专利名称：无血清动物细胞培养基干粉、液体培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及培养基干粉、液体培养基以及它们的制备方法，尤其涉及无血清动物 细胞培养基干粉、液体无血清动物细胞培养基以及它们的制备方法。
背景技术：
现有技术通过增加大豆水解产物作为无血清动物细胞培养基的组分，来提高被培 养宿主细胞或重组细胞的培养稳定性和培养密度、增加被培养宿主细胞或重组细胞的产 量，并且增加寄生在宿主细胞中的病毒等的产量或者利用重组细胞作为表达载体后所产生 重组靶蛋白产物的产量。并且认为其它植物的水解产物，例如小麦水解产物不能得到与大 豆水解产物相当的有益效果。例如CN 1318577C(专利号00816020. 1)中公开了一种用于培养哺乳动物细胞的
无蛋白无血清培养基，所述培养基包含大豆水解产物，其中至少40%的所述大豆水解产物 的分子量< 500道尔顿。该培养基能够起到提高被培养重组细胞培养稳定性、终细胞密度 以及重组细胞靶蛋白产率的作用。W002/29084也在说明书实施例中提及可以向培养动物细 胞的培养基中添加大豆蛋白的水解产物。但是大豆水解产物中除了含有大豆蛋白外还含有许多其他成分，比如，大豆油、大 豆多糖、大豆皂甙等，因此在向无血清动物细胞培养基中添加大豆水解产物的同时，极有可 能加入上述其他成分即加入杂质成分，从而不利于细胞的增殖和生长。此外，由于大豆蛋白 在不同水解条件下被水解程度不同，因而得到的大豆蛋白水解产物成分很难统一，会造成 培养基成分不确定，从而使被培养细胞的批次差异性大，且使被培养细胞的下游产品分离 困难。综上，虽然现有技术已经出现了添加大豆水解产物的无血清动物细胞培养基，但 目前这类动物细胞培养基仍然存在细胞培养密度低、分离细胞下游产品成本高、被培养细 胞的批次差异性大、安全性差的缺陷。
发明内容
本发明的目的是克服现有动物细胞培养无血清动物细胞培养基存在细胞培养密 度低、分离细胞下游产品成本高、被培养细胞的批次差异性大、安全差的缺点，提供一种新 的无血清动物细胞培养基干粉，由无血清动物细胞培养基干粉制成液体培养基所培养的细 胞培养密度高、利于分离细胞下游产品、成本低、被培养细胞的批次差异性小、安全性好。本发明的第二个目的是提供上述无血清动物细胞培养基干粉的制备方法。本发明的第三个目的是提供包括上述无血清动物细胞培养基干粉的液体无血清 动物细胞培养基。本发明的第四个目的是提供包括上述无血清动物细胞培养基干粉的液体无血清 动物细胞培养基的制备方法。现有技术中认为向无血清动物细胞培养基中加入除大豆水解蛋白外的其他蛋白效果不好，例如，在CN 1318577C的说明书第3-4页明确记载，“与现有技术已知的其它水解 产物(例如小麦水解产物、水稻水解产物或酵母水解产物)相反，已经发现仅大豆水解产物 介导按照本发明的特性，并且导致例如显著提高重组靶蛋白的得率。”在该文件的实施例7 中揭示出小麦水解产物不如大豆蛋白水解产物效果好。然而本发明的发明人意外地发现，向无血清基本培养基干粉中以培养基溶剂的体 积为基准，加入100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的 蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0-200g/100L的小麦麸蛋白和50_100g/100L的水稻 蛋白得到的培养基干粉，制成液体无血清培养基培养动物细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞 (CH0细胞)以及叙利亚地鼠肾细胞(BHK21细胞)时，能够达到的细胞培养密度远高于现有 技术添加大豆水解产物或大豆蛋白水解产物的液体无血清培养基所能达到的细胞培养密 度；由于添加的成分确定，一方面有利于分离细胞下游产品，使成本降低，另一方面使被培 养细胞的批次差异性大大减小，安全性更好。本发明提供了一种无血清动物细胞培养基干粉，所述培养基干粉分散在培养基溶 剂中形成液体培养基，所述培养基干粉包括基本培养基干粉，其中，以所述培养基溶剂的体 积为基准，所述培养基干粉还包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋 白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0_200g/100L的小麦麸蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。本发明还提供了上述无血清动物细胞培养基干粉的制备方法，该方法包括将本发 明所述的无血清动物细胞培养基干粉的组分分散在分散剂中，移除所得混合物中的分散 剂。本发明还提供了一种液体无血清动物细胞培养基，所述液体无血清动物细胞培养 基包括培养基溶剂和分散在该培养基溶剂中的无血清动物细胞培养基干粉，其中，所述无 血清动物细胞培养基干粉为本发明所述的无血清动物细胞培养基干粉中的一种或几种。本发明还提供了上述液体无血清动物细胞培养基的制备方法，该方法包括将无血 清动物细胞培养基干粉分散在培养基溶剂中，过滤灭菌，其中，所述无血清动物细胞培养基 干粉选自本发明所述的无血清动物细胞培养基干粉中的一种或几种。与现有的添加大豆水解产物或大豆蛋白水解产物的无血清动物细胞培养基干粉 或液体无血清培养基相比，本发明的无血清动物细胞培养基干粉或液体无血清培养基中 还包括以培养基溶剂的体积为基准，100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋 白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0_200g/100L的小麦麸蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。当本发明的无血清动物细胞培养基干粉或液体无血清培养基用 于培养动物细胞时，能够达到的细胞培养密度大大提高；由于添加的成分确定，一方面有利 于分离细胞下游产品，使成本降低，另一方面使被培养细胞的批次差异性大大减小，安全性 更好。
图IA为使用本发明实施例1的无血清动物细胞培养基干粉培养72小时的CHO细 胞的照片(放大420倍)；图IB为使用本发明实施例5的无血清动物细胞培养基干粉培养72小时的BHK21细胞的照片(放大300倍)；图2A为使用对比例1 (CN 1318577C)的无血清动物细胞培养基(包括大豆水解产 物)培养72小时的CHO细胞的照片(放大300倍)；图2B为使用对比例1 (CN 1318577C)的无血清动物细胞培养基(包括大豆水解产 物)培养72小时的BHK21细胞的照片(放大300倍)；图3A为使用对比例2 (W0 02/29084)的无血清动物细胞培养基(包括大豆水解产 物)培养72小时的CHO细胞的照片(放大300倍)；图;3B为使用对比例2 (W0 02/29084)的无血清动物细胞培养基(包括大豆水解产 物)培养72小时的BHK21细胞的照片(放大300倍)；图4A为使用本发明实施例2的液体无血清动物细胞培养基培养72小时的CHO细 胞的照片(放大420倍)；图4B为使用本发明实施例6的液体无血清动物细胞培养基培养72小时的BHK21 细胞的照片(放大300倍)；图5A为使用实施例3的培养液体无血清动物细胞培养基培养48小时的CHO细胞 的照片(放大420倍)；图5B为使用实施例7的培养液体无血清动物细胞培养基培养48小时的BHK21细 胞的照片(放大300倍)；图6A为使用实施例4的培养液体无血清动物细胞培养基培养48小时的CHO细胞 的照片(放大420倍)；图6B为使用实施例8的培养液体无血清动物细胞培养基培养48小时的BHK21细 胞的照片(放大200倍)；图7A为对比例1-2和实施例1-4随培养时间变化的CHO细胞密度对比图；图7B为对比例1-2和实施例5-8随培养时间变化的BHK21细胞密度对比图。
具体实施例方式本发明提供的无血清动物细胞培养基干粉，所述培养基干粉分散在培养基溶剂 中形成液体培养基，所述培养基干粉包括基本培养基干粉，其中，以所述培养基溶剂的体 积为基准，所述培养基干粉还包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋 白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0_200g/100L的小麦麸蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。本发明的无血清动物细胞培养基干粉优选其中以所述培养基溶剂的体积为基 准，所述培养基干粉还包括150-180g/100L的大豆蛋白、150-180g/100L的豌豆蛋白、 150-180g/100L的蚕豆蛋白、50-80g/100L的马铃薯蛋白、150_180g/100L的小麦麸蛋白和 50-80g/100L的水稻蛋白。本发明的无血清动物细胞培养基干粉更优选其中以所述培养基 溶剂的体积为基准，所述培养基干粉还包括170-180g/100L的大豆蛋白、170-180g/100L的 豌豆蛋白、170-180g/100L的蚕豆蛋白、50-60g/100L的马铃薯蛋白、150_160g/100L的小麦 麸蛋白、50-60g/100L的水稻蛋白。本发明的无血清动物细胞培养基干粉中，所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马 铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白可以是商业上可供的商品，也可以是按照常规实验手段从相应植物种子或果实中分离出来的蛋白。蛋白质的分离提纯方法以及定性定量的检测 方法为本领域技术人员公知，比如TCA-丙酮法(Mechin V，Damerval C，Zivy M. Total protein extraction with TCA-acetone. Methods MolBiol 2007 ;355 :1-8)、酸水解以及 酶水解法，优选酶水解法。优选本发明所述的大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水 稻蛋白通过以下方法制备a)粉碎大豆、豌豆、蚕豆、马铃薯、小麦麸或水稻植物原料至直径为0. l-3mm3的颗 粒；b)在酶解时间为0. 5-10h、酶解PH值为5_9、酶解温度为45°C -60°C、酶量为2_5 重量％的条件下酶解步骤a)所得的颗粒；其中，所述酶选自胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋 白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或几种，所述酶的酶活> IXlO5单位/克；c)在80_100°C保持5-20min以终止步骤b)所述的酶解；d)将步骤c)所得的酶解产物在3000-8000rpm下离心5-20min，收集上清液；e)将步骤d)所得上清液用中空纤维过滤器超滤，所述过滤器所用膜的透过分子 量为10000-20000道尔顿；f)收集步骤e)所得超滤液，真空冷冻干燥，获得相应植物蛋白。更优选所述大豆蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白 通过以下方法制备a)粉碎大豆、豌豆、蚕豆、马铃薯、小麦麸或水稻植物原料至直径为0. I-Imm3的颗 粒；b)在酶解时间为2-10h、酶解PH值为5-8、酶解温度为45°C _60°C、酶量为2_5重 量％的条件下酶解步骤a)所得的颗粒；其中，所述酶选自胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白 酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或几种，所述酶的酶活> IX IO5单位/克；c)在80_90°C保持5-lOmin以终止步骤b)所述的酶解；d)将步骤c)所得的酶解产物在3000-5000rpm下离心15-20min，收集上清液；e)将步骤d)所得上清液用中空纤维过滤器超滤，所述过滤器所用膜的透过分子 量为10000-20000道尔顿；f)收集步骤e)所得超滤液，真空冷冻干燥，获得相应植物蛋白。更优选地，根据不同的植物原料进行不同的前处理，例如，对于豆类原料(大豆、 豌豆和蚕豆)可以先脱脂前处理。不同的植物原料也可以采用不同的酶解条件，例如，在 温度为52. 9°C、碱性蛋白酶(IO5单位/克)加酶量为5. 2%、pH为8. 7、底物浓度为8. 06 重量％以及提取时间为2小时的条件下制备小麦麸蛋白；或者在温度为50°C、中性蛋白酶 (IO5单位/克)加酶量为4%、pH为6. 8、底物浓度为6. 5重量％以及提取时间为2. 5小时 的条件下制备小麦麸蛋白。马铃薯蛋白可以通过以下方法制得清洗去皮马铃薯原料与等 体积亚硫酸钠溶液勻浆，固液分离(离心、静置或榨汁)，收集所得马铃薯汁在pH为3. 0 下静置证，离心收集沉淀，喷雾干燥得粉末。收集所述粉末加缓冲液，在温度为50°C、胰蛋 白酶加酶量(IO5单位/克)为4%、pH为8.0、底物浓度为20重量％ (IO5单位/克)以及 提取时间为1. 5小时的条件下制备马铃薯蛋白。本发明的无血清动物细胞培养基干粉可以包括本领域常用的各种基本培养基，例如，选自BME细胞培养基、DMEM细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、Fischer' s细胞培养 基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、MEM细胞培养基、FlO细胞培养基、F12细胞培养基和 1640细胞培养基中的一种或几种。优选包括的所述基本培养基为重量比1 1的F12细胞 培养基和DMEM细胞培养基。所述基本培养基的成分为本领域公知，上述列举的基本培养基 名称为它们的商品名，商业上可供。更优选本发明的无血清动物细胞培养基干粉，其中，以所述培养基溶剂的体积为 基准，所述无血清动物细胞培养基干粉包括下表1所示的组分表 权利要求
1.一种无血清动物细胞培养基干粉，所述培养基干粉分散在培养基溶剂中形成液体 培养基，所述培养基干粉包括基本培养基干粉，其特征在于，以所述培养基溶剂的体积为 基准，所述培养基干粉还包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、 100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0_200g/100L的小麦麸蛋白和 50-100g/100L的水稻蛋白。
2.根据权利要求1所述的无血清动物细胞培养基干粉，其中，以所述培养基溶剂的体 积为基准，所述培养基干粉还包括150-180g/100L的大豆蛋白、150-180g/100L的豌豆蛋 白、150-180g/100L的蚕豆蛋白、50-80g/100L的马铃薯蛋白、150_180g/100L的小麦麸蛋白 和50-80g/100L的水稻蛋白。
3.根据权利要求2所述的无血清动物细胞培养基干粉，其中，以所述培养基溶剂的体 积为基准，所述培养基干粉还包括170-180g/100L的大豆蛋白、170-180g/100L的豌豆蛋 白、170-180g/100L的蚕豆蛋白、50-60g/100L的马铃薯蛋白、150_160g/100L的小麦麸蛋 白、50-60g/100L的水稻蛋白。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的无血清动物细胞培养基干粉，其中，所述大豆 蛋白、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白通过以下方法制备a)粉碎大豆、豌豆、蚕豆、马铃薯、小麦麸或水稻植物原料至直径为0.l-3mm3的颗粒；b)在酶解时间为0.5-10h、酶解PH值为5-9、酶解温度为45°C -60°C、酶量为2_5重 量％的条件下酶解步骤a)所得的颗粒；其中，所述酶选自胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白 酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或几种，所述酶的酶活> IX IO5单位/克；c)在80-100°C保持5-20min以终止步骤b)所述的酶解；d)将步骤c)所得的酶解产物在3000-8000rpm下离心5-20min，收集上清液；e)将步骤d)所得上清液用中空纤维过滤器超滤，所述过滤器所用膜的透过分子量为 10000-20000 道尔顿；f)收集步骤e)所得超滤液，真空冷冻干燥，获得相应植物蛋白。
5.根据权利要求4所述的无血清动物细胞培养基干粉，其中，所述大豆蛋白、豌豆蛋 白、蚕豆蛋白、马铃薯蛋白、小麦麸蛋白和水稻蛋白通过以下方法制备a)粉碎大豆、豌豆、蚕豆、马铃薯、小麦麸或水稻植物原料至直径为0.I-Imm3的颗粒；b)在酶解时间为2-10h、酶解PH值为5-8、酶解温度为45°C_60°C、酶量为2_5重量％ 的条件下酶解步骤a)所得的颗粒；其中，所述酶选自胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、 木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或几种，所述酶的酶活> IXlO5单位/克；c)在80-90°C保持5-lOmin以终止步骤b)所述的酶解；d)将步骤c)所得的酶解产物在3000-5000rpm下离心15-20min，收集上清液；e)将步骤d)所得上清液用中空纤维过滤器超滤，所述过滤器所用膜的透过分子量为 10000-20000 道尔顿；f)收集步骤e)所得超滤液，真空冷冻干燥，获得相应植物蛋白。
6.根据权利要求1-3中任意一项所述的无血清动物细胞培养基干粉，其中，所述基本 培养基选自BME细胞培养基、DMEM细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、Fischer' s细胞培 养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、MEM细胞培养基、FlO细胞培养基、F12细胞培养基 和1640细胞培养基中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的无血清动物细胞培养基干粉，其中，以所述培养基溶剂的体 积为基准，所述无血清动物细胞培养基干粉包括下表1所示的组分
8.根据权利要求7所述的无血清动物细胞培养基干粉，其中，以所述培养基溶剂的 体积为基准，所述无血清动物细胞培养基干粉还包括0. l-lg/100L的次黄嘌呤和/或 0. l-2g/100L 的酚红。
9.根据权利要求7所述的无血清动物细胞培养基干粉，其中，以所述培养基溶剂的体 积为基准，所述无血清动物细胞培养基干粉包括下表2所示的组分
10.根据权利要求7所述的无血清动物细胞培养基干粉，其中，以所述培养基溶剂的体 积为基准，所述无血清动物细胞培养基干粉包括下表3所示的组分表3
11.根据权利要求7所述的无血清动物细胞培养基干粉，其中，以所述培养基溶剂的体积为基准，所述无血清动物细胞培养基于粉包括下表4所示的组分 表4
12.—种无血清动物细胞培养基干粉的制备方法，该方法包括将选自权利要求1-11中 任意一项所述的无血清动物细胞培养基干粉的组分分散在分散剂中，移除所得混合物中的 分散剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述分散剂选自蒸馏水、去离子水、注 射用水、重蒸水、超纯水、能与水以任意比互溶的醇、碱性水溶液和酸性水溶液中的一种或 几种。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述碱性水溶液为氢氧化钠溶液或者权利要 求1-11中所述的无血清动物细胞培养基干粉中出现的阳离子的碱的水溶液，所述酸性水 溶液为权利要求1-11中所述的无血清动物细胞培养基干粉出现的酸根离子的酸的水溶 液。
15.一种液体无血清动物细胞培养基，所述液体无血清动物细胞培养基包括培养基溶 剂和分散在该培养基溶剂中的无血清动物细胞培养基干粉，其特征在于，所述无血清动物 细胞培养基干粉为权利要求1-11中任意一项所述的无血清动物细胞培养基干粉中的一种或几种。
16.根据权利要求15所述的液体动物细胞培养基，其中，所述培养基溶剂选自蒸馏水、 去离子水、注射用水、重蒸水和超纯水中的一种或几种。
17.一种液体无血清动物细胞培养基的制备方法，该方法包括将无血清动物细胞培养 基干粉分散在培养基溶剂中，过滤灭菌，其特征在于，所述无血清动物细胞培养基干粉选自 权利要求1-11中所述的无血清动物细胞培养基干粉中的一种或几种。
全文摘要
本发明提供了一种无血清动物细胞培养基干粉及其制备方法，所述培养基干粉包括基本培养基干粉，其中，以所述培养基溶剂的体积为基准，所述培养基干粉还包括100-200g/100L的大豆蛋白、100-200g/100L的豌豆蛋白、100-200g/100L的蚕豆蛋白、0-100g/100L的马铃薯蛋白、0-200g/100L的小麦麸蛋白和50-100g/100L的水稻蛋白。本发明还提供了包括上述无血清动物细胞培养基干粉的液体无血清动物细胞培养基及其制备方法。由上述含有植物蛋白的本发明的培养基培养的细胞培养密度高、利于分离细胞下游产品、成本低、被培养细胞的批次差异性小、安全性好，适于用作生产疫苗等生物制品的病毒宿主、表达载体等。
文档编号C12N5/07GK102115728SQ20091026597
公开日2011年7月6日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者王建超, 罗海春, 陈文庆 申请人:北京清大天一科技有限公司