9)取0.4ml蛋白酶K储存液(20mg/ml)溶于40ml 2XSSC得到蛋白酶K工作液(200μg/ml)，将组织切片浸入蛋白酶K工作液中37°C孵育20?30分钟；
[0060](10)组织切片经蛋白酶K处理后，于2XSSC中漂洗2次，每次5分钟；
[0061 ] (11)将组织切片浸入0.1M HCL中室温浸泡5?10分钟；
[0062 ] (12)于2XSS溶液中漂洗2次，每次5分钟；
[0063](13)将组织切片玻片依次浸入70%，85%，100%乙醇中各2分钟脱水；
[0064](14)自然干燥玻片。
[0065]使用VysisHER2基因扩增检测试剂盒为检测探针，对采用对比例I所述传统的预处理方法预处理后的干燥的乳腺癌FFPE组织切片进行荧光原位杂交，具体操作步骤如下:
[0066](I)取预处理后的干燥切片，加入1ul上述Vysis HER2基因扩增检测试剂盒为检测探针，盖上盖玻片并用橡皮胶封片；
[0067](2)将封片后的切片置于杂交仪中设置杂交程序:83°C变性5min，37°C杂交过夜；
[0068](3)取出过夜杂交的玻片，小心撕去橡皮胶并轻轻取下盖破片，将玻片浸入预热至65 0C 的洗涤液中(0.3% NP40，0.4 X SSC)洗涤 5min ；
[0069](4)取出玻片，浸入室温的漂洗液(0.1% NP40，2 X SSC)中洗涤2?3min ；
[0070](5)取出玻片后浸入70%酒精中洗涤2?3min，取出后室温晾干;荧光显微镜下观察乳腺癌FFPE组织样本的实验结果，分析信号强度及背景如图3所示。
[0071]将实施例1中采用本发明所述用于荧光原位杂交FFPE组织切片预处理方法获得的实验结果(图2)与对比例I中采用传统的预处理方法获得的实验结果(图3)进行比较，可以看出:采用本发明所述用于荧光原位杂交FFPE组织切片预处理方法处理后的乳腺癌FFPE组织样本，将其进行荧光原位杂交，其组织的自发荧光和背景更低，信号点清晰、信号判读更容易。
[0072]实施例2
[0073]本实施例选取肺腺癌FFPE组织样本作为测试样本，采用本发明所述用于荧光原位杂交FFPE组织切片预处理方法进行预处理，包括如下步骤:
[0074](I)烤片:将组织切片放置在65°C的烤片机上烤片3?5min;
[0075](2)预处理液I处理:将组织切片浸入预热至68°C的预处理剂I中5min;所述预处理液I为lwt%乙基苯基聚乙二醇和0.5wt%烷基酚聚氧乙烯醚。
[0076](3)预处理液II处理:取出预处理液I中的组织切片，在吸水纸上沥干残余的预处理液I，再将组织切片浸入预热至72°C的预处理液II中lOmin，每隔2?3min上下震荡玻片一次;所述预处理液II成份为0.5wt%乙基苯基聚乙二醇、1mM柠檬酸缓冲液(pH 6.0)和1mMEDTA0
[0077](4)将组织切片浸入到预热至68°C的去离子水中洗涤30s;
[0078](5)取出组织切片并浸入现配的预热至37°C的胃蛋白酶工作液(2%胃蛋白酶(3500U/mg)、0.02M HCL)中，消化5?15min;
[0079](6)完成消化后将组织切片浸入2 X SSC溶液(PH=6.8?7.2)中Imin;
[0080](7)重复步骤(6)，取出组织切片依次通过70%、85%、100%酒精各2min梯度脱水；
[0081](8)取出组织切片后自然晾干，用于后续荧光原位杂交实验。
[0082]使用VysisALK融合基因检测试剂盒为检测探针，对本实施例预处理后的干燥的肺腺癌FFPE组织切片进行荧光原位杂交，具体操作步骤如下:
[0083](I)取预处理后的干燥切片，加入1uL上述Vysis ALK融合基因检测试剂盒为检测探针，盖上盖玻片并用橡皮胶封片；
[0084](2)将封片后的切片置于杂交仪中设置杂交程序:83°C变性5min，37°C杂交过夜；
[0085](3)取出过夜杂交的玻片，小心撕去橡皮胶并轻轻取下盖破片，将玻片浸入预热至65 0C 的洗涤液中(0.3% NP40，0.4 X SSC)洗涤 5min ；
[0086](4)取出玻片，浸入室温的漂洗液(0.1% NP40，2 X SSC)中洗涤2?3min ；
[0087](5)取出玻片后浸入70%酒精中洗涤2?3min，取出后室温晾干;荧光显微镜下观察肺腺癌FFPE组织样本的实验结果，分析信号强度及背景如图4所示。
[0088]对比例2
[0089]选取肺腺癌FFPE组织样本作为测试样本，采用传统的用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理方法进行预处理，包括如下步骤:
[0090](I)烤片:将组织片置于65°C下过夜烘烤；
[0091](2)脱蜡:将组织切片浸入二甲苯中室温脱蜡2次，每次15分钟；
[0092](3)将切片浸入100%乙醇中5分钟；
[0093](4)将组织切片依次室温下置于100%乙醇，85%乙醇，70%乙醇中各2分钟复水；
[0094](5)将组织切片室温浸入去离子水3分钟，用无绒纸巾试干；
[0095](6)将组织切片置于80°C0.1M HCL溶液中20min;
[0096](7) 50 °C下用5 % (w/v)硫氰酸钠处理组织切片30分钟；
[0097](8)室温下于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5分钟；
[0098](9)取0.4ml蛋白酶K储存液(20mg/ml)溶于40ml 2XSSC得到蛋白酶K工作液(200μg/ml)，将组织切片浸入蛋白酶K工作液中37°C孵育20?30分钟；
[0099](10)组织切片经蛋白酶K处理后，于2XSSC中漂洗2次，每次5分钟；
[0100](11)将组织切片浸入0.1M HCL中室温浸泡5?10分钟；
[0101](12)于2XSS溶液中漂洗2次，每次5分钟；
[0102](13)将组织切片玻片依次浸入70%，85%，100%乙醇中各2分钟脱水；
[0103](14)自然干燥玻片。
[0104]使用VysisALK融合基因检测试剂盒为检测探针，对采用对比例2所述传统的预处理方法预处理后的干燥的肺腺癌FFPE组织切片进行荧光原位杂交，具体操作步骤如下:
[0105](I)取预处理后的干燥切片，加入1uL上述Vysis ALK融合基因检测试剂盒为检测探针，盖上盖玻片并用橡皮胶封片；
[0106](2)将封片后的切片置于杂交仪中设置杂交程序:83°C变性5min，37°C杂交过夜；
[0107](3)取出过夜杂交的玻片，小心撕去橡皮胶并轻轻取下盖破片，将玻片浸入预热至65 0C 的洗涤液中(0.3% NP40，0.4 X SSC)洗涤 5min ；
[0108](4)取出玻片，浸入室温的漂洗液(0.1% NP40，2 X SSC)中洗涤2?3min;
[0109](5)取出玻片后浸入70%酒精中洗涤2?3min，取出后室温晾干;荧光显微镜下观察肺腺癌FFPE组织样本的实验结果，分析信号强度及背景如图5所示。
[0110]将实施例3中采用本发明所述用于荧光原位杂交FFPE组织切片预处理方法获得的实验结果(图4)与对比例2中采用传统的预处理方法获得的实验结果(图5)进行比较，可以看出:采用本发明所述用于荧光原位杂交FFPE组织切片预处理方法处理后的乳腺癌FFPE组织样本，其组织的自发荧光和背景更低，信号点清晰、信号判读更容易。
[0111]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
【主权项】
1.一种用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理液，其特征在于，包括预处理液I和预处理液II。2.根据权利要求1所述的用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理液，其特征在于，所述预处理液I为乳化剂溶液，所述乳化剂为烷基酚聚氧乙烯醚和/或乙基苯基聚乙二醇。3.根据权利要求1所述的用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理液，其特征在于，所述预处理液II的组分包括乳化剂，所述乳化剂为烷基酚聚氧乙烯醚和/或乙基苯基聚乙二醇。4.根据权利要求1所述的用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理液，其特征在于，预处理液I和预处理液II中乳化剂的质量浓度均为0.1?10%。5.根据权利要求3所述的用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理液，其特征在于，所述预处理液II的组分还包括其他组分，所述其他组分为乙二胺四乙酸和/或柠檬酸缓冲液。6.根据权利要求5所述的用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理液，其特征在于，所述乙二胺四乙酸在预处理液II中的浓度为10?lOOmM，所述柠檬酸缓冲液在预处理液II中的浓度为5?I OOmM，pH值4.8?6.2。7.权利要求1?6任一所述的预处理液用于荧光原位杂交FFPE组织切片的预处理方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)烤片:将组织切片放置在650C的烤片机上烤片3~5min; (2)预处理液I处理:将组织切片浸入预热至68°C的预处理剂I中5min; (3)预处理液II处理:取出预处理液I中的组织切片，在吸水纸上沥干残余的预处理液I，再将组织切片浸入预热至72°C的预处理液II中lOmin，每隔2?3min上下震荡玻片一次； (4)将组织切片浸入到预热至68°C的去离子水中洗涤30s; (5)取出组织切片并浸入现配的预热至37°C的胃蛋白酶工作液中，消化5?15min; (6)完成消化后将组织切片浸入2X SSC溶液中Imin; (7)重复步骤(6)，然后取出组织切片依次通过体积浓度为70%、85%、100%酒精各211^11梯度脱水； (8)取出组织切片后自然晾干，用于后续荧光原位杂交实验。8.根据权利要求7所述的预处理方法，其特征在于，所述胃蛋白酶工作液的组分包括:2wt%胃蛋白酶，0.02M HCL，所述胃蛋白酶的酶活为3500U/mg。9.根据权利要求7所述的预处理方法，其特征在于，所述2X SSC溶液的pH为6.8?7.2。
【文档编号】C12Q1/68GK105861659SQ201610226528
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】晏星, 李雪梅, 叶伦, 程弘夏, 陈刚
【申请人】武汉康录生物技术有限公司