专利名称：基于靶蛋白亲和选择的活性成分高通量筛选方法
技术领域：
本发明涉及高通量筛选领域，具体涉及一种基于靶蛋白亲和选择的活性成分或活性成分 群的高通量筛选方法，为一种利用多维色谱-质谱联用筛选对靶蛋白具有高亲和力的活性成分 特别是活性成分群的方法。
背景技术：
在创新药物研究过程中，发现具有生物活性的先导化合物(Lead Compoimds)是全部研 究工作的基础。目前，先导化合物的筛选大多采用动物、器官(组织)和细胞水平的筛选模 型，虽然从中筛选到一些有效药物，但是这种方法的筛选费用较高、所需化合物样品量大、 费吋费力、实验周期长，因此不适用于含量较低的天然产物的筛选，更不适合进行大规模、 高通量的筛选。
随着后基因时代的到来，人们对疾病过程有了更深刻的认识，明确了越来越多的生物大 分子(如酶、受体、离子通道等)在生理、病理过程中的关键作用，而分子生物学技术的成 熟又为蛋白质分子在人体外表达提供了工具。应用基因重组技术将与疾病相关的重要酶、受 体等蛋白在合适的表达系统中表达，从而可以建立以分子为靶向的分子或细胞水平的高通量、 超高通量筛选模型(参见Broach J. R., Thoner J. High-throughput screening for drug discovery. iVfi(,",e， 1996， 384:14; Landro J. A.， Taylor I. C., Stirtan W. G, et al. HTS in the new millennium: the role of pharmacology and flexibility. J尸Aa尸附flco/ Tox/co/Me幼o必，2000, 44: 273-289; 陈苏 红，王华，王升启.基于细胞功能的超高通量筛选在化学基因组学药物发现中的应用.国外医 学药学分册，2002， 29: 345-348等)。虽然这种高通量筛选技术以其快速、高效等优势发展成为 现代新药发现过程中的三项主要技术之一，但该技术无分离过程和化合物鉴定功能，因此只 适用于结构已知的单体化合物(群)的筛选，在应用于天然产物提取物，特别是中药提取物 等复杂体系时往往会由于各类成分之间的相互干扰而得出一些假阴性或假阳性结果(参见 Bogustavasky J. HTS assay development: Is smaller really better Drug Discov. Dev.， 2004, 7: 37-40)。
生物色谱法是一种可以考察化合物复杂体系(如中药提取物)对酶、受体、细胞膜等结 合情况的一种较新的方法，该方法是以硅胶或凝胶为载体，其上涂敷或键合上活性酶、受体 或细胞膜等制备成色谱固定相，根据药物与酶、受体或细胞膜的相互作用的强弱不同将不同
的成分分离开来，但该方法在实际使用中存在诸多遗憾。例如1、酶、受体或细胞膜与硅胶等载体结合后其生物学特征会受到一定的影响。2、该方法对色谱流动相有着严格的限制，即 只能以生理缓冲液或极低浓度的有机溶剂作为流动相，否则会破坏生物大分子，这样使色谱 利用不同流动相而实现不同性质的化合物的分离的特点难以发挥，化合物在生物色谱上难以 实现彼此的相互分离。在"毛希琴等，三种色谱模式联用在中药活性成分初步筛选中的应用， 分析化学，2003， 31 (8): 992-995"的文献中，有川芎在模拟生物膜色谱柱、蛋白色谱柱和 反相柱上的分离图谱，显而易见生物膜色谱的分离效能不理想，不如反相色谱柱。3、生物色 谱的制备程序因为增加了硅胶介质与酶、受体或细胞膜等的结合过程，过程复杂，条件严格， 成本较高，如市售的蛋白柱高达上万元一个。4、因为所用的流动相是缓冲液，提供的图谱对 化合物的分离效果不好且不能与LC-MS在线联用，不能给出化合物的结构信息。(参见孔 亮等，以人血清白蛋白为固定相的分子生物色谱分子几种中药活性成分的研究，高等学校化 学学报，2000， 21: 36。贺浪冲等，固定在硅胶表面细胞膜的酶活性及其色谱特性，科学通 报，1999 (6): 633-637。赵小娟等，淫阳藿根与叶活性成分的分析和比较，分析化学，2002， 30 (2): 195-197。高琨等，用细胞膜色谱法筛选研究红毛七中的有效成分，中国药学杂志， 2003 (1): 14-16。)
发明内容
本发明要解决的问题在于建立一种基于靶蛋白亲和选择的既能适用结构已知的单体化 合物或化合物群，又能适合结构信息缺乏的复杂天然产物群(如中药提取物)的高通量活性 成分的筛选方法。本发明可以避免因固定化导致靶蛋白生物学特性改变而影响到小分子化合
物筛选的准确性，同时还可以利用高效液相—质谱系统(LC-MS)的强大分离和结构鉴定能 力，在筛选得到活性小分子(群)的同时在线获得其结构信息，以便快速的从化合物(群) 或中药复杂体系中寻找具有活性的先导化合物或中药有效成分群。
本发明的高通量筛选方法依次包括如下abc三个步骤
a、将靶蛋白与待测化合物或待测化合物群在缓冲液中共孵育，此时有活性的待测化合物 与靶蛋白结合成靶蛋白-活性成分复合物，孵育得到的混合溶液中包括靶蛋白-活性成分复合 物和没有与靶蛋白结合的游离小分子化合物，将混合溶液上样于分子排阻色谱柱(size exclusion chromatography, SEC)或在线固相提取柱(online solid-phase extraction, SPE)，用缓 冲液洗脱，洗脱液于SEC或第一根SPE后流经紫外检测器，在蛋白的最大紫外吸收波长280nm 下检测，靶蛋白-活性成分复合物先出峰并被检测出现第一个色谱峰，该色谱峰进入线圈，色 谱峰后的洗脱液切换入废液。由于下面的步骤中还会用到SPE，因此这一步的SPE称为SPE,， b步骤用到的SPE称为SPE2。所述待测化合物可以是单体化合物，或由单体化合物组成的化合物群，还可以是含有未 知成分的复杂的中药提取物。待测化合物如果能与靶蛋白结合成复合物，则该待测化合物是 对该靶蛋白相关疾病有效的药物，具体有效程度依赖后面的方法测试计算。如果待测化合物 是单体化合物，则复合物是靶蛋白-活性成分复合物，如果待测化合物是化合物群，则复合物 是靶蛋白-活性成分群复合物，本发明更适合于化合物群的高通量筛选，为了简化均简称为靶 蛋白-活性成分复合物。
上述靶蛋白与待测化合物孵育所用缓冲液和洗脱SEC或SPE,所用缓冲液一般保持一致， 优选自pH6.0~8.0的磷酸盐缓冲液、pH6.0~8.0的三羟甲基氨基甲垸缓冲液、pH6.0~8.0乙酸 铵缓冲液或PH6.0~8.0碳酸氢铵缓冲液。
孵育体系要兼顾靶蛋白的高活性和化合物小分子的溶解性。有些化合物，尤其是天然产 物群(如中药提取物)中化合物极性较小，在缓冲盐体系中不溶解，需要选择合适的溶媒使 二者共存，如加入低浓度的增溶剂等。增溶剂的选择基于不破坏或基本不破坏靶蛋白的活性。 在实际操作过程中，靶蛋白可以承受的增溶剂的比例可以通过实验来检验。例如通过Ellman 分光光度分析法证明乙酰胆碱酯酶在含有5%甲醇的缓冲盐体系中活性几乎不受影响。
孵育时缓冲液中优选加入增溶剂，所述增溶剂优选自吐温、二甲基亚砜、聚乙二醇、曲 拉通、甲醇、乙醇中的一种或几种的混合溶液。优选的增溶剂体积占缓冲液体积的比例为 0.1-5%。
将待测化合物与靶蛋白在缓冲液中混合形成均相的混合体系，根据化合物成分的稳定性 可选择不同的孵育温度。如果待测化合物中含有较多的挥发性成分，则优选4'C的孵育温度， 否则选择25t:-37'C的孵育温度，孵育时间优选0.5-1.5小时。
分子排阻色谱优选Sephadex G-25、 Sephadex G-50或Sephadex LH-20。洗脱流速优选 0.3-0.5ml/min。
在分子排阻色谱分离中，孵育样品上样于3-5cm分子排阻色谱柱(SEC)上，用缓冲液 加以洗脱，洗脱液于SEC后通过紫外检测器280nm检测，靶蛋白-活性成分复合物于l-4min 内被首先洗脱下来。由于凝胶填料能承受的压力有限，洗脱流速以0.3-0.5ml/min为宜。在洗 脱过程中，靶蛋白-活性成分复合物周围几乎没有游离小分子化合物，复合物与小分子化合物 的动态平衡被不断打破，结合于靶蛋白上的小分子不断解离下来，所以凝胶层析过程越短越 好，只要能将蛋白质大分子与小分子化合物分离开即可。另外，将靶蛋白-活性成分复合物与 游离小分子化合物相分离亦可选择在线固相提取柱(SPE)，如Waters公司的OASIS HLB柱 及原理相似的其他在线固相提取柱。这种SPE如HLB采用亲水亲脂的水可浸润性反相吸附 剂为填料，对蛋白质、缓冲盐等极性大物质几乎不予保留，对极性有机化合物有很好的保留作用，且可以承受高达170bar压力，高流速(2-4ml/min)洗脱使柱内产生湍流，靶蛋白-活 性成分复合物在湍流中快速通过HLB进入线圈，大大减少了结合于复合物上的活性成分的提 前解离。同时，未结合的大量小分子化合物被保留于SPE上不进入线圈。
b、 将洗脱液与解离液混合进行解离。a步骤中含有靶蛋白-活性成分复合物的洗脱液与解 离液混合形成解离溶液，解离溶液中与靶蛋白结合的活性成分被解离成游离化合物，解离溶 液上样于线圈后的在线固相提取柱(SPE2)，并于上样后用高流速水溶液冲洗SPE2以除去吸 附其上的靶蛋白和缓冲盐，活性成分不会被冲洗掉而保留于柱上；
解离溶液上样于SPE2柱后，优选用高流速水溶液(2-4ml/min)冲洗l-3min，除去靶蛋 白和缓冲盐。SPE2在高流速水溶液冲洗下会形成湍流色谱，对靶蛋白等生物大分子不予保留 而对有机小分子能够很好的保留。
上述检测方法中，线圈可以为lml 5ml的环状折叠线圈，用于将解离液和含有耙蛋白-活性成分复合物的洗脱液混合。靶蛋白-活性成分复合物解离所用解离液优选酸水溶液或酸水 溶液与有机溶剂的混合溶液。酸水溶液优选三氟乙酸、甲酸、乙酸或盐酸，pH优选l-3。有 机溶剂优选甲醇或乙腈。两者混合溶液中有机试剂所占体积比优选为5%~30%。本发明采用 的解离液可有效的将靶蛋白-活性成分复合物进行解离。
SPE2于线圈后起到了活性成分在线富集作用(见附图1)，根据待测化合物性质的不同选 择相应的SPE2，如Waters公司Oasis系列在线色谱柱或原理相近的其他SPE柱。
结合于靶蛋白上的活性成分浓度很低，以至于一般情况下无法达到质谱检测限。SPE2能 够有效的富集目标化合物而除去靶蛋白、缓冲盐等干扰物质。根据所筛选化合物的性质选择 合适的SPE2,如碱性化合物宜选择Waters公司的Oasis MCX在线色谱柱、Oasis WCX在线 色谱柱等，酸性化合物宜选择Waters公司的Oasis MAX在线色谱柱、Oasis WAX在线色谱 柱等，而Waters公司的Oasis HLB在线色谱柱可富集所有有机化合物，亦可选择与上述SPE 原理相近的其他SPE对目标化合物进行富集与去除蛋白。
上样于SPE2上的化合物优选用溶液高流速冲洗，根据化合物性质不同，待测化合物如 果是碱性化合物，则用碱水冲洗同时碱化；待测化合物如果是酸性化合物用酸水冲洗同时酸 化，碱水优选氨水溶液或二乙胺水溶液；酸水优选三氟乙酸水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶 液或盐酸水溶液。蛋白质、缓冲盐等被冲洗入废液，活性成份保留于SPE2上。
c、 将b步骤的在线固相提取柱(SPE2)上的活性成分切换至高效液相一质谱系统(LC-MS) 进行分析，对筛选到的活性成分进行结构确证，并对其进行定量分析，计算这些活性成分对 于靶蛋白的结合率，以此对其活性进行预测。
SPE2被冲洗除去靶蛋白和缓冲盐后直接切换至LC-MS进行分析，优选通过六通切换阀、
八通切换阀或十通切换阀切换。富集于SPE2上的活性成分被流动相溶液(流动相溶液优选含 甲醇或乙腈水溶液)洗脱入C18反相色谱柱进行分离，随后经质谱检测获得其活性成分的结 构信息。
解离溶液顺流上样于SPE2，活性成分集中富集于SPE2前段，六通(或八通、十通)阀 切换后流动相溶液反冲于SPE2上，活性成分被反冲入反相色谱分析柱，这样就使活性成分集 中进入色谱柱进行分离，在合适的色谱梯度洗脱下，活性成分混合物经SPE2-LC-MS同样可 得到很好的分离效果和色谱峰型(见附图3)。
1. 活性成分对于靶蛋白的结合率计算
通过比较样品中小分子化合物经SEC/SPE广SPE2-LC-MS的峰面积和经二通-SPE2-LC-MS的峰面积，可以推算出各活性成分的结合率。具体公式如下
结合率(％) JEC掘-LC掘勺峰面积x腦 二通-SPE2 - LC - MS的峰面积
通过本发明对化合物的筛选，可以高效快速的从大量化合物中筛选出具有对耙蛋白高亲 和力的可能的活性成分。通过结合率可以对筛选到的成分进行初步的活性预测。
2. 滴定法计算待测化合物的动力学常数
靶蛋白以酶为例，如果被测化合物与一已知酶抑制常数(Ki)的化合物竞争酶上的同一 位点，则被测化合物的Ki可以通过"滴定"的方式测定。被测化合物作为被滴定剂与酶孵育一 段时间后分别加入不同浓度的滴定剂，即已知Ki的化合物。随着滴定剂浓度的增加，被滴定 剂逐步被置换出酶的活性位点。样品通过上述筛选方法检测到的滴定剂与被滴定剂的峰面积， 即可计算出被测化合物的Ki。计算公式oKi2 [ES2〗[S2]0Kh
其中[ES!]为酶-滴定剂复合物浓度(在该方法中为滴定剂的质谱峰面积)，[ES2]为酶-被滴 定剂复合物浓度(在该方法中为被滴定剂的质谱峰面积)，[S,]o为加入滴定剂总浓度，[S2]o 为被滴定剂总浓度，Ki,为滴定剂的Ki， Ki2为被滴定剂的Ki (待求Ki)。由上得Ki2 = [ESd[S2]oKi,/([ES2][Si:M。(参见D. Allen Annis，* Nairn Nazef, Cheng-Chi Chuang, et al. A General Technique To Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric versus Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures. 乂爿Af. C7/￡M. 5"OC. 2004, 126, 15495-15503)。
通过以上c步骤得到的化合物的分子量和碎片信息或与标准品化合物进行比对，对筛选 到的活性成分(群)进行结构确证。同时，根据以上计算出的结合率的大小对其活性进行初
步评价。
除上述步骤进行化合物筛选，并计算其结合率和动力学常数外，还可以通过质谱方法测 定筛选到的活性化合物对靶蛋白的的半数抑制浓度(IC5Q)和通过Lineweaver Burk作图法 计算筛选到的活性化合物对酶的抑制常数(Ki)，从而更好地判断筛选到的化合物的药理学活 性。
1、活性成分对靶蛋白ICM)的测定
以酶为例，具体方法是将酶的底物与不同浓度的被测化合物均匀混合，加入酶液引发 催化反应，在一定时间终止反应，样品除蛋白后用质谱检测其产物增加量或底物减少量，能 够抑制酶50%活性的被测化合物的浓度即为其IC5o。用同样的条件与方法测定阳性药物的 IC50，将被测化合物IC50与阳性药物IC50加以比较，即可得出被测化合物对靶标酶抑制活性 的大小。
2 、 Lineweaver Burk作图法 在不同底物浓度下对酶反应速率和底物浓度进行Lineweaver Burk作图，可计算该酶催 化特定底物的米氏常数Km和最大反应速度Vmax。在不同抑制剂浓度下，根据不同底物浓度 所做直线相交的位置判断被测化合物对酶的抑制类型，对不同浓度被测化合物相应的反应速 度公式进行二次作图即可计算出被测化合物对酶的抑制常数(Ki)。
利用本发明的高通量筛选方法，所有来自人体和动物的与疾病密切相关的活性蛋白均可 作为筛选化合物的靶标。优选的靶蛋白来自于人体或动物组织的与老年痴呆、心血管疾病或 肿瘤疾病相关的酶或受体。目前有大量商品化的蛋白可以购买，亦可自己进行纯化制备，靶 蛋白一般(如酶或受体)高浓度溶解于缓冲盐溶液中，-20°。分装保存，以保持靶蛋白的活性。 具体筛选化合物时可根据文献资料和预实验选择合适的靶蛋白，如文献显示甾体生物碱有胆 碱酯酶抑制活性，那么即可选择胆碱酯酶作为筛选甾体生物碱群的耙蛋白。
运用本筛选方法，通过SPE,的分离，靶蛋白-活性成分(群)复合物20秒全部进入线 圈(见附图2),经过1.5min的在线前处理后即可直接进行LC-MS分析，比目前报道的最快 的在线样品前处理省时2min以上(参见Jimmy Flarakos， Kenneth L. Morand， and Paul Vouros. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin, 厶a/. C/z棚.2005, 77， 1345-1353.)。这大大提高了从化合物(群)中筛选活性成分(群)的效 率，是一种操作相对简单，成本较低的高通量药物筛选方法。运用本发明的筛选方法，发明 人己从由27个甾体类生物碱组成的单体化合物中筛选出了 11个与丁酰胆碱酯酶有高亲和力 的成分(见附图3)，对这11个成分进行了进一步的活性测试，其中4个成分的IQo小于10pM， 而同等条件下阳性化合物加兰他敏对BChE的ICso为3.23jiM，这充分说明了本发明用于高通
量筛选活性化合物的可行性。
图l是靶蛋白亲和选择活性成分在线筛选装置图。1.分子排阻色谱柱/HLB等固相提取柱2.
紫外检测器3.线圈4.六通(或八通、十通)切换阀5. C18反相色谱分析柱6.质谱检测
器。,是靶蛋白一活性成分复合物，S是靶蛋白， 一是游离小分子化合物。
图2是靶蛋白-活性成分复合物通过第一根SPE的280nm的检测图谱。本筛选方法SPE选用
Waters公司的OASIS HLB在线固相萃取柱，图中l.靶蛋白-活性成分(群)复合物2.未与
靶蛋白结合的游离的小分子化合物
图3(I) 27个甾体生物碱组成的单体化合物的总离子流图
(II) (A) ~ (F)由上而下分别是生物碱标准品提物离子流图、结合于AChE上的活 性成分提取离子流图、结合于BChE上的活性成分提取离子流图。其中(A) l.ebeienine 2.solasodine 3.puqiedinone 4.川贝酮5. ebeiedinone (B) 6.去甲蒲贝酮碱 7.puqiedine 8.ebeiedine (C) 9.贝母辛 IO.蒲贝双酮(D) ll.西贝素 12.浙贝乙素 13.蒲贝酮碱 (E) 14.puqiedine 7-01 15.浙贝甲素 16.异浙贝甲素 (F) 25.西贝素苷26.蒲贝酮碱苷。
具体实施例方式
实施例1
老年痴呆疾病相关靶点的药物筛选
筛选由27个甾体生物碱组成的单体化合物中对乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)具有高亲和力的成分。
被筛选的单体化合物由27个甾体生物碱组成，分别是蒲贝素A、蒲贝素B、蒲贝素C、 蒲贝素D、蒲贝素E、蒲贝素F、贝母辛、西贝素、西贝素苷、蒲贝酮碱、蒲贝酮碱苷、N-去甲蒲贝酮碱、伊贝碱苷A、浙贝甲素、浙贝甲素N-oxide、浙贝乙素、川贝酮、puqiedine-7-01 、 puqiedinone 、 puqiedine 、 p叫ietinedinone 、 veratridine、 ebeienine、 ebeiedinone 、 ebeiedine 、 solasodine、 isoverticine.将其一一进行活性筛选是一个耗时，费力，效率又低的过程。采用本 发明筛选方法可以快速的从中寻找出与乙酰胆碱酯酶具有高亲和力的可能的活性成分。
AChE的制备乙酰胆碱酯酶冻干粉2000U (Acetylcholinesterase from electric eel, Sigma),用2ml乙酸铵缓冲液(10mM，pH7.5)充分溶解，配制成1000U/ml，置-20。C冰箱中 分装备用。
甾体生物碱溶液的配制27个甾体生物碱用甲醇溶解，每个甾体生物碱的浓度为25)aM， 再用乙酸铵缓冲液(10mM， pH7.5)稀释至浓度为2jaM。
筛选20plAChE溶液(1000U/ml)与20^1甾体生物碱溶液(2pM)均匀混合，在25'C 环境下静置lh。40ul孵育溶液上样于SPEl(Waters Oasis HLB)，乙酸铵缓冲液(10mM, pH7.5) 2ml/min洗脱20s，洗脱液(2ml/min)与解离液(0.2%三氟乙酸水溶液含20%乙腈，lml/min) 混合于线圈(2ml)解离lmin，同时解离后样品上样于SPE2 (Waters Oasis MCX)，此时六通 切换阀处于附图1的上样(LOAD)位置，用二乙胺水溶液(pH 10.0)4ml/min冲洗SPE2 lmin, 随后将六通切换阀切换至附图1的进样分析(INJECT)位置，富集于SPE2上的小分子化合 物被洗脱入LC-MS系统进行分离分析。另外，在相同条件下，用二通代替SPE1，相同样品 经过如上步骤进入LC-MS分离分析。
色谱与质谱分析条件C18色谱柱，高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱(HPLC-ESI/TOF
MS);流动相乙腈水(各含0.05%二乙胺)剃度洗脱；ESI离子源；正离子模式，质量范 围400 800m/z;喷雾毛细管电压3500 V;干燥气(N2)流速9.0L/min;干燥气温度 325°C;雾化压力35psi;传输电压150V。各生物碱的[M + H]+离子的质荷比(m/z)分别为 蒲贝素A， 446;蒲贝素B， 444;蒲贝素C， 460;蒲贝素D， 460;蒲贝素E， 442;蒲贝素F， 476;贝母辛，428:西贝素，430;西贝素苷，592;蒲贝酮碱，430;蒲贝酮碱苷，592; N-去甲蒲贝酮碱，416;伊贝碱苷A， 576;浙贝甲素，432;浙贝甲素N-oxide， 448;浙贝乙素， 430;川贝酮，414; puqiedine-7-Ol ， 432; p叫iedinone， 414; puqiedine, 416; p叫ietinedinone， 428; veratridine， 674; ebeienine， 414; ebeiedinone， 414; ebeiedine416; solasodine， 414; isoverticine， 432。
检测结果:从27个甾体生物碱组成的单体化合物屮筛选出9个与AChE具亲和力的成分， 见附图3。分另ij是veratridine， puqiedine， ebiedine， ebeiedi醒e，蒲贝酮碱，蒲贝酮碱苷，蒲 贝双酮，川贝酮，蒲贝素B。它们与1UAChE的结合率分别是0.01%, 0.01°/。， 0.008%， 0.01%, 0,01%, 0.005%, 0.01%, 0.02%， 0.005%。其中川贝酮和ebeiedinone对AChE的1(250分别为 99|iM、 79)iM。同等条件下加兰他敏对AChE的ICso为0.45pM。
实施例2
老年痴呆疾病相关耙点的药物筛选
筛选由27个甾体生物碱组成的单体化合物中对丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinestemse, BChE)具有高亲和力的成分。
被筛选的单体化合物组成同实施例1。
BChE的配制丁酰胆碱酯酶冻干粉1200U(Butyrylcholinesterase from equine serum, Sigma)， 用3ml乙酸铵缓冲液(10mM，pH7.5)充分溶解，配制成400U/ml，置-20。C冰箱中分装备用。
甾体生物碱溶液的配制27个甾体生物碱用甲醇溶解，每个甾体生物碱的浓度为50|aM， 再用乙酸铵缓冲液(10mM， pH7.5)稀释至浓度为4pM。
筛选30^1 BChE溶液(400U/ml)与lOpl甾体生物碱溶液(4pM)均匀混合，在25。C 环境下静置lh。 40ul孵育溶液进样于SPEl，其余步骤同实施例l。 色谱与质谱分析条件同实施例1。
检测结果从27个甾体生物碱组成的单体化合物中筛选出11个与AChE高亲和力结合 的成分(见附图3)。分别是veratridine， puqiedine， ebiedine， ebeiedinone，蒲贝酮碱，蒲贝 酮碱苷，蒲贝双酮，川贝酮，异浙贝甲素，浙贝乙素，伊贝碱苷A。它们与BChE的结合率 分别是0.82%, 0.80%, 2.18%, 1.84%, 0.39%, 0.19%, 0.24%, 0.89%, 0.44%, 0.39%, 0.17%。其中 四个化合物对BChE的IC50小于10pm，分别是ebeiedinone 9.07|xM， ebeiedine 4.48(xM， puqiedine 8.49|aM,川贝酮9.09pM。同等条件下加兰他敏对BChE的IC50为3.23|aM。由此可 知，这类甾体生物碱对丁酰胆碱酯酶有较好的抑制活性。
实施例3
心血管疾病相关靶点的药物筛选
筛选由17个贝母类甾体生物碱组成的单体化合物中对血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme, ACE， sigma)具有高亲禾卩力的成分。
被筛选的单体化合物由17个甾体生物碱组成，分别是蒲贝素E、蒲贝素A、蒲贝素B、 蒲贝素C、蒲贝素D、 p叫iedine、蒲贝酮碱、蒲贝酮碱苷、蒲贝双酮、ebeidinone、 ebeidine、 浙贝甲素、浙贝乙素、西贝素、西贝素苷、贝母辛、伊贝碱苷A。
ACE的制备血管紧张素转化酶冻干粉6U (Angiotensin Converting Enzyme from rabbit lung,Sigma)，用200ul乙酸铵缓冲液(10mM, PH7.5)充分溶解，配制成30U/ml，置-20。C冰 箱中分装备用。
甾体生物碱溶液的配制17个贝母类甾体生物碱用甲醇用甲醇溶解，每个甾体生物碱的 浓度为25nM，再用乙酸铵缓冲液(10mM，PH7.5)稀释至浓度为2(xM。
筛选2(^1 ACE溶液(30U/ml)与20^1贝母类甾体生物碱溶液(2pM)均匀混合，在 25'C环境下静置lh。 40ul孵育溶液进样于SPE1。其余步骤同实施例1。
色谱与质谱分析条件同实施例1。
检测结果从17个贝母类甾体生物碱组成的单体化合物(群)中初步筛选出3个与AChE 高亲和力结合的成分。分别是蒲贝素E、蒲贝素A、蒲贝素B，结合率分别为0.4%, 0.01%, 0.005%。 实施例4
肿瘤疾病相关耙点的药物筛选
筛选对组蛋白去乙酰基酶6 (Histonedeacetylase6， HDAC6)具有高亲和力的成分。 被筛选化合物氯化筒箭毒碱，Trapoxin (TPX) 、 FK228、曲古抑菌素A。 HDAC6的酉己制HDAC6冻干粉50ug，用200ul乙酸铵缓冲液(10mM，PH7.5)充分溶
解，配制成250ug/ml,置-2(TC冰箱中分装备用。
被筛化合物溶液的配置氯化筒箭毒碱，Trapoxin (TPX) 、 FK228、曲古抑菌素A用乙
酸铵缓冲液(10mMPH7.5)溶解，每个化合物浓度为2pM。
筛选20(J HDAC溶液(250ug/ml)与20pl被筛化合物混合溶液(2|_iM)均匀混合，
在25'C环境下静置lh。 40ul孵育溶液进样于SPEl。其余步骤同实施例l。 色谱与质谱分析条件同实施例1
检测结果氯化筒箭毒碱，Trapoxin (TPX) 、 FK228、曲古抑菌素A对HDAC6均有结 合，结合率分别为2%，0.5°/。， 1.2%, 1%。氯化筒箭毒碱，Tmpoxin(TPX) 、 FK228、曲古抑菌 素A为HDAC6的抑制剂，在本实验中作为阳性药物对本筛选方法进行验证。初步证实了本 发明适合于肿瘤疾病相关靶点的药物筛选。
权利要求
1、一种基于靶蛋白亲和选择的活性成分高通量筛选方法，包括筛选活性化合物，将筛选到的活性化合物导入高效液相质谱系统进行分析，进行化合物结构确证，并对其进行定量分析，计算这些活性成分对于靶蛋白的结合率，评价其活性，其特征是筛选活性化合物包括如下步骤a、将靶蛋白与待测化合物在缓冲液中共孵育，孵育溶液上样于分子排阻色谱柱或在线固相提取柱，用缓冲液洗脱柱子，洗脱液流经紫外检测器，在吸收波长280nm下检测并收集首先出峰的洗脱液；b、将洗脱液与解离液混合进行解离，解离溶液上样于在线固相提取柱，靶蛋白和缓冲盐流出柱子，而活性成分保留在线固相提取柱上；c、洗脱b步骤得到的保留活性成分的在线固相提取柱，洗脱液进入高效液相-质谱系统进行分析。
2、 权利要求1的高通量筛选方法，还包括用质谱方法对筛选到的活性成分进行活性评价。
3、 权利要求1的高通量筛选方法，其中待测化合物是单体化合物、由单体化合物组成的化合 物群或含有未知成分的中药提取物。
4、 权利要求l的高通量筛选方法，其中靶蛋白选自于人体或动物组织的与老年痴呆、心血管 疾病或肿瘤疾病相关的酶或受体。
5、 权利要求1的高通量筛选方法，其中缓冲液选自pH6.0~8.0的磷酸盐缓冲液、pH6.0 8.0 的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、pH6.0~8.0乙酸铵缓冲液或pH6.0 8.0碳酸氢铵缓冲液。
6、 权利要求1的高通量筛选方法，其中孵育缓冲液中还含有增溶剂，所述增溶剂选自吐温、 二甲基亚砜、聚乙二醇、曲拉通、甲醇、乙醇中的一种或几种。
7、 权利要求l的高通量筛选方法，其中分子排阻色谱柱填料选自Sephadex G-25、 Sephadex G-50或Sephadex LH-20,洗脱流速0.3-0.5ml/min;
8、 权利要求1的高通量筛选方法，其中在线固相提取柱选自Oasis MCX在线色谱柱、Oasis WCX在线色谱柱、Oasis MAX在线色谱柱、Oasis WAX在线色谱柱或Oasis HLB在线色谱柱。
9、 权利要求1的高通量筛选方法，其中在线固相提取柱洗脱流速是2-4ml/min。
10、 权利要求1的高通量筛选方法，其中解离液是酸水溶液或酸水溶液与有机试剂的混合溶 液，所述酸水溶液选自三氟乙酸、甲酸、乙酸或盐酸，pH为l-3;所述有机试剂选自甲醇或 乙腈。
全文摘要
本发明涉及医药领域，具体涉及高通量筛选领域，涉及一种基于靶蛋白亲和选择的活性成分或活性成分群的高通量筛选方法，本发明通过将靶蛋白与待测化合物在缓冲液中孵育，孵育得到的混合溶液上样于分子排阻色谱柱或在线固相提取柱，缓冲液洗脱，洗脱液经解离，解离液再经在线固相提取柱分离，最后导入高效液相-质谱系统进行分析，进行化合物结构确证，并对其进行定量分析，计算这些活性成分对于靶蛋白的结合率，以评价其活性。本发明的筛选方法大大提高了从化合物群中筛选活性成分(群)的效率，是一种操作相对简单，成本较低的高通量药物筛选方法。
文档编号G01N27/64GK101339167SQ20081012461
公开日2009年1月7日 申请日期2008年8月27日 优先权日2008年8月27日
发明者周建良, 安婧婧, 萍 李, 李会军 申请人:中国药科大学