专利名称：一种原位中途补加试剂的聚合酶链式反应方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及聚合酶链式反应方法。
背景技术：
聚合酶链式反应是一种体外扩增特定DNA的方法，經过25-35循环的擴增目标基因被放大100万至1亿倍，反應液的引物和四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)的克分子濃度至少需要是原始模板的100万至1亿倍。显然，反應之初如此高饱和度的试剂不利于扩增的严谨性，而反应初期扩增的严谨性对扩增成功和形成专一擴增产物至关重要。反之，大幅度降低试剂的浓度雖有益于增强反應初期的严谨性，但必然造成反應过早进入饱和期使扩增产物达不到检测的所需要的數量。在中途补加试剂是解決之道，但中途开启反應管管盖添加試劑既麻烦又容易造成滞后污染，使中途添加試劑的方法難以實施。同様，崁套式PCR有許多優點，但需中途添加內套引物帶来諸多不便也容易造成滯後污染。十几年来虽然PCR新技术层出不穷但一次性配制反应试剂的常规至今没有突破。本发明提供了一种简单、有效的在闭管和原位条件下中途补加试剂的方法，使扩增的专一性得到显著的、意想不到的改进，也使PCR技術有更多機會創造更簡便的檢測方法和更應泛的應用。
发明内容
所要解决的技术问题发明提供了一种简单、有效的在中途闭管和原位条件下补加试剂的方法，从而克服了现行PCR技术需一次制备配齐试剂，反应前期相对饱和度太高影响扩增专一性等的缺陷。
发明构思大多数PCR扩增产物的解链温度在80-90℃之间，G+C％较低、硷基排列合适、长度又较短的扩增产物的解链温度甚至低达70℃左右，因而完成PCR扩增的最低允许变性温度范围為70-90℃，扩增的变性温度不必局限于现行的94℃左右。另一方面Taq等耐热性DNA聚合酶能耐受短时间98℃以上的高温，若将扩增的一个循环或若干循环的变性温度提高至98℃並不会導致酶的嚴重失活而影响扩增。所以，针对一个既定的扩增产物PCR循环的变性温度有相当大的伸缩变化空间。如果預先將需要添加的一種或幾種試劑用一種不溶于水、化学反应惰性、比重小于水、融点在上述温度范围内的固体包埋起来覆蓋在反應液上，或者在PCR反應液上先加上這種已融化的固体，待凝固後再覆蓋需要添加的試劑與底層的反應液阻隔分開。控制PCR变性温度高于擴增產物的解鏈溫度而低于所說的固体的融化温度就能使试剂保持与反应液隔開。需要时只要提高反应的變性温度至高于所說的固体的融化温度，固体融化後原来被隔開的试剂就释放到反应液中参与反应。本發明首選融点80-97℃、融化溫度區間2-5度的純的正烷TING或各種規格的微晶和合成石蜡混合物，也可使用具有類似特性、符合要求的其他化合物。
技术方案PCR反应液包括缓冲液、镁离子、模板核酸、dNTPs、DNA聚合酶和引物等。PCR反应步骤依次包括(1)DNA模板变性解链；(2)引物与模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；
(4)按步骤(1)-(3)循环进行合成反应；需要中途添加的試剂可預先用石蜡等包埋然後置于反應液上，或製備反應液後將已融化的石蜡迅速置于反應液上，凝固後再在石蜡上加需要在反應中途添加的試剂。添加试剂包括dNTPs、DNA聚合酶、引物、崁套PCR的內套引物、促进PCR反应的添加剂或其他需要在反應中途添加的試剂。添加的试剂可以是一种或同時添加几种。添加的試劑也可以是在PCR反應完成後的检测用或其他用途的试剂，如双链DNA专一的SYBR录I荧光检测试剂。控制添加试剂的濃度和体积使试剂释放到反应液后的终浓度达到預期的濃度。PCR反應開始控制首次變性溫度和隨後的5-25循环的循環的變性溫度高于擴增產物的解链溫度，但低于包埋或阻隔剂開始融化的溫度。優選变性温度比扩增产物的解链温度高2℃以上，比包埋或阻隔剂融化温度下限低2℃以上。需要釋放試剂時控制該循環的變性溫度高于包埋或阻隔剂完全融化的溫度但低于99℃。優選变性温度比包埋或阻隔剂融化温度上限高2℃以上。添加試剂釋放到反應液之後的5-25個循環立即回復到原來的低變性溫度、保持若干循環高溫變性後再回復到原来的低變性溫度或繼續保持較高變性溫度直至反應結束。包埋或阻隔剂优选融点温度符合要求的微晶石蜡或合成石蜡。
有益效果1，實現了閉管、原位中途添加試劑，既方便又消除了滯後污染問題。
2，可大幅度降低PCR反应起始液的试剂浓度、增强反应严谨性。
3，可大幅度提高PCR反应后期反应液的试剂浓度、增强扩增产物形成。
4，应用于嵌套式PCR使引物设计和扩增程序设定简化、操作方便。
5，PCR反應結束後添加检测試劑可直接荧光檢測。
6，PCR反應結束後反應液上覆蓋有固體介質減少開管時氣流震蕩、擴散導致的滯後污染。
具体实施实施例1实施例1目标基因为人beta-肾上腺素受体基因(美国国家生物信息中心基因库编号M15169)。引物采用文献报导(Xie，H.G和WAJ等Clin.Pharmacol.Ther，2000，67(6)，670-5，其顺序和特性示于表1。正反引物在同一外显子内，以基因组DNA为原始模板时扩增产物长252碱基，扩增产物解链温度90.1℃。试验采用ClonTech公司的Advantage2-PCR试剂盒，DNA浓度1ug/100ul，引物浓度0.4uM，每管反应体积50微升。
表1，引物顺序和特性
PCR初次变性92℃1分钟，循环变性92℃30秒，退火50-68℃30秒，延伸68℃30秒。共35循环。结果示于表2。
表2，使用标准浓度dNTPs时的扩增结果
结果说明当退火温度为55-67℃时能得到目标扩增产物但均有大量非专一扩增产物形成，退火温度大于68℃时没有非专一扩增产物但也没有目标扩增产物形成。
实施例2实施例2目标基因和试剂等与实施例1相同，但反应液dNTPs浓度2nM是实施例1所用常规浓度的百分至一。在反應液上加50-100ul融点为94-96℃的石蜡，凝固後在石蠟上加5微升2mM的dNTPs。PCR初次变性，循环变性和延伸条件也与实施例1相同，但退火65℃1分钟。进行不同循环后，将变性温度提高到98℃维持2分钟，再按上述条件继续循环，对照组dNTPs浓度为常规的0.2mM，包埋颗粒内含5微升水。表3显示扩增结果。
表3，不同循环时提高變性温度融化石蜡的扩增结果
结果说明反应液初始dNTPs浓度低，在10-20循环时添加dNTPs均得到目标扩增产物而没有非专一产物形成。
实施例3实施例3的方法与实施例2相同，反应液的初始dNTPs浓度0.1-200uM，在反应10循环后提高变性温度融化石蜡。试验结果示于表4。
表4，不同起始浓度dNTPs的扩增结果
结果说明试验组初始dNTPs浓度为0.1-10uM，即常规浓度的二十分之一至二千分之一时均得到目标基因扩增产物而没有非专一扩增形成。
实施例4实施例4目标基因为人beta肌动球蛋白(美国国家生物信息中心基因库编BC016045)，引物顺序和特性示于表。
表5，实施例4引物顺序和特性
以cDNA为模板外套和内套扩增产物长分别为352和290硷基，扩增产物解链温度分别为82.9和82.0℃。反应试剂和浓度与实施例2相同，dNTPs浓度为常规浓度0.2mM。所用石蠟融点為87-90℃。反应PCR初次变性85℃1分钟，反应前15个循环变性85℃30秒，退火64℃30秒，延伸72℃30秒，然后将变性温度提高到94℃维持2分钟使内套引物进入反应液，后15个循环变性85℃30秒，退火和延伸72℃1分钟。反应结束电泳分离荧光染色显示专一的290硷基条带。
实施例5实施例5目标基因、引物和反應程序均与实施例4相同。反应结束達室溫或4℃後開啟反應管在管壁加反應液十分之一體積、濃度為200倍稀釋的SYBR熒光錄I試劑，再放在基因扩增仪上将试管加热至94℃，冷卻後取出反應管在紫外光下观察到强烈荧光示陽性反應。負對照反應管不加様品DNA，反应结束后同様測定紫外光下未見熒光。
实施例6实施例6的目标基因为人第六染色体中一个基因片段。(美国国家生物信息中心基因库编号GI29801752)。引物顺序和特性示于表6表6，实施例6引物顺序和特性
扩增产物长131碱基，扩增产物解链温度70.7℃。反应试剂与实施例2相同。反应液dNTPs浓度0.02uM為常規用量的十分之一。引物浓度为0.05uM也常规用量的十分之一。預先將5微升含2uMdNTPs和5uM引物的補加液包埋在融点为80-85℃的石蜡置于反應液上。初次变性75℃1分钟，循环变75℃30秒，退火60℃30秒，延伸68℃30秒。反应10个循环后提高变性温度至90℃维持一分钟。然后恢复原先程序至35循环。反应结束后取样电泳分离荧光染色显示专一的131硷基条带。
权利要求
1，一种以基因组DNA或cDNA为模板的聚合酶链式反应，至少一种完成扩增反应或完成扩增产物检测所需的试剂置于反应液管内但被固体包埋或阻隔，不与反应液接触。反应依次包括如下步骤(1)DNA模板变性解链；(2)引物与模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；其特征在于在反应中途或结束在不开管盖和不移动反应管的前提下使所說的被固体包埋或阻隔的试剂与反应液接触完成扩增反应或完成扩增产物检测。
2，根据权利要求1所述的聚合酶链式反应所說的包埋或阻隔试剂的固体是不溶于水、化學反应惰性、比重小于水、融点80-97℃的化合物
3，根据权利要求1至2所述的聚合酶链式反应所說的包埋或阻隔试剂的固体是融点80-97℃的微晶石蜡和合成石蜡。
4，根据权利要求1至3所述的聚合酶链式反应前5-25循环的变性温度低于所说的固体的融点，反应后5-25循环的变性温度高于所说的固体的融点。
5，根据权利要求1至3所述的聚合酶链式反应的变性温度低于所说的固体的融点，反应中途有1-5个循环变性温度高于所说的固体的融点。
6，根据权利要求1至3所述的聚合酶链式反应的变性温度低于所说的固体的融点，反应结束时加热至高于所说的固体的融点。
7，根据权利要求1至5所述的聚合酶链式反应所说的中途添加的试剂是反应所需的至少四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)中的一种。
8，根据权利要求1至5所述的聚合酶链式反应所说的中途添加的试剂是反应所需的至少一个引物。
9，根据权利要求1至5和8所述的聚合酶链式反应所说的中途添加的试剂是嵌套式PCR反应的内套引物。
10，根据权利要求1至5所述的聚合酶链式反应所说的中途添加的试剂是反应所需的DNA聚合酶。
11，根据权利要求1至3和6所述的聚合酶链式反应所说的在反應結束添加的试剂是核酸荧光试剂，优选双链DNA专一荧光试剂特别是SYBR录I。
全文摘要
一种将扩增所需试剂成份的一部份用高融点微晶石蜡或有类似特性的固体包埋或阻隔的聚合酶链式反应方法。PCR前阶段变性温度低于石蜡的融点，被包埋或阻隔的试剂不参与反应，反应中途一个循环或反应后期的变性温度高于石蜡的融点，被包埋或阻隔的试剂释放到反应液中参与反应。中途释放试剂可减少反应前期试剂浓度提高反应的严谨性，又可提高反应后期试剂浓度增强扩增，将荧光检测试剂预加在管內在反应结束释放则可完成终点闭管检测。
文档编号C12Q1/68GK1804036SQ200510023299
公开日2006年7月19日 申请日期2005年1月13日 优先权日2005年1月13日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯, 陈有容 申请人:徐定邦, 徐文慧