专利名称：一种高纯度耐热β-葡聚糖酶的制备方法
技术领域：
一种制备高纯度重组耐热β-1，3-1，4-葡聚糖酶的方法，属于生化分离工程领 域。
背景技术：
β-1，3_1，4-葡聚糖属植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，是以混合(1-3)和 (1-4) β -糖苷键连接形成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于麦类和糠麸中，在大麦整粒 和胚乳中的含量高达4. 0 % 8. 0 %。β -1，3-1，4-葡聚糖主要被3种葡聚糖内切酶分解， 它们是 β -1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、β -1，3-葡聚糖酶(EC 3.2.1. 39)和 β -1，3-1， 4_葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)。另外，葡聚糖外切酶也起一定的作用。其中作用最强的是 β -1，3-1，4-葡聚糖酶(β -1，3-1，4-D-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶，又称地衣多糖酶，以下简 称β-葡聚糖酶)，它分解β-1，3-1，4-葡聚糖中β_1，3邻接的β_1，4键，其水解的主要 产物为三糖(3-0-β-D-纤维二糖-D-葡萄糖)和四糖(3-0-β-D-纤维三糖-D-葡萄糖)。 该酶早期主要应用于啤酒工业，可降低麦汁粘度，提高麦汁滤速及得率，改善啤酒风味，保 持成品酒稳定性。近年来，饲料工业中发现，β-葡聚糖是谷物的重要抗营养因子，单胃动物 由于自身不具备合成葡聚糖酶的微生物及分解葡聚糖的酶系，使食糜在肠道中具 有较高的粘度，而阻止蛋白质和脂肪营养的吸收，降低饲料的转化率。在饲料中添加葡 聚糖酶，可以大大降低β “葡聚糖粘度，从而改善麦类营养价值，同时减少排泄物对环境的 污染。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种能高效表达重组蛋白的酵母，一方面 由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生 长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。目前应用于蛋白质分离纯化的方法有很多，如硫酸铵分级沉淀、有机溶剂沉淀、沉 淀凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和层析聚焦等。它们的原理和适用范围各不相 同，沉淀法主要用于纯化方案的开始阶段，层析法则主要用于中后期，其中以离子交换层 析最为常用，占所有蛋白质纯化方案的75%，这和它具有的许多优点分不开分辨率高、交 换容量高，有利于放大分离规模、应用灵活、分离原理明确、操作简单。常用的离子交换功 能基团类型有阳离子交换剂CM(羧甲基)、S(磺甲基)，阴离子交换剂DEAE(二乙基胺乙 基)、Q(季胺基)等。本发明以本研究室构建的高产耐热性重组Pichia pastoris GS 115-PpICZaA-bgl为出发菌，对其发酵并进行分离纯化得到电泳纯β _1，3_1，4_葡聚糖酶 样品。主要研究冻融法、酶法和超声破碎法破壁对酶活力的影响，考察硫酸铵分级沉淀的特 点，最后采用离子交换层析获得了较纯的重组酶，并用SDS-PAGE进行鉴定。重组β-葡聚 糖酶粗酶液经过硫酸铵分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析，纯化倍数为22. 57倍，回收率 为20. 06%，最终比活力达到17674U/mg。SDS-PAGE鉴定表明纯化后的重组β -葡聚糖酶为 一单一条带，分子量大小约为27kDa。
发明内容
本发明基于蛋白质盐析技术、蛋白质离子交换技术以及电泳技术，建立了简易便 捷的高纯度耐热β-1，3-1，4-葡聚糖酶的制备工艺。1.将重组毕赤酵母划线于YPD平板上进行活化，28°C培养2d，至长出单菌落后接 种于IOmL BMGY液体培养基中，于30°C，200r/min摇床培养48h，OD6tltl达2 6，3000r/min 离心5min收集菌体，弃上清，用无菌纯净水洗涤菌体1-2次。2.将菌体用BMMY诱导培养基稀释至0D_ = 1，用4层纱布代替棉花塞，于30°C， 200r/min摇床培养。每天补加甲醇至终浓度为0. 5% (V/V)，诱导3d后每隔24h从BMMY培 养基中取出ImL菌液于1.5mL离心管中，然后补加ImL BMMY于三角瓶中。3.将一定量发酵液置于_20°C冷冻过夜，37°C解冻，离心去除菌体，获取粗酶液A。4.量取一定量的粗酶液A，加入20%的硫酸铵，静置0. 5h，4°C，8000r/min离心 20min,取上清至另一离心管中，增加硫酸铵的浓度至40 %，静置0. 5h，4 °C，IOOOOg离心 30min，弃上清，加入pH. 6. 5磷酸缓冲液复溶沉淀，得到粗酶液B。5.将粗酶液B装入处理好的透析袋中，置于去离子水中4°C下过夜，中间更换去离 子水数次。6.将透析后的酶液上样DEAE-650M离子交换柱(2. 6 X 40cm，0. 02mol/L pH6. 5NaH2P04-Na2HP0^1冲液预平衡，柱体积 IOOmL)，上样量 50mL，依次用含 0、0. 1,0. 2mol/ L NaCl 的 0. 02mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 缓冲液(pH 6. 5)洗脱，2mL/min 计时收集。7.取离子交换后精制酶液进行SDS-PAGE分析，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为 12%，电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，获得其纯度数据，经相关软件分析，所获酶样 品β-1，3-1，4-葡聚糖酶纯度达到90%以上。8.所获高纯度β-1，3-1，4-葡聚糖酶4°C冷藏。重组β -葡聚糖酶粗酶液经过硫 酸铵分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析，纯化倍数为22. 57倍，回收率为20. 06 %，最终比 活力达到17674U/mg。SDS-PAGE鉴定表明纯化后的重组β -葡聚糖酶为一单一条带，分子 量大小约为27kDa。生物材料样品保藏一株高产耐温性β-葡聚糖酶毕赤酵母，该菌株为巴斯德毕赤酵母，命名为 Pichia pastoris GS115_pPICZ α A_bgl，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 3520，保藏日期为2009年12月17日。
图1硫酸铵分级沉淀图。图2DEAE-650M离子交换层析图。图3蛋白样品SDS-PAGE电泳图。
具体实施例方式实例1基于本发明的制备步骤，经过硫酸铵沉淀以及离子交换层析对基因工程菌Pichiapastoris GS115_pPICZ α Α-bgl发酵液进行分离纯化得到电泳纯β _1，3-1，4_葡聚糖酶样 品。纯化倍数为22. 57倍，回收率为20. 06%，最终比活力达到17674U/mg。SDS-PAGE鉴定 表明纯化后的重组β-葡聚糖酶为一单一条带，分子量大小约为27kDa，经相关软件计算， 蛋白样品中目标β -1,3-1,4-葡聚糖酶纯度达到90%以上。表1重组β -葡聚糖酶纯化过程总结
权利要求
一种制备高纯度耐热β 1，3 1，4 葡聚糖酶的方法，其特征是方法步骤为1.将重组毕赤酵母划线于YPD平板上进行活化，28℃培养2d，至长出单菌落后接种于10mL BMGY液体培养基中，于30℃，200r/min摇床培养48h，OD600达2～6，3000r/min离心5min收集菌体，弃上清，用无菌纯净水洗涤菌体1～2次。2.将菌体用BMMY诱导培养基稀释至OD600＝1，用4层纱布代替棉花塞，于30℃，200r/min摇床培养。每天补加甲醇至终浓度为0.5％(V/V)，诱导3d的后每隔24h从BMMY培养基中取出1mL菌液于1.5mL离心管中，然后补加1mLBMMY于三角瓶中。3.将一定量发酵液置于 20℃冷冻过夜，37℃解冻，离心去除菌体，获取粗酶液A。4.量取一定量的粗酶液A，加入20％的硫酸铵，静置0.5h，4℃，8000r/min离心20min，取上清至另一离心管中，增加硫酸铵的浓度至40％，静置0.5h，4℃，10000g离心30min，弃上清，加入pH 6.5磷酸缓冲液复溶沉淀，得到粗酶液B。5.将粗酶液B装入处理好的透析袋中，置于去离子水中4℃下过夜，中间更换去离子水数次。6.将透析后的酶液上样DEAE 650M离子交换柱(2.6×40cm，0.02mol/L pH6.5NaH2PO4 Na2HPO4缓冲液预平衡，柱体积100mL)，上样量50mL，依次用含0、0.1、0.2mol/L NaCl的0.02mol/L NaH2PO4 Na2HPO4缓冲液(pH6.5)洗脱，2mL/min计时收集。7.取离子交换后精制酶液进行SDS PAGE分析，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，电泳结束后用考马斯亮蓝R 250染色，获得其纯度数据，经相关软件分析，所获酶样品β 1，3 1，4 葡聚糖酶纯度达到90％以上。8.所获高纯度β 1，3 1，4 葡聚糖酶4℃冷藏。
2.将菌体用BMMY诱导培养基稀释至0D_= 1，用4层纱布代替棉花塞，于30°C，200r/ min摇床培养。每天补加甲醇至终浓度为0. 5% (V/V)，诱导3d的后每隔24h从BMMY培养 基中取出ImL菌液于1. 5mL离心管中，然后补加ImLBMMY于三角瓶中。
3.将一定量发酵液置于-20°C冷冻过夜，37°C解冻，离心去除菌体，获取粗酶液A。
4.量取一定量的粗酶液A，加入20%的硫酸铵，静置0. 5h，4°C，8000r/min离心20min， 取上清至另一离心管中，增加硫酸铵的浓度至40%，静置0. 5h，4°C，IOOOOg离心30min，弃 上清，加入pH 6. 5磷酸缓冲液复溶沉淀，得到粗酶液B。
5.将粗酶液B装入处理好的透析袋中，置于去离子水中4°C下过夜，中间更换去离子水 数次。
6.将透析后的酶液上样DEAE-650M离子交换柱(2.6 X 40cm，0. 02mol/L pH6. 5NaH2P04-Na2HP0^1冲液预平衡，柱体积 IOOmL)，上样量 50mL，依次用含 0、0. 1,0. 2mol/ L NaCl 的 0. 02mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 缓冲液(ρΗ6· 5)洗脱，2mL/min 计时收集。
7.取离子交换后精制酶液进行SDS-PAGE分析，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12 %， 电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，获得其纯度数据，经相关软件分析，所获酶样品 β -1,3-1,4-葡聚糖酶纯度达到90%以上。
8.所获高纯度β-1，3-1，4-葡聚糖酶4°C冷藏。
全文摘要
本发明以本研究室构建的高产耐热性重组Pichia pastoris GS115-pPICZαA-bgl为出发菌，对其发酵液进行提取并分离纯化得到电泳纯β-1，3-1，4-葡聚糖酶样品。主要研究冻融法、酶法和超声破碎法破壁对酶活力的影响，考察硫酸铵分级沉淀和乙醇分级沉淀的特点，最后采用离子交换层析获得了较纯的重组酶，并用SDS-PAGE进行鉴定。重组β-葡聚糖酶粗酶液经过硫酸铵分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析，纯化倍数为22.57倍，回收率为20.06％，最终比活力达到17674U/mg。SDS-PAGE鉴定表明纯化后的重组β-葡聚糖酶为一单一条带，分子量大小约为27kDa。
文档编号C12N9/24GK101921737SQ20091026484
公开日2010年12月22日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者刘春凤, 李崎, 李永仙, 秦久福, 郑飞云, 顾国贤 申请人:江南大学