专利名称：鉴定党参品种的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、基因组学、生物技术以及中药鉴定领域。
背景技术：
根据中国药典(2000年版)党参为桔梗科植物党参Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.，川党参Codonopsis tangshen Oliv.和素花党参Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen的干燥根。其性味甘平、无毒，有补中益气，健脾益肺功效。主治脾肺虚弱，气短心悸，食少便溏，虚喘咳嗽，内热消渴等症，是我国传统的补益药。但在市场上也常见到管花党参Codonopsis tubelosa Kom.，新疆党参Codonopsis clematidea(Schyenk)C.B.Cl.，灰毛党参Codonopsiscanescens Nannf.和球花党参Codonopsis subglobosa W.W.Sm作为党参代用品及同科植物金钱豹Campanumoea javanica Blume ssp.japonica(Makino)Hong和桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.作为伪品被出售。在香港，党参通常是以商品名板党、防党和纹党出售。但来源、规格不同，价格差别很大，以劣充优常见。另外，一种外表涂有红色物质的党参首次被发现在香港市场上，商家用其为止泄目的。为安全用药，我们通过5S rDNA基因测序技术及配合形态学、组织学、HPLC-UV、以及X-Ray衍射技术，对药材本身及外表物质进行了深入、详细研究。结果发现，这种红色党参其植物来源为素花党参。由于地理环境，种植方法，生长状况及加工工艺等方面的变化对党参药材自身的品质、药物中间体及中成药的质量带来了很大影响。党参药材传统的鉴别方法主要以形态、显微为主。化学方面至今没有人发现一个可以用来作为鉴定标记的化合物。据现有资料显示，党参目前多采用对照药材作为对照进行鉴定，至今未得到适当的对照品。
如何快速、准确鉴定党参来源及各种规格、真伪和品质，从党参产品中探测目标党参成份的存在，对党参市场实行切实有效的质量监控和品质评价是中药现代化的重要课题之一。开发分子技术监控中药质量虽然刚刚起步，但已展示出它的广阔应用前景。在大多数真核生物中，核糖体5S rDNA基因是串联重复的多拷贝基因，它们独立存在，并不与主体RNA(18S-5.8S-28S rDNA)相连，在生物体内含量丰富，广泛分布，被称为生物体内的活化石。在高等植物中，5S rDNA基因的每个重复单位由转录区和转录间隔区(Non transcribed spacer，NTS)组成，转录区高度保守，而转录间隔区有较大变异，这种高度保守性与变异性的统一，使得5S rDNA基因序列成为研究真核生物中多拷贝基因的分子形成和演化的有用标记。本发明正是利用5S rDNA序列的差异鉴定党参品种或辨别其真伪。为有效控制原料来源及生产过程中的不稳定因素，从基因组学着手，以鉴定党参品种药材的来源、真伪、优劣及更好地控制中成药的产品质量，从而为制药行业提供科学合理的指导，提高药品的安全有效性。
发明内容
A提供党参药材的5S rDNA序列。
B利用5S rDNA序列鉴定石斛的品种及辨别真伪的方法。
为达到本发明的目的，发明人从全国不同省份收集了25份样品，包括7个市场常见党参品种、3个商品党参、3个特别商品党参和2个伪品品种。所有样品均经过专家鉴定。所测得的25个样品的5SrDNA序列如下A.党参7个种共计17个样品
(1)党参 Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.样品(编号CMED-0038-04)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCCGTCAACTCCC CTCCTCTTTA TTCTTTGTAC TATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAACCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACGCTGAGTAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(2)党参 Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.样品(编号CMED-0038-05)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCCGTCAAGTCCC CTCCTCTTTA TTGTTTGTAC TATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCACAC GCGCCCAAAACCGAGCAAAA TGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACGCTGAGTAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(3)党参 Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.样品(编号CMED-0038-08)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATCCACCCGTCAACTCCC CTCCTCTTTA TTCTTGGTAC TATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTAT GACTGCTGAC GCGCCCAAAAGCGAGCAAAA CGTGCTTTTC GCGCTCTTAA TTATTGTACGGTGAGCAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(4)党参 Codonopsis pilsula(Franch.)Nannf.样品(编号CMED-0038-12)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCAG GGAAGTGCTG GTATGCACCGGTCAAGTCCC CTCCTCTTTA TTCTTTGTAA CATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAACCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTGT TTAATGCGCG
CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(5)素花党参 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-0093-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT ACTCAGCGTA CATTAAGAAACCATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCGTGAGCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA GAGATAGTACAAAAGAATAA AGAGGAGGGA AGTTGACGGG(6)素花党参 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-0093-03)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCAGCCCCCTTTTGC TCTTTTTTTT AATCAGCGTA CATTAACAAACCATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT ACGCGCGTCAGCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA CACATAGTACAAAAGAATAA AGAGGTGGGA AGTTGACGGG(7)素花党参 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-0093-04)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTT TACTCAGCCT ACTTTAAGAAACCATATAAA AGAAAGAAAA TCCTCGGTTT TGGGCGCGTGAGCAGTCAA AACGACCTTC TCGCGCTCTT TAGAGATAGTTCAAAAGAAT AAAGAGGAGG GAAGTTGACG GG(8)素花党参 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-0093-05)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TATTTTTTTT ACTCTGCCTA CATTAAGAAACGATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGAGTCA
GCAGTCAAAA GGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATTGTACAAAAGAATAA AGCGGAGGGA AGTTGACGGG(9)川党参 Codonopsis tanghshen Oliv.样品(编号CMED-0101-01)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTCAACTCCCCCCCCTTTTG CTGTTTTGTT TTACTCAGCG TACATTAAGAAACCATATAA ACTGCTCACG CGCTCAAAAC CGGGCATTTTCTTTCTCATA AACGACCTTC TAGTACGCTC TTTAGAGATAGTACAAAAGA ATAAAGAGGA GGGAAGTTGA CGGG(10)川党参 Codonopsis tangshen Oliv.样品(编号CMED-0101-02)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAACCCCTC GTCAAGTCCCCCCCCTTTTG GTGTTTTGTT TTACTCACCG TACATTAAGAAACCTTATAA AGTGCTCACG CGGTCAAAAC CGGCCATTTTCTTTCTCAAA AACGACCTTC TAGTACGGGC TTTAGAGATACTACAAAAGA ATAAAGAGCA GGGAAGTTGA CGGG(11)川党参 Codonopsis tangshen Oliv.样品(编号CMED-0101-05)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGGCCCCCTG GCAAGTCCTC GTCAAGTCCCCCCCCTTTTG GTGTTTTGTT TTTCTCAGCG TACGTTAAGAAACCATATAA AGGGCTCACG CGGTCAAAAC CGGGCGTTTTCTTTCTAATA AACTGCCTTC TAGTAGGCTC TTTAGACATAGTAGAAAAGA ATAAAGAGCA GGGAAGTTGA CGGG(12)管花党参 Codonopsis tubelosa Kom.样品(编号CMED-0102-01)5S rDNA序列CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCGA GCATTTTTCTTTCTTTTATA CTGGTTTCTT AATGTACGGT GAGTAAAAAA
ACAGCAAAAG GGGGGGTGCA ACACGAGGTT CCCAGGGGGTCACCCATCCT AATACTACTC TCGCCCTCAT TTGAGTTCGTACAAAACGAC CATATGGGAG AGGAGTTGAC GGG(13)管花党参 Codonopsis tubelosa Kom.样品(编号CMED-0102-02)5S rDNA序列CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCTA GCATGTTTCTTTCTTTTATA CTGTTTTCTT ACTGTACGGT GACTAAAAAAACAGCTAAAG GGGGGGTGCT ACACGAGGTC GCCAGGGGGACACGCATCCT AATACGACTC TCTCCCTCAT TTTAGTTCGTACAAAACTAC AAAAAGGGAG AGAAGTTGAC GGG(14)新疆党参 Codonopsis clematidea(Schyenk)C.B.Cl.样品(编号CMED-0109-01)5S rDNA序列CTAGGATGGT CGACCATATG GGAAAGCTTC GCGTTTTTCTCCCTTTTTGA GTTTTTTTTA GTGTCACCTA AATAAGGAAACCATTAAAAG AAAGAAACTA CACGAGGTTT TGGGGCCGTTATCCGCTCAC AAACTATTCT GGCATTCGTT TGGGATAGCATAAAAGACTA AAGCCGGGGG GAGTTGACGG G(15)灰毛党参 Codonopsis canescens Nannf.样品(编号CMED-0110-01)5S rDNA序列CTAGGACGCG GGAATTCGAG AAGAGTGCTG GTATGATCGCACCCGCTGTT TTTTTTCCTC TTTATTCTTT TGTACTATCTCTAAAGAGCG CGAGAAGGTC CGGTTTTGAC TTCTCACGCGCCCAAAACAA AACGAGCTTT TTGCCTTTCG TTTGAGACGGTATAAAAGTA CGCTGAGGAG GGGAGTTGAC GGG(16)球花党参 Codonopsis subglobosa W.W.Sm样品(编号CMED-0107-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTATGCACCC
GTTAACCCCC CCTTTTTTTG TTTTTTTTAC TATCTCTACGTTAAGAAAAT GCTCGGTTTG ACTGCTCATG GGCGCGTGAGCAGTCAAAAC GACCTTCTCG CGCTCTTTAG AGATATGTACAAAAGAATAA AGAGGAGGGG AGTTGACGGG(17)球花党参 Codonopsis subglobosa W.W.Sm样品(编号CMED-0107-02)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGTCCCCCTG GGAAGACCTC GTATGCACCCCCTAACCCCC CCTTTTTTTG TTTTTTTTAC TATCGCAACGTTAAGAAAAT GCTTCCTTTG ACTGCTGATG GGCGCGTCAGCAATCAAAAC GTCCTTCTCG CGCACTTTAG AGATATGGACAAAAGAATAA AGAGGACGGG TGTTGACGGGB.商品党参3个样品(18)板党 Radix Codonopsis样品(编号CMED-DS-8-DFH)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTTTTA GTCAACTATGCCCGCTTTTG CTGTTTTGTT TTCCTCAGCG TTCTTTAAGAATCCATAAAG ACTGCTCACG GGCTCAAAAC CGGGCATTTTCTTTCCCAAA ACCGAGCTTC TAGTTCGCTC TTTAGAGATAGTACAAAAGA ATAAAGAGGA GGGAAGTTGA CGGG(19)防党Radix Codonopsis样品(编号CMED-DS-9-YH)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAATCTTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT ACTAAACGGA CATTAAGAAGCGAATAAAAG AAAGAAAATG CTCGGTTTTG AGCGCGAGAGCAGTCAAAAA GAACTTCTCG CGGTTGTTTG AGATAGTATAAAAGAATAAA GAGGAGGGAA GTTGACGGG(20)纹党 Radix Codonopsis样品(编号CMED-DS-10-YRS)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGACTCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT ACTCACCGTA CATTAAGAAACCATATAAAA GAAAGAAAAA TGCTCGGTTT TGGGGCCGTGAGCAGTCAAA ACGACCTTCT GGCGCTCGTT TGAGATAGTACAAAAGAATA AAGAGGAGGG GAGTTGACGG GC.特别商品红党参3个样品(21)红党参 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-DS-7-XH)5S rDNA序列CTAGGATGGA TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCCTTTTG GTGTTTTTTT TACTCTGCGT ACATTAAGAAACGATATAAA AGAAAGAAAA TGCTGGGTTT TGGGCGCGTGAGCAGTCAGA ACGACCTTGT CGCGCTCTTT AGAGATAGTACAAAAGAATA AAGAGGAGGG GAGTTGACGG G(22)红党参 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-DS-11-WYT)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCGTC GTGTTGCACCCCCCCTTTTG CTGTTTTTTT TACTGAGCGT ACATTAAGAAACCATGTAAA AGAAAGAAAA TGCTCGGTTT TGGGCCCGTGAGCAGTCAAA ACGACGTTCT CGCGCTCTTT GAGATAGTACAAAAGAATAA AGAGGAGGGG AGTTGACGGG(23)红党参 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-DS-12-YRS)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTACACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT GCTCAGCGTA CATTAAGAAATCATGTAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCCTGAGCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATAGTAC
AAAAGAATAA AGAGGAGGGG AGTTGACGGGD.党参伪品金钱豹和桔梗2个种(24)金钱豹 Campanumoea javanica Blume ssp.japonica(Makino)Hong样品(编号CMED-0108-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG AGACACCCTG GTAAATCTTC GTGTTGCAATTCCCCTTTTG CTGTTTTTTT TACTAAACGG AGGTCTAGAAGCGAATAAAA GAAAGAAAGA ATAACCATTT TTGAGGCTGAGGTAAGGTCT GAAGAACTTC TGAAGGTTGT TTGAGGCCGTATAAAAATGT TCGAACAAGG GGAGTTGACG GG(25)桔梗 Platycodon grandiflorum (Jacq.)A.DC.样品(编号CMED-0111-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCTCCTG GGAAGGCCTC CTGTTGCACCCCCCATTTTT TTTATTTAAT TTTTGATTTA TTTATGTTATCGGTAGGTCG TTTTTTTTGT AGCTGTTGGA ATCATATTGCGTTTTGTGAG TGCGTTTATC CGTAATAATA GGGAGCGTAACGGTAAGGTT TCGGGTGTCG GGTCCGTAAC GGTTGAAACGGGGAATCGTA ATGAGGGAAA ACGGTGGAAT TTCGGTTAAAATGGTAAAAG GATGTTGAAT AAAATGCAAT TTATGGTGAGAGTATATGGG
具体实施例方式上述25样品的5S rDNA序列的测定方法包括下列步骤(1)收集植物样品，进行品种鉴定工作；(2)从步骤(1)选出的植物中提取DNA；(3)以步骤(2)提取的DNA为模板，以寡核苷酸作为聚合酶链式反应(PCR)的引物，扩增5S rDNA区段，所用的引物分别采自植物5SrDNA两端的保守区段；
(4)应用克隆测序技术对步骤(3)中所获得的PCR产物进行测序。
每一个样品至少重复测序3次并样品的序列也在互联网页National Center for Biotechnology Information(NCBI)和EuropeanMolecular Biology Laboratory(EMBL)与其它植物序列作比较和验证以保证本发明的25个序列准确。
上述所测得的同一品种的样品之间在DNA水平的平均差异为6.2％至9.9％，所述的党参种间5S rDNA序列的差异为26％至60％。而党参与大花金钱豹的5S rDNA序列的差异为37％至57％。党参与桔梗的5S rDNA序列的差异为63％至72％。
本发明利用党参类植物内5S rDNA序列的差异进行种内和种间的比较，借此鉴定不同的党参品种并辨别其真伪。所采用的方法包括下列步骤1.从植物样品中提取DNA；2.以步骤1提取的DNA为模板，以寡核苷酸作为聚合酶链式反应(PCR)引物，扩增5S rDNA区段，所用的引物分别采自植物5S rDNA两端的保守区段；3.应用克隆测序技术对步骤2所获得的PCR产物进行测序；4.将步骤3测得的DNA序列与上述的18个党参及大花金钱豹的5S rDNA序列比较以鉴定所测植物的党参品种及辨别真伪。
详细描述所述方法(1)DNA的提取植物的DNA提取方法与Draper和Scott(Draper and Scott，1988)所述大致相同，简述如下将干燥的植物材料用70％乙醇的蒸馏水溶液冲洗，然后，与液氮混合并研磨成粉末。将所得的粉末样品与6倍体积的CTAB提取缓冲液混匀，在56℃水浴中保温30分钟后，加入等量的氯仿-异戊醇(24∶1)混合液抽提，离心，取上清液。向残余物中加入0.1体积的10％CTAB溶液，室温放置10分钟后再用氯仿-异戊醇萃取一次，离心，取上清液并与前次的上清液混合。向所得上清液中加入等量的CTAB沉淀缓冲液产生沉淀，室温放置1小时后以13000g离心15分钟。将DNA沉淀物用乙醇纯化后溶解于TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA)中备用。
(2)PCR扩增反应5S rDNA区段的DNA由PCR扩增反应获得。反应所用的引物为5S2F和5S2R5S2F序列为5’GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA5S2R序列为5’TTA GTG CTG GTA TGA TCG CA反应溶液包括10ng植物DNA，1XTag缓冲溶液(10mMTris-HCl，pH8.3，0.001％明胶)，0.2mM dNTPs，1μM引物，以及1个单位的Taq DNA多聚酶。反应条件为于94℃预处理5分钟，然后进行35个循环，循环条件是94℃，1分钟，60℃，1分钟，72℃，2分钟；最后72℃，10分钟。
(3)克隆测序技术将步骤(2)得到的PCR产物用DNA纯化试剂盒GENCLEAN IIIKit(Bio 101，USA)进行纯化。取出1μl(约50ng)纯化的PCR片段，用克隆试剂盒TA cloning Kit(pGEM-T Easy Vector Systems，Promega，USA)将该PCR片段克隆到载体上。经转化细胞培养后，用质粒纯化试剂盒Rapid Plasmid Miniprep System(Marligen Bioscience，Germany)纯化质粒。测序通过反应试剂盒ABI Prism BigDye Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems，USA)和遗传分析仪Genetic analyzer(ABI Prism 3100，Applied Biosystems，USA)进行。最后使用序列分析软件Sequencing Analysis version 3.0(Perkin Elmer，USA)和DNAsis version 7.00(Hitachi，Japan)分析和确定样品的DNA序列。
(4)DNA序列比较将序列以Fasta格式储存，然后使用序列分析软件BioEdit version7.0.1(Isis Pharmaceuticals，USA)进行排序及计算差异百分比，结果再输入Excel 2002(Microsoft Corporation，USA)作统计分析。
(5)被测植物样品的鉴定将所测样品的5S rDNA序列与本发明公开的所有党参品种的DNA标准按上述方法进行逐一比较。如发现该植物样品的序列与某党参5S rDNA序列样准相匹配，也就是说，其序列差异小于9.9％，即可证实被测植物样品与党参，且与样准(党参)为同一品种。相反，如被测植物的5S rDNA序列与任何一个党参标准DNA序列均不相匹配，则说明该被测植物品种不是党参。
若想进一步了解该被测植物品是何种伪品或代用品，则可将其序列与本发明公开的几种伪品和代用品的序列进行比较，如发现匹配，即说明该被测样品是属于何种伪品或代用品。
因此，采用本发明提供的党参的5S rDNA的DNA序列及鉴定方法，通过其5S rDNA的DNA序列的比较，使得对中药党参的鉴定更加方便和可靠。
序列表<210>SEQ ID NO1<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 1<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE1CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCC GTCAACTCCC CTCCTCTTTA60TTCTTTGTAC TATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAA120CCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACG CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO2<211>LENGTH211<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 2<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE2CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCC GTCAAGTCCC CTCCTCTTTA60TTGTTTGTAC TATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCACAC GCGCCCAAAA120CCGAGCAAAA TGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACG CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO3<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 3<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE3CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATCCACCC GTCAACTCCC CTCCTCTTTA60TTCTTGGTAC TATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTAT GACTGCTGAC GCGCCCAAAA120GCGAGCAAAA CGTGCTTTTC GCGCTCTTAA TTATTGTACG GTGAGCAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO4<211>LENGTH210<212>TYpEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 4<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer
<400>SEQUENCE4CTAGGATGGG TGACCCCCAG GGAAGTGCTG GTATGCACCG GTCAAGTCCC CTCCTCTTTA60TTCTTTGTAA CATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAA120CCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTGT TTAATGCGCG CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQID NO5<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 5<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE5CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTCAGCGTA CATTAAGAAA CCATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCGTGA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA GAGATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGA180AGTTGACGG G190<210>SEQ ID NO6<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 6<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE6CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCAGC CCCCTTTTGC TCTTTTTTTT60AATCAGCGTA CATTAACAAA CCATATAAA GAAAGAAAT GCTCGGTTTT ACGCGCGTCA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA CACATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGTGGGA180AGTTGACGGG190<210>SEQID NO7<211>LENGTH209<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 7<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE7CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTCAGCCTA CTTTAAGAAA CCATATAAAA GAAAGAAAAT CCTCGGTTTT GGGCGCGTGA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA GAGATAGTTC AAAAGAATAA AGAGGAGGGA
180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO8<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 8<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE8CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TATTTTTTTT60ACTCTGCCTA CATTAAGAAA CGATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGAGTCA120GCAGTCAAAA GGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATTGTAC AAAAGAATAA AGCGGAGGGA180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO9<211>LENGTH213<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tangshen Oliv.9<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE9CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTCAACTCCC CCCCCTTTTG CTGTTTTGTT60TTACTCAGCG TACATTAAGA AACCATATAA ACTGCTCACG CGCTCAAAAC CGGGCATTTT120CTTTCTCATA AACGACCTTC TAGTACGCTC TTTAGAGATA GTACAAAAGA ATAAAGAGGA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQID NO10<211>LENGTH213<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tangshen Oliv.10<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE10CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAACCCCTC GTCAAGTCCC CCCCCTTTTG GTGTTTTGTT60TTACTCACCG TACATTAAGA AACCTTATAA AGTGCTCACG CGGTCAAAAC CGGCCATTTT120CTTTCTCAAA AACGACCTTC TAGTACGGGC TTTAGAGATA CTACAAAAGA ATAAAGAGCA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQID NO11<211>LENGTH213
<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tangshen Oiv.11<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE11CTAGGATGGG TGGCCCCCTG GCAAGTCCTC GTCAAGTCCC CCCCCTTTTG GTGTTTTGTT60TTTCTCAGCG TACGTTAAGA AACCATATAA AGGGCTCACG CGGTCAAAAC CGGGCGTTTT120CTTTCTAATA AACTGCCTTC TAGTAGGCTC TTTAGACATA GTAGAAAAGA ATAAAGAGCA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQID NO12<211>LENGTH212<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tubelosa Kom.12<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE12CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCGA GCATTTTTCT TTCTTTTATA CTGGTTTCTT60AATGTACGGT GAGTAAAAAA ACAGCAAAAG GGGGGGTGCA ACACGAGGTT CCCAGGGGGT120CACCCATCCT AATACTACTC TCGCCCTCAT TTGAGTTCGT ACAAAACGAC CATATGGGAG180AGGAGTTGAC GGG193<210>SEQ ID NO13<211>LENGTH212<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tubelosa Kom.13<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE13CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCTA GCATGTTTCT TTCTTTTATA CTGTTTTCTT60ACTGTACGGT GACTAAAAAA ACAGCTAAAG GGGGGGTGCT ACACGAGGTC GCCAGGGGGA120CACGCATCCT AATACGACTC TCTCCCTCAT TTTAGTTCGT ACAAAACTAC AAAAAGGGAG180AGAAGTTGAC GGG193<210>SEQID NO14<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis clematidea (Schyenk) C.B.Cl.14<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE14CTAGGATGGT CGACCATATG GGAAAGCTTC GCGTTTTTCT CCCTTTTTGA GTTTTTTTTA60
GTGTCACCTA AATAAGGAAA CCATTAAAAG AAAGAAACTA CACGAGGTTT TGGGGCCGTT120ATCCGCTCAC AAACTATTCT GGCATTCGTT TGGGATAGCA TAAAAGACTA AAGCCGGGGG180GAGTTGACGG G191<210>SEQID NO15<211>LENGTH212<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis canescens Nannf.15<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE15CTAGGACGCG GGAATTCGAG AAGAGTGCTG GTATGATCGC ACCCGCTGTT TTTTTTCCTC60TTTATTCTTT TGTACTATCT CTAAAGAGCG CGAGAAGGTC CGGTTTTGAC TTCTCACGCG120CCCAAAACAA AACGAGCTTT TTGCCTTTCG TTTGAGACGG TATAAAAGTA CGCTGAGGAG180GGGAGTTGAC GGG193<210>SEQID NO16<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis subglobosa W.W.Sm 16<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE16CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTATGCACCC GTTAACCCCC CCTTTTTTTG60TTTTTTTTAC TATCTCTACG TTAAGAAAAT GCTCGGTTTG ACTGCTCATG GGCGCGTGAG120CAGTCAAAAC GACCTTCTCG CGCTCTTTAG AGATATGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGG180AGTTGACGGG190<210>SEQID NO17<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis subglobosa W.W.Sm 17<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE17CTAGGATGGG TGTCCCCCTG GGAAGACCTC GTATGCACCC CCTAACCCCC CCTTTTTTTG60TTTTTTTTAC TATCGCAACG TTAAGAAAAT GCTTCCTTTG ACTGCTGATG GGCGCGTCAG120CAATCAAAAC GTCCTTCTCG CGCACTTTAG AGATATGGAC AAAAGAATAA AGAGGACGGG180TGTTGACGGG190
<210>SEQID NO18<211>LENGTH213<212>TYPEDNA<213>ORGANISMRadix Codonopsis 18<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE18CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTTTTA GTCAACTATG CCCGCTTTTG CTGTTTTGTT60TTCCTCAGCG TTCTTTAAGA ATCCATAAAG ACTGCTCACG GGCTCAAAAC CGGGCATTTT120CTTTCCCAAA ACCGAGCTTC TAGTTCGCTC TTTAGAGATA GTACAAAAGA ATAAAGAGGA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQ ID NO19<211>LENGTH207<212>TYPEDNA<213>ORGANISMRadix Codonopsis 19<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE19CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAATCTTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTAAACGGA CATTAAGAAG CGAATAAAAG AAAGAAAATG CTCGGTTTTG AGCGCGAGAG120CAGTCAAAAA GAACTTCTCG CGGTTGTTTG AGATAGTATA AAAGAATAAA GAGGAGGGAA180GTTGACGGG189<210>SEQID NO20<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMRadix Codonopsis 20<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE20CTAGGATGGG TGACTCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTCACCGTA CATTAAGAAA CCATATAAAA GAAAGAAAAA TGCTCGGTTT TGGGGCCGTG120AGCAGTCAAA ACGACCTTCT GGCGCTCGTT TGAGATAGTA CAAAAGAATA AAGAGGAGGG180GAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO21<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 21<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE21
CTAGGATGGA TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCCTTTTG GTGTTTTTTT60TACTCTGCGT ACATTAAGAA ACGATATAAA AGAAAGAAAA TGCTGGGTTT TGGGCGCGTG120AGCAGTCAGA ACGACCTTGT CGCGCTCTTT AGAGATAGTA CAAAAGAATA AAGAGGAGGG180GAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO22<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 22<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE22CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCGTC GTGTTGCACC CCCCCTTTTG CTGTTTTTTT60TACTGAGCGT ACATTAAGAA ACCATGTAAA AGAAAGAAAA TGCTCGGTTT TGGGCCCGTG120AGCAGTCAAA ACGACGTTCT CGCGCTCTTT GAGATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGG180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO23<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 23<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE23CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTACACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60GCTCAGCGTA CATTAAGAAA TCATGTAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCCTGA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGG180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO24<211>LENGTH211<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCampanumoea javanica Blume ssp. japonica (Makino) Hong 24<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE24CTAGGATGGG AGACACCCTG GTAAATCTTC GTGTTGCAAT TCCCCTTTTG CTGTTTTTTT60TACTAAACGG AGGTCTAGAA GCGAATAAAA GAAAGAAAGA ATAACCATTT TTGAGGCTGA120GGTAAGGTCT GAAGAACTTC TGAAGGTTGT TTGAGGCCGT ATAAAAATGT TCGAACAAGG180
GGAGTTGACG GG192<210>SEQ ID NO25<211>LENGTH319<212>TYPEDNA<213>ORGANISMPlatycodon grandiflorum (Jacq.) A.DC.25<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE25CTAGGATGGG TGACCTCCTG GGAAGGCCTC CTGTTGCACC CCCCATTTTT TTTATTTAAT60TTTTGATTTA TTTATGTTAT CGGTAGGTCG TTTTTTTTGT AGCTGTTGGA ATCATATTGC120GTTTTGTGAG TGCGTTTATC CGTAATAATA GGGAGCGTAA CGGTAAGGTT TCGGGTGTCG180GGTCCGTAAC GGTTGAAACG GGGAATCGTA ATGAGGGAAA ACGGTGGAAT TTCGGTTAAA240ATGGTAAAAG GATGTTGAAT AAAATGCAAT TTATGGTGAG AGTATATGGG290
权利要求
1.一种鉴定党参品种的方法，其特征在于，应用一种或多种选自样准组的DNA序列作为样准，对待鉴定样品的5S rDNA进行比较，从而获得该样品与样准之序列差异百分比，所用样准组包括以下DNA序列(1)党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.样品(编号CMED-0038-04)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.1所示；(2)党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.样品(编号CMED-0038-05)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.2所示；(3)党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.样品(编号CMED-0038-08)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.3所示；(4)党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.样品(编号CMED-0038-12)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.4所示；(5)素花党参Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-0093-01)之5S rDNA序列，该序列如SEQ IDNO.5所示；(6)素花党参Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-0093-03)之5S rDNA序列，该序列如SEQ IDNO.6所示；(7)素花党参Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-0093-04)之5S rDNA序列，该序列如SEQ IDNO.7所示；(8)素花党参Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-0093-05)之5S rDNA序列，该序列如SEQ IDNO.8所示；(9)川党参Codonopsis tangshen Oliv.样品(编号CMED-0101-01)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.9所示；(10)川党参Codonopsis tangshen Oliv.样品(编号CMED-0101-02)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.10所示；(11)川党参Codonopsis tangshen Oliv.样品(编号CMED-0101-05)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.11所示；(12)管花党参Codonopsis tubelosa Kom.样品(编号CMED-0102-01)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.12所示；(13)管花党参Codonopsis tubelosa Kom.样品(编号CMED-0102-02)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.13所示；(14)新疆党参Codonopsis clematidea(Schyenk)C.B.C1.样品(编号CMED-0109-01)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.14所示；(15)灰毛党参Codonopsis canescens Nannf.样品(编号CMED-0110-01)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.15所示；(16)球花党参Codonopsis subglobosa W.W.Sm样品(编号CMED-0107-01)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.16所示；(17)球花党参Codonopsis subglobosa W.W.Sm样品(编号CMED-0107-02)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.17所示；(18)板党Radix Codonopsis样品(编号CMED-DS-8-DFH)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.18所示；(19)防党Radix Codonopsis样品(编号CMED-DS-9-YH)之5SrDNA序列，该序列如SEQ ID NO.19所示；(20)纹党Radix Codonopsis样品(编号CMED-DS-10-YRS)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.20所示；(21)红党参Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-DS-7-XH)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.21所示；(22)红党参Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-DS-11-WYT)之5S rDNA序列，该序列如SEQ IDNO.22所示；(23)红党参Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen样品(编号CMED-DS-12-YRS)之5S rDNA序列，该序列如SEQ IDNO.23所示；(24)金钱豹Campanumoea javanica Blume ssp.japonica(Makino)Hong样品(编号CMED-0108-01)之5S rDNA序列，该序列如SEQ IDNO.24所示；和(25)桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.样品(编号CMED-0111-01)之5S rDNA序列，该序列如SEQ ID NO.25所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括一个判断步骤，该判断步骤是根据一个差异域值(threshold)，当样品与样准之间序列差异百分比小于该域值，则可初步判断该样品与样准是同一品种。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述差异域值在8％至12％之间。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述差异域值为9.9％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤(a)从待鉴定样品中提取DNA；(b)以上述DNA为模板，并以适当的寡核苷酸为引物，应用聚合酶链式反应扩增5S rDNA区段；(c)对上述扩增的5S rDNA区段进行序列测定；(d)将上述所测样品序列与一种或多种选自样准组的DNA序列进行比较，并计算其之间的差异百分比；和(e)根据上述差异百分比判断该被鉴定样品是否和所比样准是同一样品。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物为5S2F，其序列为5’GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA和5S2R，其序列为5’TTA GTG CTG GTA TGA TCG CA。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(e)的判断是根据一个差异域值实现的，当样品与样准之间序列差异百分比小于该域值，则可初步判断该样品与样准是同一品种。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述差异域值在8％至12％之间。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述差异域值为9.9％。
全文摘要
本发明公开了党参的5S rDNA序列及利用该序列区分党参、素花党参、川党参、管花党参、新疆党参、灰毛党参、球花党参品种及伪品金钱豹和桔梗。
文档编号C12Q1/68GK1982469SQ20051002287
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月13日 优先权日2005年12月13日
发明者邵鹏柱, 徐宏喜, 毕培曦, 张艳波 申请人:香港赛马会中药研究院有限公司