专利名称：谷胱甘肽的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种谷胱甘肽的生产方法。
背景技术：
谷胱甘肽(GSH)广泛存在于动植物和微生物细胞中，它与SOD并为人体两大还原系统，有参与氨基酸的跨膜运输、维持细胞的还原状态等重要生理功能。GSH在红细胞中作为巯基缓冲剂，维持血红蛋白及其它红细胞蛋白的半胱氨酸残基处于还原态。GSH在食品领域有广泛的应用食品工业面制品中GSH含量通常较低，在其中加入GSH可大大强化其营养价值；加入到乳制品中可有效防止酶促和非酶褐变，相当于维生素C，起稳定作用；在鱼类和禽类食品加工中加入GSH可抑制核酸分解，强化食品风味并大大延长保质期；在水果蔬菜类食品加工中加入GSH，可有效防止褐变，保持其原有的诱人色泽、风味和营养。此外，它还可用作起泡葡萄酒的还原剂。
医药GSH在临床上的用途也有多个方面通过γ-谷氨酰循环参与红细胞、肾等重要组织的氨基酸吸收，保证这些组织的营养要求；GSH参与药物代谢，药物在肝脏内通过含有细胞色素P-450的混合功能氧化酶系，经氧化、羟化等反应后与GSH的巯基结合成水溶性化合物而排出体外；与潜在致癌物(致癌物前体)在肝脏内的活性中间体结合而成非致癌物；
GSH是谷胱甘肽过氧化物的底物此酶可清除体内有害的过氧化氢，与SOD一起可清除体内的超氧离子及其它自由基，防止细胞损害。
目前的最新研究表明，GSH对丙烯晴、氟化物、一氧化碳、有机溶剂等的中毒均有解毒作用；对于放射线照射、放射性药物或肿瘤药物引起的白血球减少，放射性引起的骨髓组织炎及口腔粘膜炎均有缓解作用；GSH保护肝脏、抑制脂肪肝的形成，减轻中毒性与感染性肝炎的症状；对组织粘膜有保护作用，可防止溶血，减少高铁血红蛋白的损失；纠正乙酰胆碱、胆碱脂酶的不平衡，消除由此引起的过敏症状；对于缺氧血症、恶心及肝脏疾病引起的不适症具有缓解作用；防止皮肤色素沉积和黑色素的形成，减少其氧化、改善皮肤光泽、延缓衰老；抑制白内障、角膜及视网膜疾病的发展，防止视网膜移植后形成浑浊；改善性功能；在美国市场，除了作为药品用于疾病治疗外，谷胱甘肽还大量用于保健食品中(food supplements)，发挥其美化肌肤，延缓衰老，保护肝脏等保健机能。由于美国保健食品市场极为庞大，且不需医生处方即可购买谷胱甘肽保健品，故此在美国及其它发达国家的保健食品市场谷胱甘肽消耗量极大。
新近发现GSH可能具有抑制艾滋病的功能。另外，谷胱甘肽加入食品中可以起到稳定剂的作用，同时起到强化氨基酸的作用；谷胱甘肽在体内传递氨基酸的生物功能有助于促进婴幼儿的生长发育；孕妇缺乏蛋白质，其实主要是缺乏谷胱甘肽；因此在功能性保健食品方面，谷胱甘肽也有很大的潜在应用市场。
谷胱甘肽的制备有化学合成法、提取法、微生物发酵法、酶法等。
溶剂萃取法以富含谷胱甘肽的动植物组织为原料，通过添加适当的溶剂或结合淀粉酶、蛋白酶等处理，再分离精制而成。国内萃取法少量生产谷胱甘肽在我国早有成功先例，但生产工艺落后，规模小，产量低，质量差，目前比较流行的超临界萃取技术尚未得到广泛应用。
发酵法包括酵母菌诱变处理法、绿藻培养提取法及固定化啤酒酵母连续生产法等，其中以诱变处理获得高谷胱甘肽含量的酵母变异菌株来生产谷胱甘肽最为常见。绿藻培养提取法较为简便，生产成本也较低，但受地区资源的影响较大。固定化啤酒酵母连续生产法生产谷胱甘肽，由于其培养基构成原料较贵，生产成本较高，尚不适宜进行工业化大量生产。
化学合成法目前谷胱甘肽化学合成生产工艺已较成熟，但存在成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂、需光学拆分且污染环境等问题。其所用的基本原料是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。
酶法利用生物体内的谷胱甘肽合成酶，以L-谷氨酸、L-半胱酸和甘氨酸为底物，并添加少量三磷酸腺苷即可合成谷胱甘肽。此法是目前最有前景的谷胱甘肽生产方法。目前国内外有多家单位在研究。将谷胱甘肽合成的两个关键酶利用基因工程克隆出来后得到工程菌的技术目前已经基本成熟[沈立新等.生物工程学报.200117(4)452-455；李华钟等.无锡轻工业大学学报.1999，18(4)1-5；李寅等.微生物学报.2001，41(2)191-197]。利用重组工程菌来进行生产谷胱甘肽的光明前景已经为大家所公认。
微生物细胞内谷胱甘肽的生物合成受两个酶的控制，同时这两个酶又受谷胱甘肽的反馈抑制，而且能产生50％反馈抑制效应的谷胱甘肽的浓度(约2.5mmol/L)与细胞处于稳定期时胞内谷胱甘肽水平大致相当。因此在对谷胱甘肽合成的效率问题上，两个酶的活性起着至关重要的作用。
李华钟等[微生物学报.2001，41(1)16-24]获得了一株谷胱甘肽合成活性、质粒稳定性和传代稳定性俱佳，并且能够重复使用的重组大肠杆菌E.coli II。该菌株经过甲苯处理后，能够在胞外积累4g/L左右的谷胱甘肽(GSH)。在合成反应体系中提高L-谷氨酸浓度可促进GSH合成。但L-半胱氨酸浓度增加到20mmol/L后会抑制GSH的合成。
另外，在合成过程中，ATP的充分供给是实现谷胱甘肽高效生物合成的前提。Shimosaka[Agric Biol Chem.1988，522753-2762]将携带糖酵解关键酶基因(pfkA和tpi)的杂合质粒克隆到大肠杆菌中，显著提高了细胞合成ATP的活性。能否构建能量因子或辅助因子的再生系统，直接影响到细胞催化的多步酶反应的经济性。在谷胱甘肽的生物合成中，底物的转化效率依赖于系统中ATP的供给，故而ATP的再生以及ATP在反应体系中的维持是提高谷胱甘肽合成系统运行效率的关键。
李华钟等.[无锡轻工业大学学报.1999，18(4)1-5]利用混合悬浮培养的方法，构建了一个由重组大肠杆菌的谷胱甘肽生物合成酶系与面包酵母的糖酵解途径组成的ATP再生系统，验证了该系统用于谷胱甘肽生物合成的可行性。
李寅等.[微生物学报.2001，41(2)191-197]利用重组大肠杆菌II-1中的谷胱甘肽合成酶系和面包酵母WSH-J7中的ATP生物合成酶系，构建了一个以葡萄糖为能源的种间偶合ATP再生系统。经过通透性处理的酵母细胞几乎不能消耗葡萄糖。在反应体系中添加1mmol/L AMP和0.05mmol/L NADH，即可启动酵母的酵解途径。提高偶合系统中的葡萄糖浓度，可促进GSH的合成。
林金萍[谷胱甘肽生物合成的研究-高谷胱甘肽合成活性的菌株的构建及合成过程研究]通过引入S.cerevisiaeWSH-J702的糖酵解途径中的酶催化的ATP再生系统，构建了GSH生物合成的耦合体系。
Koh等.[Sanop Misaengmul Hakhoechi，1998，26(3)213-220]ATP再生系统用作谷胱甘肽生产的方法。谷胱甘肽是通过g-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的连续作用而合成的。其合成酶则产生于重组大肠杆菌。
但是，在这些研究中都存在着在谷胱甘肽合成过程中其反馈抑制是目前研究的难以解决的问题。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供了一种谷胱甘肽的生产方法，旨在解决上述的缺陷。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下步骤实现的将带有谷胱甘肽合成酶A和酶B的两种表达重组基因的基因工程大肠杆菌经大规模培养和大规模分离纯化技术，获得酶A、酶B，并将它们分别用适合的材料固定化；两固定化酶按EA∶EB＝1∶10～10∶1的比例混合后，装入GSH合成反应器，用于谷胱甘肽的生物合成；GSH合成反应器和ATP再生反应器分别是液流循环的，整个生产系统又形成一个大的液流循环式反应系统。
与现有技术相比，本发明的有益效果是使合成谷胱甘肽合成效率得以大大提高半胱氨酸的利用率为40％以上；谷胱甘肽的回收率在50以上；主合成反应阶段可以维持谷胱甘肽在合成反应器出口的浓度为0.8g/L以上；具有可连续生产，操作成本和原料成本较低，操作容易和产率高，产品提炼及精制相对容易，收率高等优点。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细描述本发明是通过以下步骤实现的根据谷胱甘肽合成酶A和酶B的基因序列，分别设计两条扩增引物，通过利用RT-PCR法从大肠杆菌中扩增出谷胱甘肽合成酶A和酶B两条基因片段，并分别克隆于原核表达载体上，测序验证基因序列的正确性，之后将其质粒转化大肠杆菌表达菌株后构建得到了高效表达的菌种。
将带有谷胱甘肽合成酶A和酶B的两种表达重组基因的基因工程大肠杆菌经大规模培养和大规模分离纯化技术，获得酶A、酶B，并将它们分别用适合的材料固定化应用以酵母浸出物、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化铵等组成的改良的LB培养基或2YT等培养基，经3～5小时培养后由IPTG诱导，继续培养3.5～4.5小时，离心收获菌体；收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后，离心收获上清，加35％～45％饱和度的硫酸铵，离心收获上清；进一步用60％～75％饱和度的硫酸铵处理，离心收获沉淀；沉淀用pH5.8～pH7.8磷酸盐缓冲液或pH8.0～pH9.5的Tris-HCl缓冲液溶解，经过透析或G25脱盐后，在经过sepharose CM fast flow或sepharose DEAE fast flow柱层析，即可得到纯化的合成酶EA和EB；两个合成酶分别用明胶包埋后戊二醛交联或用卡拉胶包埋，然后切成2mm×2mm的小块，-20度保藏，以备填装到合成反应器之用；两固定化酶按EA∶EB＝1∶10～10∶1的比例混合后，装入GSH合成反应器，用于谷胱甘肽的生物合成；GSH合成反应器和ATP再生反应器分别是液流循环的，整个生产系统又形成一个大的液流循环式反应系统；GSH合成，采用耦合GSH离子交换吸附柱，将酶促合反应生产的GSH，吸附到柱子上，降低以循环方式返回酶促合成反应器GSH浓度，从而解除产物对合成的抑制作用；两个或两个以上的GSH吸附柱交替使用和再生。洗脱的过程也是柱子的再生过程，从而保证酶促合成是连续反应，这样可以提高反应器的效率；在整个酶促合成的反应过程中，谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸以流加(Feed-batch)的方式以一定流速向反应器连续补料。谷胱甘肽合成反应器自身形成液流循环；谷胱甘肽在离子交换柱被吸附后，其余因向生物合成反应提供能量而从ATP降解而形成的ADP、AMP等进入到ATP再生反应器，通过固定化酵母的多酶体系，再生成为ATP，然后进入到谷胱甘肽合成反应器；ATP再生反应器自身形成一个液流循环；参加ATP再生的葡萄糖以一定流速流加到ATP再生反应器；再生的ATP与未在酸化磷酸化中起作用的谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸一起返回GSH合成反应器。
通过直接将合成酶通过纯化，再利用酶固定化技术将其固定；并利用GSH合成反应器和ATP再生反应器在整个生产系统形成一个大的液流循环式反应系统。
半胱氨酸的利用率为40％以上；谷胱甘肽的回收率在50％以上；主合成反应阶段可以维持谷胱甘肽在合成反应器出口的浓度为0.8g/L以上。
权利要求
1.一种谷胱甘肽的生产方法，是通过以下步骤实现的将带有谷胱甘肽合成酶A和酶B的两种表达重组基因的基因工程大肠杆菌经大规模培养和大规模分离纯化技术，获得酶A、酶B，并将它们分别用适合的材料固定化(1)；两固定化酶按EA∶EB＝1∶10～10∶1的比例混合后，装入GSH合成反应器，用于谷胱甘肽的生物合成(2)；GSH合成反应器和ATP再生反应器分别是液流循环的，整个生产系统又形成一个大的液流循环式反应系统(3)。
2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的生产方法，其中步骤(1)中根据谷胱甘肽合成酶A和酶B的基因序列，分别设计两条扩增引物，通过利用RT-PCR法从大肠杆菌中扩增出谷胱甘肽合成酶A和酶B两条基因片段，并分别克隆于原核表达载体上，测序验证基因序列的正确性，之后将其质粒转化大肠杆菌表达菌株后构建得到了高效表达的菌种；应用以酵母浸出物、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化铵等组成的改良的LB培养基或2YT等培养基，经3～5小时培养后由IPTG诱导，继续培养3.5～4.5小时，离心收获菌体；收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后，离心收获上清，加35％～45％饱和度的硫酸铵，离心收获上清；进一步用60％～75％饱和度的硫酸铵处理，离心收获沉淀；沉淀用pH5.8～pH7.8磷酸盐缓冲液或pH8.0～pH9.5的Tris-HCl缓冲液溶解，经过透析或G25脱盐后，在经过sepharose CM fast flow或sepharose DEAE fast flow柱层析，即可得到纯化的合成酶EA和EB；两个合成酶分别用明胶包埋后戊二醛交联或用卡拉胶包埋，然后切成2mm×2mm的小块，-20度保藏，以备填装到合成反应器之用；步骤(3)中GSH合成，采用耦合GSH离子交换吸附柱，将酶促合反应生产的GSH，吸附到柱子上，降低以循环方式返回酶促合成反应器GSH浓度；两个或两个以上的GSH吸附柱交替使用和再生；在整个酶促合成的反应过程中，谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸以流加的方式以一定流速向反应器连续补料，谷胱甘肽合成反应器自身形成液流循环；谷胱甘肽在离子交换柱被吸附后，其余因向生物合成反应提供能量而从ATP降解而形成的ADP、AMP等进入到ATP再生反应器，通过固定化酵母的多酶体系，再生成为ATP，然后进入到谷胱甘肽合成反应器；ATP再生反应器自身形成一个液流循环；参加ATP再生的葡萄糖以一定流速流加到ATP再生反应器；再生的ATP与未在酸化磷酸化中起作用的谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸一起返回GSH合成反应器。
全文摘要
本发明涉及一种谷胱甘肽的生产方法，是通过以下步骤实现的将带有谷胱甘肽合成酶A和酶B的两种表达重组基因的基因工程大肠杆菌经大规模培养和大规模分离纯化技术，获得酶A、酶B，并将它们分别用适合的材料固定化(1)；两固定化酶按EA∶EB＝1∶10～10∶1的比例混合后，装入GSH合成反应器，用于谷胱甘肽的生物合成(2)；GSH合成反应器和ATP再生反应器分别是液流循环的，整个生产系统又形成一个大的液流循环式反应系统(3)；半胱氨酸的利用率为40％以上；谷胱甘肽的回收率在50以上；主合成反应阶段可以维持谷胱甘肽在合成反应器出口的浓度为0.8g/L以上；具有可连续生产，操作和原料成本较低，操作容易和产率高，产品提炼及精制相对容易，收率高等优点。
文档编号C12N15/09GK1800410SQ200510023119
公开日2006年7月12日 申请日期2005年1月5日 优先权日2005年1月5日
发明者朱文洲 申请人:上海席诺生物技术有限公司