专利名称：一种高通量筛选β-葡聚糖酶热稳定性提高突变体的方法
技术领域：
一种基于96微孔板及酶标仪高通量筛选β “葡聚糖酶热稳定性提高突变体的方 法，属于发酵工程领域。
背景技术：
作为可以工业化生产和应用的β-葡聚糖酶，对酶特性的要求是产酶水平高、 耐热性好、ρΗ稳定、培养条件简单等，其中耐热性和产酶水平是酶工业化生产和应用的 主要问题。目前国内应用的商品酶制剂除少部分饲用酶制剂属国内生产，其余基本是通过 进口或由独资外资企业生产，生产技术都是商业机密。加快进行具有独立自主知识产权 的葡聚糖酶酶制剂的研究和生产，对当前政府号召大力发展生猪养殖，降低老百的 生活消费指数，解决“三农”问题都具有促进作用，降低粮耗，提高料肉比，对应对当 前世界粮食紧缺状况具有重大的战略意义。而国产的酶单位活力和耐热性普遍低于国外 产品，因而限制了在实际生产中的运用。利用定向进化技术提高酶的热稳定性不仅可拓宽酶的工业应用范围，而且可以 研究酶结构与稳定性的关系。定向进化技术的关键是建立合适的突变体库和建立有效的 筛选方法。本发明在建立了突变体库的基础上，通过对细菌生长、酶表达量和酶活性等影 响因素的探索，建立了基于酶标仪、96微孔板和环境压力的热稳定性提高突变体高通量 筛选模型。
发明内容
本发明基于酶标仪、96微孔板和环境压力，建立高通量筛选β-葡聚糖酶热稳 定性提高突变体的方法。1.突变体库的复制1.1从平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有IOOOmL LB培养基(内含30 μ g/ mL卡那霉素)的96深孔板中，每孔对应一特定转化子。每块深孔板同时接种野生型克 隆，作为阳性对照。37°C，200r/min振摇培养12h。1.2在无菌条件下，从96深孔板中取出20 μ L菌液，对应接入含IOOOuL新鲜LB 培养基的另一 96深孔板中，并进行37°C，200r/min振摇培养。4°C临时冷藏种子96深 孔板。2.文库的诱导表达2.137°C，200r/min振摇培养重组菌4h后，每孔加入2g/L IPTG 40 μ L以及 180g/L乳糖100 μ L,混勻后于24°C，200r/min振摇培养6h。在酶标仪上测定OD6tltl并 保存数据后于3000r/min，4°C,离心20min。2.2以每孔一一对应为原则，利用排枪快速移取20 μ L上清粗酶液至两块96PCR反应板中。3.文库上清粗酶液的高温热钝化3.1将其中一块含有粗酶液的96PCR反应板经过80°C金属浴处理0.5h，另一对应 板4°C冷藏。4.文库的酶活表征4.1将两快96PCR反应板40°C预热IOmin后(利用酶标仪加热模块)，每孔 中加入40 °C蓝色葡聚糖底物(使用前和pH 6.5的20mmol/L的磷酸缓冲液1 19混 合)80μ ，混勻后40°C反应lOmin。每孔中加入300 μ L沉淀液，利用低温离心机，于 3000r/min, 4°C,离心20min，利用排枪移上清至两块96反应板中并测定OD59tl吸光值。4.2利用酶标仪软件计算每个克隆(OD59tl,未钝化-OD59tl,热钝化VOD6tltl的数值，以阳 性对照为参考，将结果高于阳性对照的克隆挑出并进行斜面保藏。4.3粗筛阳性突变体用于下一轮复筛。以下对本发明方法作稳定性考察说明利用建立的高通量筛选方法对本研究室构建的工程菌(野生菌)进行筛选，共筛选了 192株重组菌(共8个孔板，每个孔板利用24孔)，筛选一块板按一次实 验计，共计8次实验，其中4次实验(共96个菌落)中的粗酶液经80°C，0.5h处理，另 外4次实验未经高温处理。记下最终OD6tltl在所有未经高温处理孔样OD6tltl平均值士 10% 之内菌株数。利用下列公式计算该方法的稳定性指标(a).精密度未经高温处理四组实验的相对标准偏差RSD(b).重现率=实验成功次数/总实验次数X 100%(c).假阴性率=1-(未经高温处理0D_落在平均值士 10%之内菌落数 /96) X 100%(d).假阳性率=经高温处理后OD6tltl落在平均值士 10%之内菌落数/96X 100%(1)以96微孔板为基础高通量筛选方法精密度表1以96微孔板为基础高通量筛选方法精密度
权利要求
1. 一种高通量筛选β-葡聚糖酶热稳定性突变体的方法，其特征是方法步骤为1.突变体库的复制1.1从平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有1000 μ L LB培养基(内含30 μ g/mL卡 那霉素)的96深孔板中，每孔对应一特定转化子。每块深孔板同时接种野生型克隆，作 为阳性对照。37°C，200r/min振摇培养12h。1.2在无菌条件下，从96深孔板中取出20 μ L菌液，对应接入含IOOOuL新鲜LB培 养基的另一 96深孔板中，并进行37°C，200r/min振摇培养。4°C临时冷藏种子96深孔 板。
2.文库的诱导表达2.137°C，200r/min振摇培养重组菌4h后，每孔加入2g/L IPTG 40 μ L以及180g/L 乳糖100 μ L，混勻后于24°C，200r/min振摇培养6h。在酶标仪上测定OD_并保存数 据后于 3000r/min，4°C,离心 20min。2.2以每孔一一对应为原则，利用排枪快速移取20 μ L上清粗酶液至两块96PCR反应 板中。
3.文库上清粗酶液的高温热钝化3.1将其中一块含有粗酶液的96PCR反应板经过80°C金属浴处理0.5h，另一对应板 4°C冷藏。
4.文库的酶活表征4.1将两快96PCR反应板40°C预热IOmin后(利用酶标仪加热模块)，每孔中加入 40°C蓝色葡聚糖底物(使用前和pH6.5的20mmol/L的磷酸缓冲液1 19混合)80 μ L， 混勻后40°C反应IOmin。每孔中加入300 μ Ll沉淀液，利用低温离心机，于3000r/min，4°C,离心20min，利用排枪移上清至两块96反应板中并测定OD59tl吸光值。4.2利用酶标仪软件计算每个克隆(OD59tl,未钝化-OD59tl,热钝化)/OD6QQ的数值，以阳性对 照为参考，将结果高于阳性对照的克隆挑出并进行斜面保藏。 4.3粗筛阳性突变体用于下一轮复筛。
全文摘要
高通量筛选是一种同时分析多个样本的方式，从大量样本中挑选出符合目标的个体，目前广泛应用于药物开发、酶的发现和改造方面。体外定向进化作为后基因组时代一个重要的技术平台正得到日益广泛的应用。定向进化技术在改造酶的热稳定性方面已表现出一定的优越性，而将这一技术应用在β-葡聚糖酶热稳定性定向进化上国内外尚未有相关报道。采用定向进化技术对β-葡聚糖酶的热稳定性改造过程中，如何快速有效地筛选得到目标突变体是其瓶颈问题之一。本发明建立了基于酶标仪、96微孔板和环境压力的热稳定性提高突变体高通量筛选模型，见附
图1。该发明将96微孔板菌落的诱导表达与菌落的原位复制技术有机结合起来，以β-葡聚糖酶与蓝色葡聚糖底物作用后释放蓝色基团特性为基础，以各孔酶反应液的吸光值大小为指标建立了直观、快速简易的高通量筛选方法。通过该方法可以筛选到热稳定性和催化活性同时提高的变异体且稳定性良好。对该方法的筛选稳定性考察结果显示，其精密度良好，RSD为8.1％，重现性达到100％，假阳性率及假阴性较低，分别为6.25％及2.1％。
文档编号C12Q1/34GK102010887SQ200910264848
公开日2011年4月13日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者刘春凤, 李崎, 李永仙, 秦久福, 郑飞云, 顾国贤 申请人:江南大学