石刁柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记及其应用
【专利摘要】本发明涉及石刁柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记及其应用，其中所述着丝粒标记为Texas red标记，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。以标记的该序列作为探针与石刁柏根尖中期染色体进行荧光原位杂交，在染色体的着丝粒位置产生集中且清晰明亮的杂交信号。本发明所开发的着丝粒标记可用于石刁柏遗传图谱着丝粒位置的遗传定位，并可为石刁柏的核型分析、粗线期FISH和fiber?FISH等细胞学实验奠定基础。
【专利说明】
石刁柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记及其应用
技术领域
[0001]本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及一种可用于石刁柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记及其应用。
【背景技术】
[0002]DNA荧光原位杂交(FISH)技术是20世纪70年代末80年代初在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术。该技术是根据核酸碱基互补配对原则，将经过标记的外源核酸(探针)与染色体经过变性的单链DNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子。由于探针自身带有荧光物质，或在后续的检测过程中所用到的抗体上带有荧光物质，因此可利用荧光显微镜直接观察所研究的目的序列在细胞或染色体上的位置和分布。最早发展起来的FISH技术是基于有丝分裂中期染色体的。然而，随着研究的不断深入，中期染色体的分辨率已经不能满足研究者的需要。为了提高FISH的空间分辨率，逐渐发展起来了以拉长的中期染色体、减数分裂粗线期染色体和拉伸的染色质纤维等为靶DNA载体的FISH新技术。比如，减数分裂粗线期染色体FISH已被应用于许多植物物理图谱的构建。这些技术可大幅提高FISH的分辨率，但是，由于靶载体没有明显的着丝粒和次缢痕等形态标记，所以需要结合着丝粒、次缢痕等标记才有利于染色体的鉴别和杂交信号的定向。所以，合适的着丝粒标记可为对一个物种进行深入的细胞学研究奠定基础。着丝粒的功能高度保守，在细胞有丝分裂和减数分裂过程中负责染色体的均等分离，从而起到确保遗传物质稳定传递的重要作用，但其DNA组成成分却差异较大，具有物种特异性。
[0003]石刁柏又名芦笋，是百合科天门冬属的多年生重要经济作物。其嫩茎富含多种营养成分，在国际上享有“蔬菜之王”的美誉。石刁柏是典型的雌雄异株植物，其遗传组成为2η=20，包含5对长的亚中着丝粒染色体，2对为中等大小的亚中着丝粒染色体，3对为小的短中部着丝粒染色体。芦笋的性染色体为第5条长染色体(L5)，其性染色体Χ、Υ在形态上是同形的。近年来，对石习柏的研究主要集中在营养成分、分子标记等方面，对其细胞学的研究相对滞后，这主要是由于石刁柏的细胞质浓厚，细胞壁较坚硬，处理细胞比较困难，且石刁柏染色体较小，很难获得形态清晰、分散良好的分裂相。对石刁柏着丝粒标记的研究还未见报道。
【发明内容】
[0004]鉴于目前技术存在的上述不足，本发明提供石刁柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记及其应用，本发明所开发的着丝粒标记可用于石刁柏遗传图谱着丝粒位置的遗传定位，并可为石刁柏的核型分析、粗线期FISH和fiber-FISH细胞学实验奠定基础。
[0005]本发明的采用如下技术方案:
石刁柏染色体焚光原位杂交的着丝粒标记，所述着丝粒标记为Texas red标记，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。
[0006]作为本发明的优选技术方案，采用引物对F: 5，-CAACCCCCCACTTATCCT，R: 5 ’ -CGGCAATATACACAGATAC，以石刁柏基因组DNA为模板进行PCR扩增。
[0007]作为本发明的优选技术方案，PCR反应的体系为:IU的TaqDNA聚合酶，2 yL的dNTP,100-200呢的基因组0嫩，其中上下游引物各0.1 ymol/L。
[0008]本发明提供的石刁柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记方法，包括以下步骤:
石习柏根尖中期染色体的制备；
探针的标记；
荧光原位杂交；
荧光观察。
[0009]本发明提供的石习柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记的应用，在石习柏染色体荧光原位杂交中的应用。
[0010]作为本发明的优选技术方案，在石刁柏遗传图谱着丝粒位置的遗传定位上的应用。
[0011]本发明的涉及的石习柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记及其应用，其中所述着丝粒标记为Texas red标记，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。以标记的该序列作为探针与石刁柏根尖中期染色体进行荧光原位杂交，在染色体的着丝粒位置产生集中且清晰明亮的杂交信号。本发明所开发的着丝粒标记可用于石刁柏遗传图谱着丝粒位置的遗传定位，并可为石刁柏的核型分析、粗线期FISH和fiber-FISH等细胞学实验奠定基础。
【附图说明】
[0012]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0013]图1为本发明中实施例1通过PCR得到的石刁柏着丝粒标记序列的电泳图
图2为本发明中以石刁柏根尖中期染色体为靶DNA，分别以Texas red荧光素标记的着丝粒标记序列和Alexa Fluor_488荧光素标记的45S+5S作为探针，进行荧光原位杂交的图片。
【具体实施方式】
[0014]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0015]实施例1
如图1所示，石刁柏着丝粒标记序列的获得，具体为:
1、石刁柏着丝粒标记序列的来源，该序列是通过高通量测序组装的序列进行验证时所发现的。利用Illumina HiSeq2000测序技术对雄性和雌性石刁柏基因组进行了测序，测序结果共获得了 17 Gb的序列(12倍覆盖率)，序列组装后共获得163，406个scaffolds，其长度达到400 Mbp，占石刁柏基因组的30%。随机挑取20个scaffold，设计序列特异性引物从石刁柏基因组中扩增序列并进行测序来验证测序及组装数据的可靠性。本发明所用的石刁柏着丝粒标记序列是以scaffold5783序列设计引物扩增得到的。
[0016]2、石刁柏着丝粒标记序列的PCR扩增，以石刁柏基因组DNA为模板，以为引物进行PCR扩增。PCR反应的体系为:I U的Taq DNA聚合酶，2 yL的dNTP，100-200 ng的基因组DNA，其中上下游引物各0.1 Wi1l/L，补充双蒸水至终体积25此。在PCR仪上按下面的循环参数进行PCR扩增:94 °C预变性2 min后，95 °C变性30 s，53 °C退火30 s，72 °C延伸I min，共35个循环，最后72 °C延伸10 min，扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录(图1)，其中在图1中，泳道I为Marker，泳道2是扩增产物。
[0017]3、石刁柏着丝粒标记序列的克隆，PCR产物电泳后切胶回收目的片段，连入pEASY-Tl载体(购自Transgen公司)，进行测序。测序结果为该序列长885 bp，序列参照序列表SEQID勵:1中，与8(^€化1(15783中相应的序列一致。81&5^分析没有发现与该序列同源的序列，为未知序列。
[0018]实施例2
石刁柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记，着丝粒标记为Texas red标记，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示，
其中采用引物对F: 5 ’ -CAACCCCCCACTTATCCT，R: 5 ’ -CGGCAATATACACAGATAC，以石刁柏基因组DNA为模板进行PCR扩增，进一步，PCR反应的体系为:I U的Taq DNA聚合酶，2 yL的dNTP,100-200呢的基因组0嫩，其中上下游引物各0.1 ymol/L。
[0019]实施例3
石刁柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记方法，包括以下步骤:
步骤S1:根尖中期染色体的制备，具体为在培养皿中铺2-3层滤纸，用水浸湿，放上石刁柏种子，25 °C培养5-7天至根长为1.5-2 cm。切取根尖放入N2O气室中处理1_3 h，压强为10atm (1.01 Mpa)。然后用90%乙酸冰上固定根尖10 min。将根尖水洗后切下2 mm长的根尖生长点部分转入20 μΙ^/Κ冷的酶液中(1% pectolyase Y-23和2% Onozuka R-10)，放入37 °C的水浴中2 h。酶解完成后用70%乙醇重悬两次，倒出乙醇，留40 yL乙醇，用解剖针捣碎根尖，涡旋几秒钟或用手指弹击管壁几次悬浮细胞，4000 rpm离心20 S，小心倒置PCR管于滤纸或吸水纸至乙醇完全流尽。放离心管于冰上，加30 yL无水乙酸，涡旋或用枪头轻轻吹吸混匀，将片子摆放在保温盒中，吸5-8此滴片，滴片后盖住保温盒，室温放置5 min后即可镜检。
[0020]步骤S2:探针的标记，具体为将纯化后的PCR产物检测浓度后标记探针，着丝粒标记用Texas red焚光素进行标记，45S+5S用Alexa Fluor_488焚光素进行标记。将下列组分在冰上加入管中:PCR产物 2 yg，10 Xnick translat1n buffer 2 yL，Labeled_dNTP(Texas red-dCTP或Alexa Fluor-488_dUTP)0.5 pL,Non-1abeIed-dNTPs 2 yL，DNApolymerase I 5 pL,DNaseI 0.5 yL，用去离子水补至20 yL。枪头吹吸混勾，PCR仪中15 °C
2h，加5XTAE+140 ng/yL鲑精DNA 175 yL，加90%乙醇-10%乙酸钠500 yL，涡旋混匀，-20°C过夜，13000 rpm离心30 min，100%乙醇洗两遍，小心倒掉乙醇，注意不要把沉淀倒掉，将离心管放在滤纸上，避光室温30 min，加2XSSC IXTE 20 yL (约100 ng/yL)。
[0021]步骤S3:荧光原位杂交，具体为准备探针溶液，每张片子上加6uL，用2XSSC IXTE稀释探针，一般一张片子上探针量不超过200 ng/yL。在一个金属容器中铺上纸巾，喷湿，片子置于其上，将探针溶液滴到片子上有染色体的地方，盖上塑料盖玻片，并用盒子将有片子的地方罩住，将金属容器置于水浴中，沸水5 min，然后将片子放入杂交盒中，55 °C过夜。将片子取出，在2XSSC中洗片，加上一滴含抗淬灭剂的DAPI，盖上长盖片(22 cmX40 cm),约10 min后镜检。Olympus BX63焚光显微镜观察，CO)拍照，Metamorph软件进行染色体分析，Photoshop进行图像处理。
[0022]步骤S4:荧光观察，具体为用安装有C⑶摄像头的OlympusBX63荧光显微镜观察荧光信号，用MetMorph成像系统软件进行原位杂交图像的摄取和采集。Photoshop进行图像的加工和处理。结果如图2a所示，通过荧光显微镜可以观察到明亮的杂交信号，其中在图2中，是以石刁柏根尖中期染色体为靶DNA，分别以Texas red荧光素标记的着丝粒标记序列和Alexa Fluor_488荧光素标记的45S+5S作为探针，进行荧光原位杂交的图片。A为DAPI复染的染色体，B为Texas red荧光素标记的着丝粒标记序列的信号，C为Alexa Fluor-488荧光素标记的45S+5S的信号，D为A、B和C的合成图。
[0023]实施例4
石习柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记的应用，可以在石习柏染色体荧光原位杂交中的应用，以及在石刁柏遗传图谱着丝粒位置的遗传定位上的应用，并可为石刁柏的核型分析、粗线期FISH和fiber-FISH等细胞学实验奠定基础。
[0024]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1.石习柏染色体焚光原位杂交的着丝粒标记，其特征在于，所述着丝粒标记为Texasred标记，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。2.根据权利要求1所述的石习柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记，其特征在于，采用弓 I 物对 F: 5 ’ -CAACCCCCCACTTATCCT，R: 5 ’ -CGGCAATATACACAGATAC，以石刁柏基因组 DNA 为模板进行PCR扩增。3.根据权利要求2所述的石习柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记，其特征在于，PCR反应的体系为:IU的Taq DNA聚合酶，2 yL的dNTP，100-200 ng的基因组DNA，其中上下游引物各0.1 ymol/L。4.石刁柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记方法，其特征在于，包括以下步骤: 石习柏根尖中期染色体的制备； 探针的标记； 荧光原位杂交； 荧光观察。5.石习柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记的应用，其特征在于，在石习柏染色体荧光原位杂交中的应用。6.根据权利要求5所述的石习柏染色体荧光原位杂交的着丝粒标记的应用，其特征在于，在石刁柏遗传图谱着丝粒位置的遗传定位上的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105950725SQ201610314188
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】高武军, 李书粉, 侯翠翠, 袁金红, 邓传良
【申请人】河南师范大学