专利名称：一种既能耐受高浓度As(Ⅲ)又能氧化As(Ⅲ)的基因工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程及环境保护领域，涉及一种既能耐高浓度三价砷As(III)又 能高效氧化As (III)的基因工程菌及其应用。
背景技术：
砷(As)是一种对人体及其它生物体有毒害作用的致癌物质。水体中的砷，通常以 无机态存在，有三价砷As(III)和五价砷As (V)两种化学价态。目前常用的处理含砷废水的 方法主要有沉淀/共沉淀，吸附，离子交换法和膜法。但是，这些技术主要针对As (V)，因为 当PH <9. 2时，As(III)的存在形式呈电中性，其吸附结合能力较弱，且As(III)的毒性是 As(V)的100倍以上，因此，在处理含砷废水的时候，通常需要通过预处理将As(III)转化 为As(V)。目前常用的氧化剂主要有氯气、纯氧、臭氧，高锰酸钾的等。近年来，光助!^nton 法以及一些有效的吸附剂辅以光催化的方法受到了广泛的关注。但是，这些方法都存在一 些缺点，比如氯气虽然是一种快捷而有效的氧化剂，但是当有机物存在的时候会产生三氯 甲烷等致癌副产物，臭氧和光催化费用较高。随着很多研究者分离筛选出具有氧化能力的 菌种，生物氧化法的使用应运而生，成为当前研究的热点。目前有报道的能氧化As(III)的 异养型细菌主要有獎产减杆菌(Alcaligenes faecalis)，Cenibacterium arsenoxidans, 栖热菌 HR13(Thermus HR13)，嗜热栖热菌 HB8 (Thermusthermophilus HB8)，根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)禾口禮色绿屈接菌 Chloroflexusaurantiacus。这些菌之所 以能氧化As (III)，是因为其含有三价砷氧化酶能催化氧化As (III)。但是它们的耐砷能力 普遍较低，比如Thermus thermophilus HB8对As(III)的氧化率较高，且稳定性较强，但 这种菌的生长条件较为极端，生长温度较高，不适宜普通条件的培养。此外，它仅能在75mg/ L的砷酸盐浓度下生长。因此，运用嗜热栖热菌处理实际高浓度含砷废水显然是不合适的。Thermus thermophilus HB8中三价砷氧化酶(包含大小亚基)的基因(TTHB127， TTHB128)，位于该菌的质粒(pTT27)上。该基因编码的蛋白质具有催化氧化As (III)的作 用。本实验室从高浓度含砷废水中筛选了一株耐砷菌，该菌株耐As (III)浓度可以达 到500mg/L。经Biolog自动化鉴定系统及16S rDNA序列分析等鉴定，该菌株属恶臭假单胞 菌(pseudomonasputida),命名为pseudomonasputida AS-01。该菌已保藏于中国典型培养 物保藏中心(缩写CCTCC，地址中国 武汉 武汉大学)，保藏编号为CCTCCN0 :M 209296, 保藏日期为2009年12月7日。对该菌株As (III)氧化酶特性的研究发现，其对As (III) 的氧化能力较低，仅达到四.8%，且稳定性较差，不足以有效地氧化As (III)，从而降低高 浓度含三价砷废水的毒性。有关该菌可参考文献王薇，王君琴，杨洁，徐炎华，三价砷氧化 菌株的筛选及其培养条件初探，中国地方病学杂志，2006，25(1) 96 98。文献(范秋燕，杨春艳，许琳，徐炎华，耐As (III)及高效氧化As (III)基因工程 菌的构建，南京工业大学学报(自然科学版)，2009，31(2) :61 64)报导了一种构建耐As(III)及高效氧化As (III)基因工程菌的方法并获得基因工程菌127pBBRU8-AS，由于该 方法采用了筛选的方法，不能保证重现地筛选出同种同属、生化遗传性能完全相同的微生 物体，不具有专利法所述的实用性，其获得的基因工程菌127pBBRU8-AS没有进行保藏，公 众无法获得，且该基因工程菌转接到30次后，氧化酶活力与原始菌株AS-Ol平行。目前没有一种稳定性及氧化酶活力更好的既能耐受高浓度As (III)又能高效氧 化As (III)的基因工程菌株提供。
发明内容
本发明的目的在于提供一种既能耐高浓度As(III)又能高效氧化As(III)的恶臭 假单胞菌基因工程菌。本发明另一个目的是提供上述基因工程菌在处理含砷废水中的应用。本发明采用将上述Thermus thermophilus HB8中三价砷氧化酶(包含大小亚基) 的基因(TTHB127，TTHB128)插入到广宿主穿梭表达载体pBBRlMCS_5上(质粒图谱见图1， 详细构建方法见参考文献 Μ. E. Kovach, P. H. Elzer, D. S. Hill，G. Τ. Robertson,Μ. Α. Farris, R. Μ. Roop II, K.Μ. Peterson, Four new derivatives of the broad-host-range cloningvector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes, Gene. 166 (1995) 175-176.)，转化宿主菌(恶臭假单胞菌AS-01)，经筛选得到既能耐高浓度 As (III)，又能高效氧化As (III)的基因工程菌。在此基础上，运用该工程菌处理高浓度含 砷废水，以达到高效氧化As(III)，降低废水毒性。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种恶臭假单胞菌基因工程菌，其分类命名为恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida)AS-02,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 209215。所述的恶臭假单胞菌基因工程菌在处理含砷废水中的应用。其中含砷废水优选为 含有500 800mg/L三价砷的废水。获得本发明恶臭假单胞菌基因工程菌的方法概括如下1、从嗜热栖热菌HB8中提取质粒DNA。根据基因库中已经发布的 Thermusthermophilus HB8 (购自德国微生物菌种保藏中心，DSMZ)中三价砷氧化酶基因大 小亚基基因序列(AccessionNo. YP 145366和YP 145367)设计引物，扩增出三价砷氧化酶 大小亚基基因片段，它具有序列表中SEQ ID No 1, SEQ ID No :2所述的核苷酸序列。2、构建包括具有序列表中SEQ ID No :1，SEQ ID No :2所述的核苷酸序列基因的 重组载体。它是以序列表中 SEQ ID No :3、SEQ ID No 4 以及 SEQ ID No :5、SEQID No :6， 分别作为大小亚基PCR引物进行扩增，并作切胶回收得到2586bp和48;3bp的DNA片段，分 别与pMD18-T进行连接反应，前者制成pMD18-T-TTHB127，后者制成pMD18-T_TTHB128。3、构建包括具有序列表中SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所述的核苷酸序列基 因的表达载体，以序列表中SEQ ID No :7、SEQ ID No 8以及SEQ ID No :9、SEQ ID No 10，分别作为大小亚基PCR引物进行扩增，并分别以pMD18-T-TTHB127、pMD18-T-TTHB128 为大小亚基扩增模板。切胶回收得到带有相应酶切位点的大小亚基基因片段。用EcoRI 和BamH I双酶切后的小亚基基因片段与同样酶切的表达载体pBBRlMCS_5进行连接反应，制成pBBRlMCS-5-TTHB128,转化E. coliDH5 α后，提取阳性克隆子的质粒，将此质粒 再分别用I^acI和SpeI单酶切后与同样酶切后的大亚基基因片段进行连接反应，制成 TTHB127-pBBRlMCS-5-TTHB 128,构建策略见图 3。4、将含有三价砷氧化酶基因的重组载体(步骤3所述载体 TTHB 127-pBBRlMCS-5-TTHB 128)转化宿主细胞。通过三亲接合的方法将含有三价砷氧化 酶基因的重组载体导入到宿主菌，所述的宿主菌为恶臭假单胞菌(pseudomonasputida) AS-O1。5、在含更高浓度(彡500mg/L)亚砷酸盐的LB平板上，筛选得到数株菌株，对其分 别进行亚砷酸盐耐性，亚砷酸盐氧化能力的测定以及工程菌稳定性测定，比较各项性能后 得到一株对As (III)耐性较高，氧化能力较强，稳定性较高的优势目标菌株，将此菌株进行保藏。本发明有益效果本发明提供的基因工程菌对As (III)的耐受性达到800mg/L，氧化能力达91. 7%, 遗传稳定性较好，与文献公开的基因工程菌127pBBRU8-AS相比，具有更好的稳定性、氧化 能力，能耐受更高的As(III)浓度，能够更好地用于含高浓度As (III)废水的处理，具有更 好的环保价值。
图 1 质粒 pBBRlMCS-5 图谱。图2三价砷氧化酶基因大小亚基基因的PCR扩增结果。泳道M为DNA分子量标准(DL-2000)；泳道2为三价砷氧化酶基因的大亚基基因 的PCR产物；泳道3为三价砷氧化酶基因的小亚基基因的PCR产物；图3 —种含有三价砷氧化酶基因的表达载体的构建策略图。图 4 重组质粒 TTHB127-pBBRlMCS-5-TTHB128PCR 鉴定结果泳道1为以重组质粒作为模板的大亚基PCR鉴定结果；泳道2为以重组质粒作为 模板的小亚基PCR鉴定结果；泳道M为DNA分子量标准(DL-2000)；图5为重组质粒pBBRlMCS-5-TTHBU8经AflIII酶切鉴定结果。泳道M为 DNA 分子量标准(DL-2000)；泳道 1 为 pBBRlMCS-5_TTHB128 经 AflIII 单 酶切的结果；图 6 重组质粒 TTHB 127-pBBRlMCS-5-TTHBl^HindIII 电泳鉴定图。泳道M 为 DNA 分子量标准(DL-15000)；泳道 1 为 TTHB127-pBBRlMCS-5_TTHB128H indIII单酶切鉴定结果。重组质粒TTHB 127-pBBRlMCS-5-TTHB 128 经 HindIII 单酶切后呈现 2500bp 左右及 5000bp左右的两条带图7重组质粒电泳鉴定图。泳道M为DNA分子量标准(DL-15000)；泳道1_5为重组质粒 TTHB127-pBBRlMCS-5-TTHB 128转化宿主恶臭假单胞菌后提取的质粒，泳道6为经鉴定插入 正确的重组质粒 TTHB 127-pBBRlMCS-5-TTHB 128。图8AS-01对As (III)的氧化和菌体密度随时间的变化。
图9优势基因工程菌AS-02对As (III)的氧化和菌体密度随时间的变化。图8、9中□为OD6tltl变化；■为As(III)氧化情况。图10优势基因工程菌AS-02菌遗传稳定性图。生物材料保藏信息本发明所述的恶臭假单胞菌基因工程菌，其分类命名为恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida) AS-02,已保藏于中国典型培养物保藏中心(缩写CCTCC，地址中 国·武汉·武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO :M209215，保藏日期为2009年9月28日。本发明采用的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)AS-01已保藏于中国典型培养 物保藏中心(缩写《^⑶，地址中国 武汉 武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO :M209296, 保藏日期为2009年12月7日。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明。生物材料来源E. coli Dffia是基因工程常用的工具菌种，由南京工业大学许琳赠送，在与基 因工程研究有关的实验室一般也都有保存；嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8) 由许琳购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)并转赠；PMD18-T购自宝生物工程(大 连)有限公司；pBBRlMCS-5和E. coli WD803 (pRK2013)南京农业大学李顺鹏赠送； pseudomonasputidaAS-01 (CCTCC NO :M209296)由南京工业大学徐炎华赠送。分子生物学操作方法质粒提取、聚合酶链反应、限制性核酸内切酶酶切、DNA片 段回收、连接和大肠杆菌转化等实验在基因工程研究领域都是常规操作方法，如无特别说 明均参见《分子克隆实验指南》。实施例IThermus thermophilus HB8中三价砷氧化酶基因的获取A.嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8)中质粒(pTT27)的抽提将Thermus thermophilus HB8 甘油菌接种至 400ml LB 培养中，75°C，200rpm 培 养2-3天，收集菌泥，4，500-6，000Xg,4°C离心lOmin，完全弃去上清液，抽提过程见德国 Macherey-Nagel公司提供的大片段质粒抽提说明书(NucIeoBond ^ra Midi Plus)。B.目的基因 TTHB127、TTHB128 的 PCR 扩增根据NCBI GeneBank中已经公布的嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8)中 三价砷氧化酶(包含大小亚基)基因序列(SEQ No. 1, SEQ ID No. 2)，利用引物设计软件 DNAMar设计了从Hiermus thermophilus HB8的质粒pTT27上扩增大小亚基基因序列的引 物，交由上海申能博彩生物科技有限公司合成。扩增大亚基基因序列对应的引物上游引物5，-AGGTAAGGTATGGCGCTCATTC-3，(SEQID No. 3)下游引物5，-GGCTTAGTCAAACTTGTTCTGC-3，(SEQID No. 4)以提取的质粒ρΤΤ27为模板，扩增ΤΤΗΒ127大亚基基因，PCR反应条件为94°C， 5min, 94°C，Imin，52°C，2min, 72°C，2min, 35 个循环后，72°C，IOmin，4°C保存。扩增小亚基基 因序列对应的引物上游引物5，-ATATGACGCAGACCATGACCCGTAG-3，(SEQID No. 5)
下游引物5，-CTCCTCACACGTTCTTCACGC-3，(SEQID No. 6)以提取的质粒pTT27为模板，扩增TTHB128小亚基基因，PCR反应条件为94°C， 5min，94°C，lmin，55°C，30s，72°C，2min，35 个循环后，72°C，lOmin，4°C保存。C.目的基因片段的回收按照宝生物工程(大连)公司提供的试剂盒(Agarose GelDNA Fragment Recovery Kit VER. 2. 0)说明书回收目的基因片段，片段电泳图见图2。D.目的基因片段连接pMDIS-T载体回收的PCR产物分别与pMD18_T载体连接 (按照宝生物工程(大连)公司提供的试剂盒(pMD 18-TVector)说明书进行连接反应)，连 接产物转化感受态细胞大肠杆菌E. coli DH5 α，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，挑选抗性 克隆，按照上海申能博彩生物科技有限公司提供的^^柱离心式质粒小量抽提试剂盒V3. 1 说明书提取质粒后进行PCR鉴定和酶切鉴定，筛选阳性克隆，分别命名为TTHB127-pMD18-T 和 TTHB128-pMD18-T。Ε.将确认的阳性克隆子测序由南京金思特公司完成。与GenBank Database中已 经发布的嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8)中三价砷氧化酶(包含大小亚基)基 因序列BLAST比对后发现完全正确。实施例2三价砷氧化酶大小亚基基因片段与表达载体pBBRlMCS-5的重组三价砷氧化酶大小亚基基因片段与表达载体pBBRlMCS-5的重组详见图3，具体实 施步骤如下A.用带酶切位点的引物PCR扩增大小亚基基因片段根据表达载体pBBRlMCS-5上多克隆酶切位点设计带有酶切位点(酶切位点以下 划线标出)的引物。大亚基基因序列对应的带有酶切位点引物为上游引物5，_CCTTAATTAATGCGAACTGACAGGATGATTTCTCATGGCGCTCATTCCCCGTAG-3，(SEQ ID No. 7)下游引物5，-GGACTAGTTTAGTCAAACTTGTTCTGCTGC-3‘(SEQ ID No. 8)以提取的质粒TTHB127-pMD18-T为模板，利用上述引物，扩增带有相应酶切位点 的 TTHB127 大亚基基因，PCR 反应条件为 94°C，5min，94°C，lmin，63°C，2. 5min，72°C，2min， 35个循环后，72 °C，IOmin，4°C保存。小亚基基因序列对应的带有酶切位点的引物为上游引物5，-CCGGAATTCATGACGCAGACCATGACCCGTAG-3‘(SEQ ID No. 9)下游引物5，-CGCGGATCCCCTTAATTAATCACACGTTCTTCACGC-3’(SEQ ID No. 10)以提取的质粒TTHB128-pMD18-T为模板，扩增带有相应酶切位点的TTHB128小 亚基基因，PCR 反应条件为 940C，5min, 94°C，lmin, 74°C，30s, 72°C，2min, 35 个循环，72°C， 10min，4°C 保存。B.目的基因片段的回收按照宝生物大连公司试剂盒说明书回收目的基因片段。C.表达质粒的构建和转化(1)目的基因片段(TTHB128)与表达载体的连接将带有酶切位点的小亚基基因片段(TTHB128)用EcoRI和BamHI双酶切，在37°C 下酶切过夜。将载体pBBRlMCS-5同样用EcoRI和BamHI双酶切过夜。
将酶切后的基因片段纯化后与同样酶切纯化后的线性载体片段进行连接反应。连 接产物转化E. coliDH5a感受态细胞，涂布含有庆大霉素的LB平板，挑选抗性克隆，提取质 粒，用PCR鉴定和酶切鉴定筛选鉴定阳性克隆，PCR鉴定结果见附图4(泳道幻；质粒经限制 性内切酶AflIII酶切后得到大小约为IlOObp的小片段，结果见附图5。经PCR鉴定和酶切 鉴定正确的阳性克隆命名为pBBRlMCS-5-TTHB 128。(2)目的基因片段(TTHB127)与表达载体(pBBRlMCS-5_TTHB128)的连接将带有酶切位点的目的基因片段(TTHB127)用I^cI单酶切纯化后再进行SpeI单 酶切，37°C下酶切过夜。将载体PBBR1MCS-5-TTHBU8用同样的酶酶切过夜。将上述酶切后的基因片段纯化后与同样酶切纯化后的线性载体片段进行连接 反应。连接产物转化E.ColiDH5a感受态细胞，涂布含有庆大霉素的LB平板，挑选抗性 克隆，提取质粒，用PCR和酶切鉴定阳性克隆，PCR鉴定结果见附图4(泳道1)；质粒经限 制性内切酶HindIII酶切后得到大小约为^OObp和5000bp的两个片段，结果见附图6， 经PCR鉴定和酶切鉴定正确的阳性克隆命名为TTHB 127-pBBRlMCS-5-TTHB 128，含有质粒 TTHB127-pBBRlMCS-5-TTHB128 的转化菌E. coli DH5 α 命名为 Ε. coli DH5 a (TTHB127-pBB R1MCS-5-TTHB128)。实施例3以pseudomonas putida AS-Ol为宿主菌的基因工程菌的构建(三亲接 合法)(1)供体菌 E. coli DH5a (TTHB127-pBBRlMCS-5_TTHB128)的培养接种单菌落于5mL含庆大霉素(60mg/L)的LB液体培养基中，37°C过夜培养，取 0. 5mL菌液接种于3mL含有同样抗生素的LB液体培养基中，37°C继续培养4- ！。(2)辅助菌 E. coli WD803(pRK2013)的培养接种单菌落于5mL含卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，37°C过夜培养，取 0. 5mL菌液接种于3mL含有同样抗生素的LB液体培养基中，37°C继续培养4- ！。(3)受体菌 P. putida AS-01 的培养接种单菌落于5mLLB培养基中，30°C培养12h待用。(4)接合子的筛选将上述培养好的菌液用无菌水洗涤2遍后，均重悬于5mL新鲜LB培养基中，菌液 体积比按供体菌辅助菌受体菌=2:1:1的比例(该方法参照三亲结合一般方法， 供体菌带有重组质粒，需要量较多)取三种菌液于离心管中混合，稀释后涂布于LB平板中 央的无菌纤维素滤膜上，于30°C培养36h，进行接合。将上述滤膜取下，放在适当无菌水中，在漩涡振荡仪上洗下菌体，适当稀释后，涂 布含500mg/LAs(III)和庆大霉素(60mg/L)的LB平板上，于30°C培养36h。(3)阳性克隆的筛选从上述平板挑取所有克隆，提取质粒，与实施例2中经鉴定正确的最终克隆质粒 做对比，发现条带位置一致，电泳结果见附图7。实施例4优势目标菌株的筛选将实施例3中获得的阳性克隆，在含高浓度亚砷酸盐的LB平板上筛选，不断提高 培养基中亚砷酸盐的浓度，在500mg/L-800mg/L的浓度范围内设置梯度，筛选得到5株能耐 更高浓度的工程菌，对这几株菌株进行As (III)耐性测定，As(III)氧化能力测定以及工程菌稳定性测定，比较各项性能后筛选获取最佳的优势目标菌株。(注未特别说明时，含质 粒TTHB 127-pBBRlMCS-5-TTHB 128的基因工程菌的培养基均加入庆大霉素60mg/L)(1)各菌株对As (III)耐性的比较实验通过逐渐加大LB培养液中As (III)的含量的同时测定OD6tltl来检测所筛选微 生物对砷的耐受性，结果见表1。(2)各菌株对As (III)氧化能力的比较将从含高浓度As (III)的平板上筛选得到的5株重组菌(01_05)与受体菌的种子 液分别接种于50mL LB培养基中，加入As(III)溶液，使其终浓度为10mg/L(由于实验室测 定As (III)仅测量20 μ g/L级以内的，浓度过高可能稀释倍数太高会带来准确度的问题，因 此氧化浓度设的较低)，分别于30°C培养观小时，期间每隔两小时测定0D_，并取一定量菌 液，12000r/min离心^iin后，取上清，稀释一定倍数后，用氢化物发生-原子吸收法测定上 清中As (III)的浓度，并计算氧化率((培养基初始As (III)的浓度-菌体培养若干小时后 培养基As(III)的浓度)/培养基初始As (III)的浓度)，结果见表1，结果表明筛选得到的 01号菌氧化能力最强，达到91.7%。(3)各菌株遗传稳定性测定 将筛选的5株微生物接种于新鲜的含庆大霉素的LB培养基中，培养过夜，按1 %接 种量转接新鲜LB液体培养基中，培养12h，以后转接一次算作一代，分别在含或不含庆大霉 素(60mg/L)的LB培养基中培养，隔10代次取样。取10、20、30、40、50代次培养后的菌体 细胞悬液，12000r/min离心后，取上清，稀释一定倍数后，用氢化物发生_原子吸收法测定 上清中As (III)的浓度，并计算氧化率((培养基初始As (III)的浓度-菌体培养若干小时 后培养基As (III)的浓度)/培养基初始As (III)的浓度)。实验发现筛选得到的工程菌在 不含庆大霉素抗性的平板上传代10次后性状开始丢失，02-05号菌在含庆大霉素的平板上 传代30次以上性状开始丢失，01号菌传代40次以上氧化性状开始急剧丢失，具体数据见表 1。综合(1)，(2)，(3)，经筛选得到的01号菌株对As (III)的耐受性最强，为SOOmg/ L，氧化能力最高，为91. 7 %，且遗传稳定性最强，经传代40代次后氧化能力形状开始急剧 丢失。该菌命名为AS-02，其遗传稳定性见图10。表1 筛选菌株对As (III)耐性、氧化能力及遗传稳定性比较表
权利要求
1.一种恶臭假单胞菌基因工程菌，其分类命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida) AS-02，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M209215。
2.权利要求1所述的恶臭假单胞菌基因工程菌在处理含砷废水中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其中含砷废水为含有500 800mg/L三价砷的废水。
全文摘要
本发明属于基因工程及环境保护领域，公开了一种既能耐受高浓度As(III)又能氧化As(III)的基因工程菌及其应用。该基因工程菌分类命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)AS-02，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM209215。该基因工程菌对As(III)的耐受性达到800mg/L，氧化能力达91.7％，遗传稳定性较好，可用于处理高浓度含砷废水，对降低废水毒性，改善后续处理效果，具有非常重要的环保价值。
文档编号C12R1/40GK102146353SQ200910265238
公开日2011年8月10日 申请日期2009年12月18日 优先权日2009年12月18日
发明者徐炎华, 杨春艳, 杨洁, 许琳, 颜立敏 申请人:南京工业大学