检测嗜麦芽窄食单胞菌的试剂盒、引物和方法

检测嗜麦芽窄食单胞菌的试剂盒、引物和方法
【专利摘要】本发明提供了一种实时荧光环介导恒温扩增法检测嗜麦芽窄食单胞菌的试剂盒、引物以及方法，所述检测试剂盒包括有序列组成为SEQID NO.1和SEQID NO.2的内引物，序列组成为SEQID NO.3和SEQID NO.4的外引物，序列组成为SEQID NO.5和SEQID NO.6的环引物。本发明所述的试剂盒和检测方法特异性强，与非目标菌不存在交叉反应；灵敏度高，可达4.07×10^(?5)ng/μL；重复性好，阳性样品三个重复管都几乎同时出峰，实验结果稳定可靠。
【专利说明】
检测嗜麦芽窄食单胞菌的试剂盒、引物和方法
技术领域
[0001] 本发明设及微生物的检测方法，特别是设及检测嗜麦芽窄食单胞菌的试剂盒、引 物和方法。
【背景技术】
[0002] 嗜麦芽窄食单胞菌广泛存在于自然界和医院环境，是一种的非发酵需氧的无芽抱 革兰阴性杆菌，在临床微生物实验室中仅次于铜绿假单胞菌和不动杆菌属，已成为目前重 要的机会致病菌。该菌可W引起呼吸道感染、慢阻肺的急性加重、菌血症、胆汁脈毒症、骨和 关节感染、泌尿道感染、软组织感染、眼内炎、眼部感染（角膜炎、巩膜炎和泪囊炎）、屯、内膜 炎和脑膜炎，并能推动某些癌症的发生发展，如阻塞性肺癌。嗜麦芽窄食单胞菌的感染率正 在逐年上升，好发于免疫力低下的人群，其死亡率高达69%，建立一种简单、快速、经济的方 法检测嗜麦芽窄食单胞菌，对于解决嗜麦芽窄食单胞菌快速诊断的问题具有重大意义。
[0003] 2000年，日本学者Notomi等提出一种全新的核酸扩增技术--环介导等溫扩增 技术(Xoop-mediated isothermal amplif ication，LAMP)，该技术特异性强、灵敏度高、检 测成本低和操作步骤简单，已广泛应用于多种病原体的快速检测。国内有报道该方法检测 嗜麦芽窄食单胞菌耐药基因的应用，但是利用实时巧光环介导等溫扩增技术(Real-Time fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification,RealAmp)检测嗜麦芽窄食单 胞菌在国内尚未开展，而且在临床研究中尚未发现同类的研究。因此本研究拟建立嗜麦芽 窄食单胞菌RealAmp检测的方法，将实时巧光的敏感性和LAMP的快速性有机的结合，初步探 讨其在临床应用中的可行性，为临床提供一种简单、快速的嗜麦芽窄食单胞菌的检测方法。

【发明内容】

[0004] 基于此，本发明的目的之一是提供一种实时巧光环介导恒溫扩增法检测嗜麦芽窄 食单胞菌的试剂盒。
[0005] 实现上述目的的方案如下：
[0006] -种实时巧光环介导恒溫扩增法检测嗜麦芽窄食单胞菌的试剂盒，包括有序列组 成为SEQID NO. 1和SEQID NO. 2的内引物，序列组成为沈QID NO. 3和沈QID NO.4的外引物， 序列组成为沈QID NO.5和沈QID NO.6的环引物。
[0007] 在其中一个实施例中，还包括有巧光染料SYT0-9。
[000引本发明的另一个目的是提供一种检测嗜麦芽窄食单胞菌的引物。
[0009] 实现上述目的的技术方案如下：
[0010] 一种检测嗜麦芽窄食单胞菌的引物，包括有序列组成为SEQID NO. 1和SEQID NO.2 的内引物，序列组成为SEQID NO.3和SEQID NO.4的外引物，序列组成为SEQID NO.5和SEQID NO. 6的环引物。
[0011] 本发明的另一个目的是提供一种检测嗜麦芽窄食单胞菌的方法。
[0012] 实现上述目的的技术方案如下：
[0013] 采用权利要求1-2任一项所述的试剂盒，包括W下步骤：
[0014] 1)提取待检测样品的基因组；
[0015] 2)加待检测样品、所述内引物、外引物、和环引物，W及加巧光染料后构成反应体 系，进行环介导恒溫扩增；
[0016] 3)检测扩增产物。
[0017] 在其中一个实施例中，SEQID NO. 1、SEQID NO. 2、沈QID NO. 3、SEQID NO. 4、SEQID N0.5、SEQID N0.6的浓度比为8:8:1:1:4:4。
[001 引 在其中一个实施例中，SEQID NO. 1、SEQID NO. 2、沈QID NO. 3、SEQID NO. 4、SEQID N0.5、SEQID ^.6在反应体系中的浓度分别为1.6皿01/1、1.6皿01/1、0.2皿01/1、0.2皿01/ 1、0.8皿01/1^、0.8皿01/1^。
[0019] 本发明具有W下优点：本发明将实时巧光技术和恒溫扩增技术相结合，具有高度 特异性、简便、快速等优点。本发明建立的实时巧光环介导恒溫扩增检测嗜麦芽窄食单胞菌 方法，设计了6条引物，能特异性地识别嗜麦芽窄食单胞菌16S ribosomal RNA基因，在恒溫 反应25min左右便可出峰，与传统PCR方法相比大大缩短了反应时间。
[0020] 本发明选取的11个其它常见病原菌和嗜麦芽窄食单胞菌的DNA同时在RealAmp检 测系统中扩增，仅有嗜麦芽窄食单胞菌出现阳性结果，说明该检验方法的特异性良好。其特 异性主要依赖于根据6个区域设计的6条引物，要使祀序列得到大量的扩增，特异性引物必 须与6个区域严格配对，即使在仅相差一个核巧酸的基因标本中，特异性引物也能找出相应 祀序列，并进行扩增，因此LAMP不易受到非祀序列DNA的影响。而且，本发明的检测灵敏度可 达到 4.07Xl(T(-5)ngAiL。
[0021] 本发明引入新型巧光染料，并对扩增系统进行实时动态监测，能直观地反映整个 扩增过程的动态变化。传统LAMP的检测方法有：肉眼观察法和添加巧光染料法。肉眼观察法 主要通过肉眼观察反应浊度的变化，存在弱阳性结果难W判断的缺点。而添加巧光染料法 的主要缺点在于反应结束后的开盖会导致产物的气溶胶污染。
[0022] 综上所述，本发明采用的RealAmp检测嗜麦芽窄食单胞菌方法具有反应速度快，特 异性强，灵敏度高，方便快捷，能够直观地观察实验结果等优点，为嗜麦芽窄食单胞菌的检 测提供了新的方法，有可能成为临床常规的检测方法。
【附图说明】
[0023] 图1为实施例1中引物筛选实验引物1的扩增结果；
[0024] 图2为实施例1中引物筛选实验引物2的扩增结果；
[0025] 图3为实施例1中引物筛选实验引物3的扩增结果；
[0026] 图4为实施例1中引物筛选实验引物4的扩增结果；
[0027] 图5为实施例2中嗜麦芽窄食单胞菌特异性检测实验结果示意图；
[0028] 图6为实施例3中嗜麦芽窄食单胞菌灵敏度检测实验结果示意图；
[0029] 图7为实施例4中嗜麦芽窄食单胞菌重复性检测实验结果示意图。
【具体实施方式】
[0030] 本发明针对嗜麦芽窄食单胞菌16S ribosomal RNA基因的6个区域设计6条特异性 引物，利用链置换DNA聚合酶恒溫反应60min，通过实时检测巧光信号来检测嗜麦芽窄食单 胞菌16S ribosomal RNA基因的扩增。
[0031] 应理解，运些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室 手册（New York = Cold Spring 化rbor LaboratoiT Press, 1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0032] 菌株来源：W下实施例中所用到的菌株由广州医科大学附属第S医院检验科微生 物室分离、V口邸2全自动微生物鉴定仪鉴定并于-70°C保存。
[0033] 实验用菌株如下：嗜麦芽窄食单胞菌、白色念珠菌、化脈性链球菌、肺炎克雷伯杆 菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、马尔 尼非青霉菌、克柔念珠菌。
[0034] 实施例1
[0035] 根据嗜麦芽窄食单胞菌16S ribosomal RNA基因序列，设计四套引物：引物1、引物 2、引物3、引物4。引物序列由英潍捷基上海贸易有限公司合成(见表1、表2、表3、表4)。
[0040]表3:嗜麦芽窄食单胞菌RealAmp检测体系引物3
[0036] 表1:嗜麦芽窄食单胞菌RealAmp检测体系引物1 [00371
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[0045] 引物筛选W及环引物增强反应速度的验证：
[0046] 四套引物分别配制工作液加环引物工作液Sl和不加环引物工作液S2。W提取的嗜 麦芽窄食单胞菌DNA为模板，按照DNA扩增试剂盒求说明书的要求进行加样和设置反应条 件，比较四套引物的扩增效率，选择效率高的引物进行后续的实验操作。
[0047] 引物筛选实验：
[004引图1、图2、图3、图4分别是引物1、引物2、引物3、引物4的扩增结果。从图1和图3的结 果可看出，引物1和引物3的体系在60min内没有出峰;从图2和图4看出，在反应开始后28min 左右引物2的体系出峰，在反应25min左右引物4的体系出峰，迪澳恒溫巧光检测仪Deaou-308C检测到嗜麦芽窄食单胞菌16S r化osomal RNA基因的扩增信号。比较图2和图4可W看 出，引物4出峰相对较早，而且出峰后在38min前，加入引物4的反应体系巧光强度相对比加 入引物2的巧光强度强。此外，从阴性对照扩增曲线可看出未出现假阳性，由此可W得出结 论:在38min前，引物4对嗜麦芽窄食单胞菌16S ribosomal RNA基因的扩增效率较高。选择 引物4进行后续试验。不加环引物试验证明，不加环的引物不出峰，说明加入环引物后可W 加快反应的速度。
[0049] 本实施例选择的巧光染料为SYT0-9。
[0050] 该检测试剂盒中还包括链置换DNA聚合酶，常规PCR反应液等。
[0化1] 实施例2
[0052]本发明采用环介导恒溫扩增技术扩增嗜麦芽窄食单胞菌16S ribosomal RNA基 因，实时巧光检测结果，巧光染料在反应前加入，避免反应后开盖加染料引起气溶胶污染造 成假阳性。
[0053] 具体操作步骤如下：
[0054] 1)分别将实施例1中所述的FIP、BIP、F3、B3、LF、LB按照8:8:1:1:4:4浓度比混合配 制成引物工作液，使上述引物加入25化体系后浓度分别达到1.6皿o1/L、1.6mio1/L、0.^ mol/L、0.2]imol/L、0.8]imol/L、0. Sumol/L。
[0化5] 亲5Amn的后欣化累
[0化6]
[0057] 2)利用步骤1)中配好的引物工作液，按照表5配制LAMP反应体系，并加入20iU密封 液。反应过程在恒溫巧光检测仪Deaou-308C(购自广州迪澳生物科技有限公司）中进行，反 应溫度为63°C，反应时间为60min(为了防止出现非特异性扩增，引物筛选实验和特异性实 验的反应时间可调整为90min)。
[0058] 3)从仪器导出数据后，作归一化处理，使曲线经过4min时的最低点，但不改变曲线 形状和趋势，再用GraphPad Prism 5软件制作曲线图。每次试验均设置d地2〇为阴性对照。
[0059] 4)反应结束后，观察扩增曲线，若出峰，则为阳性。
[0060] 实施例3
[0061] 分别提取嗜麦芽窄食单胞菌及其他常见病原菌（白色念珠菌、化脈性链球菌、肺炎 克雷伯杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念 珠菌、马尔尼非青霉菌、克柔念珠菌）的基因组DNA，根据实施例1表4中的引物（SEQ ID NO. I-SEQ ID NO.6)构成的试剂盒，按照实施例2中的反应条件进行扩增，分析检测信号，评 价该引物的特异性。
[0062] 由图5看出，本实验选取的其它常见病原菌均未出现扩增，只有嗜麦芽窄食单胞菌 发生特异性扩增并被检测出来，说明设计引物对嗜麦芽窄食单胞菌检测的特异性好，与非 目标菌不存在交叉反应。
[0063] 实施例4
[0064] 根据实施例1表4中的引物（SEQ ID NO. I-SEQ ID NO.6)构成的试剂盒，按照实施 例2的检测方法，测定嗜麦芽窄食单胞菌的DNA液浓度，先用化L TE液对化ermo Scientific Nano化OP 2000微量分光光度计调0,再加化L嗜麦芽窄食单胞菌的DNA提取液，测量DNA模板 浓度。取化L DNA原液用超纯水进行10倍梯度稀释8次，得到9个不同浓度的DNA模板，加入 RealAmp体系中反应，观察扩增曲线（图6)，检测引物对嗜麦芽窄食单胞菌的检测灵敏度。
[0065] 嗜麦芽窄食单胞菌的DNA浓度测量结果为40.7ngAiL，浓度较高，贝化次10倍梯度稀 释后的浓度为 4.07ngAiL，4.07Xl(T(-l)ng/U，4.07Xl(r(-2)ng/iiL，4.07Xl(r(-3)ngAi L，4.07X10-(-4)ngAiL，4.07X10 -(-5)ngAiL，4.07X10-(-6)ngAiL，4.07X10 -(-7)ng/y L。由图6看出，本实验的检测灵敏度可达到4.07Xl(T(-5)ngAiL。
[0066] 实施例5
[0067] 根据实施例1表4中的引物（SEQ ID NO. I-SEQ ID NO.6)构成的试剂盒，按照实施 例2的检测方法，用RealAmp对1份嗜麦芽窄食单胞菌阳性菌株进行3次重复实验，所有菌株 重复性实验所用模板为同一份模板。从图7结果看，阳性样品的=个重复管都几乎同时出 峰，扩增曲线几乎重叠，说明RealAmp的重复性良好。
[0068] W上所述实施例的各技术特征可W进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要运些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0069] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种实时荧光环介导恒温扩增法检测嗜麦芽窄食单胞菌的试剂盒，其特征在于，包 括有序列组成为SEQIDN0.1和SEQIDN0.2的内引物，序列组成为SEQIDN0.3和SEQIDN0.4 的外引物，序列组成为SEQIDN0.5和SEQIDN0.6的环引物。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括有荧光染料SYT0-9。3. -种检测嗜麦芽窄食单胞菌的引物，其特征在于，包括有序列组成为SEQID NO. 1和 SEQIDN0.2的内引物，序列组成为SEQIDN0.3和SEQIDN0.4的外引物，序列组成为SEQID N0.5和SEQIDN0.6的环引物。4. 一种检测嗜麦芽窄食单胞菌的方法，其特征在于，采用权利要求1-2任一项所述的试 剂盒，主要包括以下步骤： 1) 提取待检测样品的基因组； 2) 加待检测样品、所述内引物、外引物、和环引物，以及加焚光染料后构成反应体系，进 行环介导恒温扩增； 3) 检测扩增产物。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述SEQID NO. 1、SEQID NO. 2、SEQID N0.3、SEQID N0.4、SEQID N0.5、SEQID N0.6的浓度比为8:8:1:1:4:4。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述SEQID NO. 1、SEQID NO. 2、SEQID N0.3、SEQID N0.4、SEQID N0.5、SEQID 勵.6在反应体系中的浓度分别为1.6以111〇1/1、1.64 mol/L、0·2ymol/L、0·2ymol/L、0·8ymol/L、0·8ymol/L〇
【文档编号】C12Q1/68GK105861660SQ201610231539
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】郭旭光, 黄美淦, 刘庆锋, 何淑君, 吴健健
【申请人】广州医科大学附属第三医院