专利名称：无血清配方的动物细胞培养基胎牛血清替代剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种无血清配方的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，尤其涉及一种可与多种基础培养基进行搭配的动物细胞培养用的胎牛血清替代剂(无血清配方)。
背景技术：
动物细胞的体外培养多采用含血清的培养基进行培养，成本高，血清成分不明确，不易下游产物纯化，更重要的是，血清中含有潜在的病毒(如疯牛病毒等)、prion或mycoplasma污染等缺点，对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚.血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。
在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。因此，研制出替代血清的培养基则成为细胞工程研究的一个热点。
在细胞培养过程中用血清替代物配制成的培养基，完全采用了已知分子结构和构型组分的培养基，其成份明确，质量一致，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化，且避免了因血清中含有潜在的毒性等问题。因而，采用无血清培养基进行细胞培养生产已经成为利用动物细胞的体外培养的国际性趋势。而在一些发达国家，药政管理部门已经硬性规定疫苗，重组蛋白及单克隆抗体生产厂家不得使用含血清培养基，以免产品被动物血清中潜在的病原体污染。
动物细胞培养在国内正在成为一个新的产业，而无血清培养技术是这一产业发展的关键技术之一。目前，国外已有用于CHO细胞培养的商品无血清培养基，国内也有学者研制了一系列用于骨髓瘤、杂交瘤、CHO、BHK和Vero细胞的无血清培养基，主要是通过添加胰岛素，转铁蛋白等物质促进细胞贴壁与生长繁殖等，而研究对象往往是特定的细胞系。
Merten OW等[Advances in Animal Cell Biology and Technology forBioprocesses.1989，263-269]对杂交瘤细胞进行无血清培养初步研究。张元兴等[申请号99113498]培养基是以培养基RPM1640为基础，添加了转铁蛋白、甾体激素、微量元素、维生素、乙醇胺、β-巯基乙醇和对羟基苯甲酸等物质所组成的一种新的能使杂交瘤细胞可以旺盛地生长、细胞密度和单抗生产可与有血清培养基相媲美的低蛋白无血清培养基，可以替代有血清的培养基用于WuT3杂交瘤细胞的培养。张淑香等[华东理工大学学报.2003，29(4)372-375]通过添加胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、亚硒酸钠等实现了杂交瘤细胞的体外无血清低蛋白培养。
Jenkin HM等[PerformerMinnesota Univ.，Austin.Hormel Inst.，1983，44]研究添加了维生素、氨基酸、生长因子、激素以及其他有机化合物与无机盐的结合物来替代血清，培养的细胞主要包括猕猴肾脏细胞、人类肺与生殖器细胞。
Stockinger H[US1989000295813]通过添加转铁蛋白以及胰岛素等物质研究出了对对非粘着细胞的无血清培养基。
Mariani E[Journal of Immunological Methods.1991，145(1-2)175-183]介绍了能够促进杂交瘤细胞生长与单克隆抗体生产的无血清培养基。该产品替代了原本血清中的生长因子，激素以及蛋白质等。
戴育成[中国专利申请号02157709]公开了一种无血清培养基与浓缩液及其制备方法，它是以牛血清白蛋白溶液、胰岛素溶液、纯化人转铁蛋白溶液、胆固醇溶液、过氧化氢酶溶液为原料，通过一定工艺制备而成，适用于多种类型的组织和细胞的生长。
沃尔特·弗朗西斯·普劳蒂[中国专利申请号申请号90100961]将精氨酰-A-O胰岛素，一种由人胰岛素原用生物技术合成人胰岛素过程中的副产品，加入无血清组织培养基中，以刺激哺乳类细胞的生长，所述哺乳类细胞在组织培养中对胰岛素呈阳性反应。
陈国安等[中国专利申请号03118491]发明了一种细胞培养基及其培养方法与应用，尤其是一种人表皮细胞无血清培养基及其应用。该无血清培养体基是采用以IMDM培养为基础，加入自行研制的无血清培养基血清替代物，包括过氧化氢酶、牛血清白蛋白、人转铁蛋白、胆固醇、胰岛素、氢化可的松等，再补充表皮细胞生长因子、牛垂体提取物、乙醇胺等组成人表皮细胞无血清培养基。该发明的无血清培养体系可用于传代和原代人表皮细胞体外无血清培养。
研究表明，细胞在无血清培养基中可长期稳定传代，然而目前研究的无血清培养基主要表现为细胞的适用谱极窄，细胞在无血清培养基中更易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用还不如传统的合成培养基方便。
如何研究出一种可与多种基础培养基进行搭配的以适合培养不同的细胞的具有高度的灵活性的动物细胞无血清培养基是摆在科技技术人员面前需要解决的一个问题。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供了一种无血清配方的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，旨在解决上述的缺陷。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的本发明由重组人胰岛素样生长因子-10.1g～0.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.1g～0.6g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.05～0.4g/L，牛转铁蛋白1g～5g/L，牛血清白蛋白(V组分)2g～15g/L，巯基乙醇0.3～0.5mol/L组成。
与现有技术相比，本发明的有益效果是通过添加重组的细胞因子等主要成份，可以与基础培养基以不同比例配制成的培养基，成功的培养了使CHO细胞、BHK细胞、L929细胞等不同细胞系，达到了替代血清的目的；同时，将添加剂做成独立于基础培养基的独立配方，可与多种基础培养基进行搭配，以适合培养不同的细胞，具有高度的灵活性；并且可以与国产廉价的基础培养基配合，用于哺乳动物细胞无血清培养，大大降低培养基在生产或科研中的成本，这在无血清培养方面也取得了突破性的进展。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细描述实施例1本发明由重组人胰岛素样生长因子-10.1gL(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.3g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.2g/L，牛转铁蛋白3g/L，牛血清白蛋白(V组分)6g/L，巯基乙醇0.5mol/L。
实施例2本发明由重组人胰岛素样生长因子-10.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.1g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.1g/L，牛转铁蛋白2g/L，牛血清白蛋白(V组分)8g/L，巯基乙醇0.4mol/L。
实施例3本发明由重组人胰岛素样生长因子-10.3g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.4g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.3g/L，牛转铁蛋白4g/L，牛血清白蛋白(V组分)12g/L，巯基乙醇0.3mol/L。
配制方法
首先配制好与细胞培养相一致的基础培养基，例如RPMI1640或DMEM或F12或DMEM/F12等，配制浓度为正常浓度的4倍，用0.2μm滤膜除菌过滤；用上述基础培养基分别将称量好的牛转铁蛋白和牛血清白蛋白，溶解后用0.2μm滤膜除菌过滤；牛转铁蛋白和牛血清白蛋白的除菌溶液与在缓慢搅拌下混合，按比例加入巯基乙醇，然后在缓慢搅拌下依次加入计算好体积的重组人胰岛素样生长因子-1、重组人血小板源性生长因子-B和重组人碱性成纤维细胞生长因子，全部加入4倍浓度基础培养基并加超纯水到最终体积的95％后，调整pH到7.2～7.3，用超纯水定容到最终体积；用0.1μm滤膜过滤后，分装到已经灭菌的玻璃或塑料容器中；贴标签，放置-20度保藏。
本发明以添加了重组人胰岛素样生长因子-1，重组人血小板源性生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、血清白蛋白、巯基乙醇等物质所组成。该配方物质添加到RPMI1640或DMEM等培养基中，能使CHO细胞、BHK细胞、L929细胞等快速贴壁，旺盛地生长。6～12小时换液一次，基础培养基添加该配方成份所培养出的细胞密度可达到与有10％血清培养基相媲美的一致使用效果，完全可以替代血清添加到基础培养基中用于CHO细胞、BHK细胞、L929细胞等的培养。
权利要求
1.一种无血清配方的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，其特征在于由重组人胰岛素样生长因子-10.1g～0.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.1g～0.6g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.05～0.4g/L，牛转铁蛋白1g～5g/L，牛血清白蛋白(V组分)2g～15g/L，巯基乙醇0.3～0.5mol/L组成。
2.根据权利要求1所述的无血清配方的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，其特征在于由重组人胰岛素样生长因子-10.1g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.3g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.2g/L，牛转铁蛋白3g/L，牛血清白蛋白(V组分)6g/L，巯基乙醇0.5mol/L组成。
3.根据权利要求1所述的无血清配方的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，其特征在于由重组人胰岛素样生长因子-10.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.1g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.1g/L，牛转铁蛋白2g/L，牛血清白蛋白(V组分)8g/L，巯基乙醇0.4mol/L组成。
4.根据权利要求1所述的无血清配方的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，其特征在于由重组人胰岛素样生长因子-10.3g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.4g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.3g/L，牛转铁蛋白4g/L，牛血清白蛋白(V组分)12g/L，巯基乙醇0.3mol/L组成。
全文摘要
本发明涉及一种无血清配方的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，由重组人胰岛素样生长因子－10.1g～0.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子－B0.1g～0.6g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.05～0.4g/L，牛转铁蛋白1g～5g/L，牛血清白蛋白(V组分)2g～15g/L，巯基乙醇0.3～0.5mol/L组成；通过添加重组的细胞因子等主要成分，可以与基础培养基以不同比例配制成的培养基，成功的培养了使CHO细胞、BHK细胞、L929细胞等不同细胞系，达到了替代血清的目的；同时，将添加剂做成独立于基础培养基的独立配方，可与多种基础培养基进行搭配，以适合培养不同的细胞，具有高度的灵活性；并且可以与国产廉价的基础培养基配合，用于哺乳动物细胞无血清培养，大大降低培养基在生产或科研中的成本。
文档编号C12N5/06GK1800368SQ200510023118
公开日2006年7月12日 申请日期2005年1月5日 优先权日2005年1月5日
发明者朱文洲 申请人:上海席诺生物技术有限公司