专利名称：Cenpe基因的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种CENPE基因的用途。
背景技术：
细胞周期是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，包括间期和分裂期。细胞分裂期时发生遗传物质的复制和分配，即染色质DNA的复制与有丝分裂期姐妹染色体的分离，这些事件的开始都受到精确的调控，并且事件执行过程中的错误可以被修正。有丝分裂过程中染色体的运动和分离是由定位于染色体着丝粒部位的动点复合物与动态的微管的相互作用来调节的。CENPE基因编码中心体相关蛋白E(CENPE，又名KIF10，NM_001813)，分子量约为312KD，其N端具有ATP依赖的动力区段，而尾端则富含卷曲螺旋。CENPE于分裂中前期聚集于中心体上的中心粒区域，发挥驱动蛋白的作用；在与动粒结合后则通过尾部结合微管，在维持稳定的动点一微管连接和执行纺锤体检查点功能中起到关键作用。在多种细胞系中抑制CENPE的表达，显示细胞分裂中期染色体失去正确排列。CENPE被报道在有丝分裂过程中被Cdkl、MAPK、Mpsl与Aurora激酶家族成员等多种激酶磷酸化，而上述作用与这些磷酸化有着紧密联系。细胞正常的分裂、增殖、分化与衰老维持着机体自身的稳定，细胞周期的异常会导致这一系列过程的紊乱，从而产生包括肿瘤在内的多种疾病。由CENPE参与调控的有丝分裂中期/后期交界处是重要的细胞周期调控点，其失控易导致肿瘤的发生，提示CENPE与肿瘤的发生发展可能存在密切联系。一些研究显示CENPE在耐药性卵巢癌、垂体腺瘤中上调表达，在垂体腺瘤中，CENPE与其它6个基因共同构成标志物谱，作为该疾病的病理分型和预后的分子诊断标志。而CENPE在肝癌中是否有类似作用则尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种CENPE基因的用途，CENPE基因可作为诊断肝癌的分子标志物。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:在本发明的一个方面，提供了一种CENPE基因的用途，用于制备诊断肝癌的产品。优选的，所述诊断肝癌的产品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片检测、或免疫检测诊断肝癌的产品。所述用半定量RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增CENPE基因的引物。所述用基因芯片检测诊断肝癌的产品包括 与CENPE基因的核酸序列杂交的探针。所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括:与CENPE蛋白特异性结合的抗体。在本发明的另一方面，还提供了一种用于诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒包含特异性针对CENPE基因的引物或探针，或包含特异性结合CENPE蛋白的抗体。
利用本发明的试剂盒，可以检测病人CENPE基因的表达情况，从而诊断病人是否患有肝癌。在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但一般在15 25个核苷酸之间。在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对CENPE蛋白特异的抗体。例如，将提纯的人CENPE基因产物或它的抗原片段或人工合成的含有与CENPE蛋白有连续5个相同的氨基酸的多肽片段注射入动物体内以产生多抗体。同样，表达人CENPE蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。经实验证明，本发明CENPE基因在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，因此CENPE基因可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例1的CENPE基因在人肝癌组织和癌旁组织中差异表达的半定量RT-PCR结果图。
具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京:科学出版社，2004)中所述的方法进行。实施例1用半定量RT-PCR方法检测肝癌样本中CENPE基因的表达变化半定量反转录-聚合酶链反应(SqRT-PCR)是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。运用半定量RT-PCR方法，检测20对肝癌样本中CENPE基因的表达变化，发现其在肝癌组织中呈明显的上调表达趋势。具体实验步骤如下:1.组织分离实验用组织来源于HBV阳性并表达甲胎蛋白的原发性肝癌的手术病人(RT-PCR证实AFP在肝癌均为阳性而癌旁为阴性)。手术切除的肝脏一经离体，迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织，放入液氮中(-80°C)保 存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。2.RNA 抽提
采用TAKARA公司的Trizol (D9108)对20对肝癌样本(癌和癌旁)组织进行抽提，并用安捷伦2100对产物的纯度和浓度进行检测。具体操作是:将碾杵和匀浆器等器皿在200°C干烤4h，去除RNA酶，冷却；加入液氮中预冷，将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzoI试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4°C离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4°C离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4°C离心沉淀RNA ;用75%乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA进行质量鉴定(用安捷伦2100测定RNA浓度、纯度和完整性)，结果见下表1。质量鉴定好的RNA存放在_80°C冰箱待用。表1 20对肝癌样本的RNA抽提质量检测结果
权利要求
1.一种CENPE基因的用途，其特征在于，用于制备诊断肝癌的产品。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断肝癌的产品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片检测、或免疫检测诊断肝癌的产品。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用半定量RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增CENPE基因的引物。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用基因芯片检测诊断肝癌的产品包括 与CENPE基因的核酸序列杂交的探针。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括 与CENPE蛋白特异性结合的抗体。
6.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对CENPE基因的引物对。
7.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对CENPE基因的探针。
8.一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性结合CENPE蛋白的抗体。
全文摘要
本发明公开一种CENPE基因的用途，用于制备诊断肝癌的产品。本发明还公开了一种用于诊断肝癌的试剂盒，该试剂盒包含特异性针对CENPE基因的引物或探针，或包含特异性结合CENPE蛋白的抗体。本发明的CENPE基因，可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。
文档编号C12Q1/68GK103173526SQ20111043690
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者黄健, 刘星 申请人:上海生物芯片有限公司