专利名称：：Glp-1受体激动剂生物学活性测定方法
技术领域：
：本发明涉及生物活性测定方法，更具体的说涉及GLP-I受体激动剂的生物活性测定方法。
背景技术：
：糖尿病已成为威胁人类生命健康的重大疾病，糖尿病药物研究中GLP-I受体激动剂占据着越来越重要的地位药品评价.2009，24(1):32-33；药品评价.2008，5(11):504-505;GLP-l受体激动剂主要有胰高血糖素样肽_1(GLP-I)、促胰岛素分泌肽(Exendin-4)、人GLP-I类似物利拉鲁肽(Liraglutide)，其生物学活性的测定由于没有活性测定国际标准品而成为一大难点中国生物制品学杂志.2004，17(1):29-31。GLP-I受体激动剂的生物学功能主要是特异性地与胰岛细胞的GLP-I受体相互作用，引起相应的信号通路改变，诱导胰岛素的分泌。根据这些生物学功能，测定其生物学活性目前主要有三大类动物实验ChinJChinPharmacolTher2004,9(5):527_531、淀粉酶释放分析实验及细胞测定实验。动物实验通常需要模型动物，不易获取、成本高，而且只能统计分析是否有活性，只能进行定性分析；淀粉酶释放分析实验的敏感性较差，线性关系不好，仅能作为半定量实验。细胞测定实验包括第二信使(cAMP)酶链免疫反应分析实验药物分析杂志。2006,26(12):1691-1693和化学发光物测定实验南开大学学报.2007,40(1):92_98。前者是对信号通路改变过程中cAMP的测定，但由于cAMP在细胞内不稳定存在，易被降解，且cAMP可由多种途径产生，因此专一性不高；再者，使用到的RIN-5F细胞并不是对GLP-I受体这一类激动剂都灵敏，没有普遍的适用性。化学发光物测定实验需要构建特定的细胞，使之能分泌特定的酶催化底物化学发光，需要花费大量的成本和较高的技术力量生物化学与生物物理进展.2004，31(4)36-40；生物技术通报.2007，3:118_121。而且这两者都只是对中间产物的测定，并不是针对GLP-I受体激动剂的生物学功能(诱导分泌胰岛素)这一原理设计的。相比较而言，本发明的设计就紧密结合这个药理学原理来设计，专一的对终产物胰岛素进行测定，更能体现出药品的实际效果，使得方法更合理、更科学、更实用。其优势具体表现在首先，本方法可得到GLP-I受体激动剂促进分泌胰岛素的效应曲线，以此测定GLP-I受体激动剂的生物学活性，能够得出相对精确的效价。而现有的通过模型动物的方法只能定性的确定GLP-I受体激动剂是否有促进分泌胰岛素的作用。其次，本方法中测定关键物是胰岛素，它是GLP-I受体激动剂与GLP-I受体相互作用后，引起相应的信号通路改变，诱导的最终产物，稳定性高，基本不受细胞内其它物质的影响。且本发明的设计紧密结合GLP-I受体激动剂的药理学原理，专一针对终产物胰岛素，更能体现出药品的实际效果，使得方法更合理、更科学、更实用。而现有的实验方法，不论是以cAMP，还是以化学发光物为目标检测物的细胞试验方法，这两者都只是对中间产物的测定，易降解，不稳定，且中间产物有多种产生途径。再者，化学发光物测定法所需的细胞需要特定构建，才能使之能分泌能被检测的化学发光物质，需花费大量的成本、较高的技术力量和较长的时间。而本发明用到的Min-6细胞培养条件简单，生长容易，便于操作。
发明内容本法系根据GLP-I受体激动剂可以促进小鼠胰岛瘤细胞(Min-6)分泌胰岛素的作用，用小鼠/大鼠胰岛素试剂盒定量分泌的胰岛素，于波长450nm，参比波长590nm处测定其吸光度，可得到GLP-I受体激动剂诱导Min-6细胞分泌胰岛素的效应曲线，以此测定GLP-I受体激动剂生物学活性。由于GLP-I受体激动剂作用于Min-6细胞有一定的葡萄糖浓度要求，本发明通过调节培养基葡萄糖的浓度，在加标准品供试品前使用无糖的培养基培养靶细胞，并用高糖测定培养基溶液稀释标准品供试品，提高Min-6细胞的敏感度。本发明中稀释标准品和供试品的测定培养基的葡萄糖浓度优选为25mM至75mM，更优选为50mM。本法对于用消化液制成的细胞悬液的浓度有一定的要求；在本发明中，细胞悬液的密度优选为5XIO5个/ml。本法对于细胞加入无糖DMEM培养基后的培养时间有一定的要求；在本发明中培养时间优选为1-6小时，更优选为2-4小时。本法对于检测样品加入细胞培养基后的培养时间有一定的要求；在本发明中培养时间优选为4-6小时。附图1为GLP-I(7-36)生物学活性测定实验结果。附图2为Exendin-4生物学活性测定实验结果。附图3为葡萄糖浓度为16.7mM时，GLP-I标准品与安慰剂生物活性对比图。附图4为葡萄糖浓度为25mM时，GLP-I标准品与安慰剂生物活性对比图。附图5为葡萄糖浓度为50mM时，GLP-I标准品与安慰剂生物活性对比图。附图6为葡萄糖浓度为75mM时，GLP-I标准品与安慰剂生物活性对比图。附图7为葡萄糖浓度为16.7mM时，Exendin-4标准品与安慰剂生物活性对比图。附图8为葡萄糖浓度为25mM时，Exendin-4标准品与安慰剂生物活性对比图。附图9为葡萄糖浓度为50mM时，Exendin-4标准品与安慰剂生物活性对比图。附图10为葡萄糖浓度为75mM时，Exendin-4标准品与安慰剂生物活性对比图。附图11为其他实验条件不变的情况下，改变无糖培养基的培养时间，测定细胞分泌胰岛素的对比图。附图12为其他实验条件不变的条件下，改变细胞种板密度，测定细胞分泌胰岛素的对比图。附图13为其他条件不变的情况下，改变加标准品后的培养时间，测定细胞分泌胰岛素的对比图。附图14为其他条件不变的情况下，加标准品后的培养时间为4小时和8小时的对比图。具体实施例方式实施例1用本法测定重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)(GLP-1(7-36))的生物学活性试剂与材料(I)DMEM高糖培养基取DMEM高糖培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释至1000ml，其中丙酮酸钠终浓度为lmmol/L、HEPES终浓度为0.5%，加青霉素IO5IU和链霉素105IU、碳酸氢钠3.7g，溶解后，混勻，除菌过滤，4°C保存。(2)完全培养基量取胎牛血清10ml，加DMEM高糖培养基90ml，4°C保存。(3)测定培养基(50mM葡萄糖)DMEM高糖培养基88ml，加10%BSA2ml、250mM葡萄糖溶液10ml。(4)10%BSA取BSA10g，WIOOml水溶解并稀释至100ml，除菌过滤，_20°C保存。(5)PBS取氯化钠8.0，氯化钾0.20g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸氢二钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121°C15分钟灭菌。(6)消化液取2.5g胰酶、乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8.0，氯化钾0.20g，磷酸氢二钠1.152g，磷酸氢二钾0.2g，加水溶解并稀释至1000ml，除菌过滤，-20°C保存。(7)250mM葡萄糖溶液取葡萄糖(H2O)Ig,加20ml无糖DMEM培养基溶解后，混勻，除菌过滤，4°C保存。(8)靶细胞株小鼠胰岛瘤细胞(Min-6)由上海市糖尿病研究所赠送，本室传代并保存。(9)RAT/MOUSEINSULINKIT试剂盒LINCO公司生产，货号EZRMI-I3K(10)标准品、供试品大肠杆菌为宿主细胞表达的重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)冻干制剂标准品溶液的制备取重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)标准品，用测定培养基稀释至500ug/ml。在1.5ml离心管中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。供试品溶液的制备取重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)供试品，用测定培养基稀释至500ug/ml。在1.5ml离心管中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。实验方法使Min-6细胞在完全培养基培养基中，37°C、5%二氧化碳条件下培养。取对数生长期的细胞，用PBS洗后，消化液消化制成细胞悬液，调整细胞密度至5.OXIO5个/ml。加细胞悬液于96孔培养板中IOOul/孔，CO2培养箱培养40h。除去细胞上清，加PBS200ul/孔，弃去上清，再加PBS200ul/孔，弃去上清，如此清洗2次后，加入无糖DMEM培养基IOOul/孔，继续培养4h。除去细胞上清，加PBS清洗2次，加入稀释好的不同浓度(500ug/ml-250ug/ml-125ug/ml-62.5ug/ml_31.25ug/ml_15.6ug/ml_7.8ug/ml_3.9ug/ml)的标准品及供试品溶液IOOul/孔，每个浓度做2个平行，同时设立测定培养基对照，在37°C、5%二氧化碳条件下继续培养2h。收集上清，稀释5倍后，用胰岛素试剂盒检测。检测波长为450nm，参比波长为590nm。最后用四参数回归计算法进行数据分析，计算，得出诱导胰岛素50%最大刺激反应的稀释倍数。单位定义以能诱导胰岛素50%最大刺激反应的稀释倍数为8000个单位(即AU)。供试品效价(AU/ml)=标准品效价X(A供试品/A标准品)X(ED50供试品/ED50标准品)A供试品、A标准品供试品、标准品预稀释倍数ED5tl供试品、ED5tl标准品供试品、标准品半效量稀释倍数结果如图1，数据如下标准品ED50标准品=25.384,A标准品=0.8，标准品效价=8000AU/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>供试品(批号2OO8O6Ol)=ED50供试品=20.965,Amtsh=0.2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>供试品(批号2OO8O7Ol)=ED50供试品=24.041，Amtsh=0.2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>供试品(批号20080706)=ED50供试品=25.149，Amtsh=0.2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>实施例2用本法测定Exendin-4生物学活性。实验材料、方法与实施例1操作基本相同。供试品溶液的制备取Exendin-4供试品，用测定培养基稀释至50ug/ml。在1.5ml离心管中，做2倍系列稀释。实验结果见图2，数据如下标准品※度ug/ml25062.515.633.910.9760.2440.061横坐标135791113OD值0.824~0.764一0.5950.4370.392~0.3570.349_0.8240.7440.5810.4370.35T"0.34~0.3420.8240.7540.5880.4370.3730.3490.346供试品<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>如图2所示，样品和标准品曲线平行，有线性，根据ED5tl，在确定标准品效价后即可测定样品效价，证明了方法的可行性。实施例3稀释用测定培养基在不同葡萄糖浓度条件下测定标准品GLP-I(7-36)的生物活性的结果对比。实验材料、方法与实施例1操作基本相同(无供试品)。测定培养基的葡萄糖浓度分别配置为17.5mM，25mM，50mM及75mM。实验结果见图3、4、5和6。由图3、4、5和6的对比可知，提高葡萄糖的浓度有利于细胞分泌胰岛素，不同浓度的标准品分泌胰岛素的量表现出明显的量效关系，与安慰剂的对比更趋于明显。实施例4稀释用测定培养基在不同葡萄糖浓度条件下标准品Exendin-4的生物活性测定结果对比。实验材料、方法与实施例2操作基本相同(无供试品)。测定培养基的葡萄糖浓度分别配置为17.5mM，25mM，50mM及75mM。实验结果见图7、8、9和10，其对比结果和实施例3相似，都显示出了提高葡萄糖浓度有助于提高测定生物活性的精确性，而其测量效果在50mM时最佳。实施例5改变细胞加入无糖DMEM培养基后的培养时间，细胞分泌胰岛素的测定结果对比。实验材料方法与实施例1基本相同(无供试品，无8个稀释度)，取重组人GLP-I(7-36)标准品，用测定培养基稀释至500ug/ml，进行测定。改变细胞加入无糖DMEM培养基后的培养时间，分别在培养2、4、5、6、12、16、20、24、30小时后，测量细胞胰岛素的分泌情况，其实验结果见图11。从图中可以明显看出培养2小时、4小时后产胰岛素量最高，最有利于定量检测。实施例6改变细胞的密度，细胞分泌胰岛素的测定结果对比。实验材料方法与实施例1基本相同(无供试品，无8个稀释度)，取重组人GLP-I(7-36)标准品，用测定培养基稀释至500ug/ml，进行测定。细胞用PBS洗后，调整消化液消化制成细胞悬液的密度，其细胞密度调整为5XIO5个/ml，5.5XIO5个/ml，6.0XIO5个/ml，6.5XIO5个/ml，7.0XIO5个/ml，7.5XIO5个/ml，8.0XIO5个/ml和9.0XIO5个/ml，其结果见图12。从图中可以明显看出当细胞浓度为5X105时，产胰岛素量最高，最有利于检测。实施例7改变加入标准品后的培养时间，细胞分泌胰岛素的测定结果对比。实验材料方法与实施例1基本相同(无供试品，无8个稀释度)，取重组人GLP-I(7-36)标准品，用测定培养基稀释至500ug/ml，进行测定。在加入500ug/ml标准品后，分别在37°C、5%二氧化碳条件下，继续培养0.5、1、2、3、4、6及16小时后，进行检测，实验结果如图13所示。从图中可以明显看出4小时到6小时之间有明显的跳跃，选这样的时间点比较合适，实施例8加入标准品后的继续培养8小时，与实施例1中培养时间为4小时的细胞胰岛素分泌情况进行对比。实验材料方法与实施例1基本相同(无供试品)，取重组人GLP-I(7-36)标准品，用测定培养基稀释至500ug/ml，进行测定。在加入500ug/ml标准品后，在37°C、5%二氧化碳条件下，继续培养8小时后，进行检测。其结果如图14所示。从图中可知，继续培养8小时后(大于6小时)，不同标准品浓度的点落在斜线上的趋于减少少，大量的点落在两端(上、下平台)，不利于检测，所以4-6小为佳。权利要求一种GLP-1受体激动剂生物活性检测方法，其步骤包括(a)培养合适的检测用靶细胞株；(b)制备若干个稀释浓度的GLP-1受体激动剂标准品溶液及供试品溶液(c)取对数生长期细胞菌株，经过处理过程，加入步骤(b)中制备的标准品及供试品溶液，并继续培养；(d)收集上清稀释后，用胰岛素试剂盒检测得到GLP-1受体激动剂诱导检测细胞分泌胰岛素的效应曲线；(e)计算GLP-1受体激动剂的活性。2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于所述的GLP-I受体激动剂为GLP-1，Exendin-4,或它们的类似物。3.如权利要求1中所述的方法，其特征在于步骤(a)中所述的检测用靶细胞株为小鼠胰岛瘤细胞株Min-6。4.如权利要求1中所述的方法，其特征在于步骤(b)中所述的若干稀释度的GLP-I受体激动剂标准品及供试品溶液由高葡萄糖浓度溶液配置稀释。5.如权利要求1中所述的方法，其特征在于步骤(c)中所述的处理过程包括(a)用PBS洗后，加入消化液消化制成细胞悬液，并调整细胞密度，加细胞悬液于培养板，继续培养；(b)除去细胞上清，加PBS清洗，加入无糖DMEM培养基，继续培养；(c)除去细胞上清，加PBS清洗，加入稀释后的标准品溶液及供试品溶液，继续培养；6.如权利要求1中所述的方法，其特征在于步骤(d)中所用的检测波长为450nm，参比波长为590nm。7.如权利要求1中所述的方法，其特征在于步骤(e)中，所述的计算GLP-I受体激动剂的方法为四参数回归计算法。8.如权利要求4中所述的方法，其特征在于所述的高葡萄糖溶液葡萄糖浓度范围为25mM至75mM09.如权利要求8中所述的方法，其特征在于所述的高葡萄糖溶液葡萄糖浓度为50mM。10.如权利要求5步骤(a)中所述的方法，其特征在于所述的细胞密度为5X105个/mlο11.如权利要求5步骤(b)中所述的方法，其特征在于所述的继续培养时间为1至6小时。12.如权利要求11中所述的方法，其特征在于所述继续培养时间为2至4小时。13.如权利要求5步骤(c)中所述的方法，其特征在于所述的继续培养时间为4至6小时。全文摘要本发明涉及生物活性测定方法，更具体的说涉及GLP-1受体激动剂的生物活性测定方法。本法系根据GLP-1受体激动剂可以促进小鼠胰岛瘤细胞(Min-6)分泌胰岛素的作用，用小鼠/大鼠胰岛素试剂盒定量分泌的胰岛素，并通过一系列条件优化过程来提高测定的精确度，于波长450nm，参比波长590nm处测定其吸光度，得到GLP-1受体激动剂诱导Min-6细胞分泌胰岛素的效应曲线，以此测定GLP-1受体激动剂生物学活性。文档编号C12Q1/02GK101798588SQ200910265928公开日2010年8月11日申请日期2009年12月21日优先权日2009年12月21日发明者李克坚,梁成罡,蔡永青,陈霞申请人:上海华谊生物技术有限公司