专利名称：一种快速分析和鉴定小麦外源染色体的多色荧光原位杂交方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学和分子生物学研究领域。本发明涉及一种快速分析和鉴定小麦外源染色体的多色荧光原位杂交的方法，本发明还涉及一种对所获得的植物染色体标本进行重复杂交分析的方法，本发明还涉及一种制备植物染色体中期分裂相标本的方法，可以获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本。
背景技术：
小麦是世界上重要的粮食作物之一，与社会经济发展、粮食安全供给和人类营养健康密切相关。遗传改良是提高小麦产量和品质的主要环节，目前小麦品种改良仍然主要采用常规杂交育种途径，但传统育种方法存在周期长、性状改良不显著和范围窄等缺点。遗传基础狭窄已经成为制约作物品种单产水平、抗性、适应性等重要农艺性状进一步提升的关键因素(叶兴国et al.2011)。因此，拓宽品种的遗传基础已成为农作物育种发展的迫切需求。远缘杂交是物种形成的重要途径，是生物进化的重要因素之一，远缘杂交可打破种(或科、属)之间的界限，使不同物种间的遗传物质进行交流或结合，将两个或多个物种经过长期进化积累起来的有益特性结合起来，再经过染色体组天然加倍和自然选择，形成生命力更强的新物种。通过远缘杂交导入外源基因，对现代小麦改良具有重要意义。普通小麦的基因源较宽，小麦族内300多个物种大多数都能与普通小麦杂交，已有5个属15个种(包括小麦属的5个种)向普通小麦转移了抗病基因。中国在20世纪50年代便已将小麦与中间偃麦草、长穗偃麦草远缘杂交成功，至今已育成一批品种在生产上推广。如由中间偃麦草育成的“龙麦 I号”、“龙麦2号”、“新曙光6号”等春小麦品种。同时，育成的八倍体小偃麦“远中”1至7号优质、抗病，已成为优良育种亲本。由十倍体长穗偃麦草育成一批小麦品种，其中“小偃6号”年种植面积曾达66.67万hm2，且在生产上使用长达20年(董玉琢2001)。染色体工程在小麦等多倍体作物育种史上曾经发挥了非常重要的作用。20世纪70年代，欧洲在小麦与黑麦的杂交后代中发现了黑麦的1RS/1BL易位系材料，并用于小麦品种改良，培育出洛夫林等一些列高产、抗病、矮杆小麦品种，并在世界各小麦主产区迅速大面积推广，随后各个国家根据自己的育种目标，转育了成千上万的1RS/1BL品种，为世界小麦生产做出了卓越贡献。1BL/1RS易位在世界小麦品种中广泛分布，通过种间特定的染色体易位和替换，黑麦染色体IR的短臂(IRS)已存在于大量普通小麦的染色体组中，许多对农艺性状具有重要作用的基因和抗性基因由此从黑麦转入小麦基因组中(任燕and王涛2006)。传统的染色体工程存在效率低、周期长、重组染色体难以准确有效跟踪和快速鉴定，以及难于与现代分子生物学技术相衔接等一系列问题，严重限制了染色体工程研究的进一步发展。所以快速高效的分析染色体组成就显得尤为重要。随着染色体操作技术的进步，尤其是DNA原位杂交技术的发展，为异染色体系的鉴定、易位断点的识别提供了有用的工具，可以准确地识别易位片段的大小、位置和断点，为有目的的转移有用基因进行小麦品种改良奠定了基础。基因组原位杂交(Genomicin situ hybridization GISH)是 20 世纪 80 年代末发展起来的一种原位杂交技术。它采用来自一个物种的总基因组DNA作为标记探针，用另一物种的总基因组DNA以适当的浓度进行封阻，在靶染色体上进行原位杂交。在封阻DNA和标记DNA探针之间，封阻DNA优先与一般序列杂交，剩下的特异性序列主要被标记探针所杂交。Mukai (Mukai and Gill 1991)等用生物素标记二倍体AA基因组祖先种T rotociurartu总基因组DNA,地高辛标记二倍体DD基因组祖先种Aegilops squarrosa总基因组DNA,未标记的总基因组DNA为可能的BB基因组祖先种Aegilops speltoides,对六倍体普通小麦(Triticum aestivum)中期染色体进行原位杂交,仅用两种突光素就将A、B和D基因组同时显不为黄、掠和澄色。此后Sanchez-Moran(Sanchez-Moran et al.1999)等利用该技术用不同颜色同时显示小麦-黑麦衍生种中的A、B、D和R基因组。韩等(Han etal.2003 ；Han et al.2004)利用地高辛和生物素标记的基因组GISH鉴定部分双二倍体的染色体组成及分析染色体之间的易位，但使用的探针标记方法大多为间接法，即使用非荧光物质如生物素或地高辛等标记探针，再通过亲和连接或免疫反应带入荧光物质，具有杂交信号放大作用，尽管间接法FISH能放大杂交信号，增加杂交敏感性，但杂交后要经过繁琐的洗脱及抗体孵化来放大杂交信号，费时费力，而且在洗脱过程中很容易造成染色体丢失变形等问题，本实验通过直接法FISH，即在切口平移法标记探针时，直接掺入荧光素核苷三磷酸标记物，杂交后经过简单冲洗就可镜检，极大地简化了原位杂交程序，保持染色体的最佳形态，对鉴定外源染色体组成及分析以及染色体之间的相互易位都能很好的观察。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种快速分析和鉴定小麦外源染色体的多色荧光原位杂交方法。具体地，本发明的分析和鉴定小麦外源染`色体的方法包括下述步骤:I)通过N2O气体预处理并酶解小麦根尖分生区细胞分裂旺盛的组织获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本；2)利用切口平移方法标记标记小麦族基础基因组荧光探针；3)利用步骤2)构建的荧光探针对利用步骤I)有丝分裂中期分裂相染色体进行荧光原位杂交；4)分析步骤3)得到的荧光原位杂交结果。其中步骤I)包括下述步骤:(a)N2O气体预处理:取合适的小麦根尖，放在湿润的离心管里，放入N2O气室中处理0.5-5小时，N2O的压强为IOATM(LOlMpa) ； (b)将N2O气体预处理的根尖固定；(c)酶解处理:将固定好的根尖用水洗涤，切下根尖分生组织，用果胶酶和纤维素酶处理30min-2h。其中步骤2)标记的小麦族基础基因组选自AA基因组，DD基因组，RR黑麦基因组，10X长穗偃麦草基因组，或转基因目的片段载体。上述步骤中最关键的步骤是步骤3)杂交所用的切口平移方法标记的荧光探针的混合比例，AA基因组和DD基因组的质量比例不能少于1: 4。例如，对小偃麦(偃麦草与普通小麦杂交后代)和小黑麦(黑麦与普通小麦杂交后代)的有丝分裂中期分裂相进行荧光原位杂交；其中的探针混合比例应该是根据不同材料(外源染色体是来源于黑麦还是偃麦草)外源染色体的多少来混合探针，AA基因组和DD基因组同源性比较高，所以AA基因组和DD基因组会有交叉杂交，染色体的颜色跟探针标记的颜色不相符合(探针标记时，AA基因组是绿色，DD基因组是红色，杂交完后，AA基因组是绿色，DD基因组是红色)，所以探针比例(AA基因组和DD基因组的比例)不能少于1: 4，BB基因组作为封阻，和AA基因组和DD基因组都有一定的同源性，但是和BB基因组(自己本身)同源性最高，所以用高比例的封阻把BB基因组给封阻有利于一次杂交区分开四个染色体组，BB基因组的封阻比(质量比)较高达160-200倍。本发明的又一个目的是提供一种对所获得的植物染色体标本进行重复杂交分析的方法。具体地 ，本发明对所获得的植物染色体标本进行重复杂交分析的方法包括下述步骤:I)通过N2O气体预处理并酶解植物根尖分生区或者芽尖分生区细胞分裂旺盛的组织获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本；2)利用切口平移方法标记荧光探针；3)利用步骤2)构建的荧光探针对利用步骤I)有丝分裂中期分裂相染色体进行荧光原位杂交；4)经过简单冲洗，在保持染色体形态的基础上反复使用多种杂交探针进行一次或多次杂交，进行外源染色体的鉴定和分析。上述步骤中最关键的步骤是步骤4)中，经过简单冲洗，在保持染色体形态的基础上反复使用多种杂交探针，依次进行一次或多次杂交，进行外源染色体的鉴定和分析。第一次杂交完后，染色体标本上会有含DAPI的抗淬灭剂，比较粘稠，只需要2 X SSC (保护染色体上的蛋白质，防止染色体变形)室温下洗脱就可以直接依次进行后续的杂交(例如，第二次杂交，第三次杂交等)，避免了之前的繁琐的洗脱和洗脱过程中染色体丢失变形等问题。在本发明的一个具体实施方案中，本发明提供一种快速分析和鉴定小麦外源染色体的多色荧光原位杂交方法，其特征在于:I)通过N2O气体预处理并酶解陇春23，八倍体小偃麦XY784的根尖分生区细胞获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本；2)利用切口平移方法标记A基因组，D基因组，R基因组和十倍体长穗偃麦草荧光探针；3)利用步骤2)构建的荧光探针对利用步骤I)有丝分裂中期分裂相染色体进行荧光原位杂交；4)分析步骤3)得到的荧光原位杂交结果。在本发明的一个具体实施方案中，所述待检测的染色体和染色体片段选自陇春23，八倍体小偃麦XY784和Pwy86的转基因材料。虽然上述技术中的一种或几种在相关的研究中得到了应用，但是综合应用这样几种技术构成完整的实验方案，并应用到植物远缘杂交种中外源染色体或染色体片段的鉴定中未见到相关研究报道。本发明首次利用该套研究方案成功地以高灵敏度检测远缘杂交植物中的外源常染色体，克服了现有技术中植物常染色体检测效果不理想的问题，是一种技术突破，体现了该研究方法具有较好的先进性、创新性和实用性。综上所述，本发明提供下列各项:1.一种快速分析和鉴定外源染色体的多色荧光原位杂交方法，其包括下述步骤:I)通过N2O气体预处理并酶解植物根尖分生区细胞分裂旺盛的组织获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本；2)利用切口平移方法标记小麦族基础基因组的荧光探针；3)利用步骤2)构建的荧光探针对利用步骤I)有丝分裂中期分裂相染色体进行荧光原位杂交；4)分析步骤3) 得到的荧光原位杂交结果。2.第I项所述的方法，其中步骤I)包括下述步骤:(a)N20气体预处理:取合适的小麦根尖，放在湿润的离心管里，放入N2O气室中处理0.5-5小时，N2O的压强为lOATMd.0lMpa) ； (b)将队0气体预处理的根尖固定；(c)酶解处理:将固定好的根尖用水洗涤，切下根尖分生组织，用果胶酶和纤维素酶处理30min-2h。3.第I项所述的方法，其中步骤2)中标记的小麦族基础基因组选自AA基因组，DD基因组，RR黑麦基因组，IOX长穗偃麦草基因组或转基因目的片段载体。4.第I项所述的方法，其中二倍体乌拉尔图AA基因组和二倍体粗山羊草DD基因组的探针混合的质量比例不能少于1: 4。5.第I项所述的方法，其中二倍体拟斯卑尔托BB基因组的封阻质量比为160-200倍。6.第I项所述的方法，其中对所获得的小麦染色体标本进行重复杂交分析，其中每步重复杂交分析洗脱是用2 X SSC室温下洗脱。7.一种对所获得的植物染色体标本进行重复杂交分析的方法，所述方法包括下述步骤:I)通过N2O气体预处理并酶解植物根尖分生区或者芽尖分生区细胞分裂旺盛的组织获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本；2)利用切口平移方法标记荧光探针；3)利用步骤2)构建的荧光探针对利用步骤I)有丝分裂中期分裂相染色体进行荧光原位杂交；4)经过简单冲洗，在保持染色体形态的基础上反复使用多种杂交探针进行一次或多次杂交，进行外源染色体的鉴定和分析。8.第7项所述的方法，其中步骤4)的简单冲洗是用2XSSC室温下洗脱。9.一种制备植物染色体中期分裂相标本的方法，所述方法包括下述步骤:(a) N2O气体预处理:取所述植物合适的根尖或芽尖，放在湿润的离心管里，放入N2O气室中处理0.5-5小时，N2O的压强为10ATM(1.0lMpa) ； (b)将N2O气体预处理的根尖或芽尖固定；(c)酶解处理:将固定好的根尖或芽尖用水洗涤，切下根尖或芽尖分生组织，用果胶酶和纤维素酶处理30min_2h。10.第9项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。
附图简述
图1.1RS/1BL易位系染色体组成。箭头所示为IRS染色体。图中绿色代表黑麦R，黄色代表小麦A基因组，褐色代表小麦B基因组，红色代表小麦D基因组。图2.八倍体小偃麦染色体组成。箭头和星号所示为小麦A-D组两对易位染色体。绿色代表十倍体长穗偃麦草，黄色代表小麦A基因组，褐色代表小麦B基因组，红色代表小
麦D基因组。图3.小麦染色体标本的三次原位杂交A:转基因信号的荧光原位杂交检测，箭头所示为目的基因的插入位点:多色荧光原位杂交，检测转基因位点所在的小麦染色体组，绿色代表小麦A染色体组，褐色代表小麦B染色体组，红色代表小麦D染色体组，箭头所示为目的基因插入了小麦的A染色体组；C:重复序列pSC119.2和pASl检测目的基因所在的具体染色体，绿色示重复序列PSC119.2信号，红色示重复序列pASl信号，箭头所示为目的基因插入了小麦的IA染色体。
具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。另外，本领域技术人员还应该理解，除非另外具体说明，下述实施例中所用的试剂均为市售分析纯级别的试剂。实施例1.陇春23春小麦材料的鉴定1.陇春23春小麦有丝分裂中期分裂相的制备所用陇春23春小麦，来自中国科学院遗传与发育生物学研究所韩方普实验室保存的种质资源(可参见杨文雄2005)。DN2O处理根尖待根尖长到2-3cm时，剪下，放在湿润的离心管里，盖上盖子后放入N20气室中处理 l_3h，压强为 lOATMd.0lMpa)；
2)根尖固定90%乙酸固定5-10分钟(不超过Ih)，蒸馏水洗2次。固定后的根尖可转入70%的乙醇中放入_20°C可保存多年；3)酶解用滤纸将根尖上的水稍微吸干，将根尖分生组织切下，放入果胶酶和纤维素酶的20 μ L混合液(酶解液配制:把一个塑料培养皿放到天平上，向里面加入I X柠檬酸缓冲液(IOmM柠檬酸钠+IOmM EDTA，pH5.5)9.7g，取出置于冰上，称取0.1g果胶酶Y-23 (购自日本Japan Yakult 公司，I % w/w)和 0.2g 纤维素酶 Onozuka R-1O (购自日本 Japan Yakult 公司，2% w/w)加入缓冲液中，用枪头吹吸助溶，酶溶解后用分液器分装到0.5ml薄壁PCR管中，-20 V保存)中，37 °C水浴40-60分钟，4)滴片用70%酒精洗2次，洗第二次时留一点酒精，大约200ul在离心管里，用解剖针将根尖捣碎，低速(< 2000转)离心10秒左右，将酒精倒干，加冰乙酸(每个根尖20-40 μ 1，视植物根尖大小)悬浮根尖细胞。
5)镜检将干净的载玻片放在湿润的盒子中，每张载玻片滴6-7 μ I根尖细胞悬浮液，盖上盒盖，5分钟以后镜检，将染色体制片标本保存在冰箱中备用。2.AA组，DD组和RR组的探针标记
I) CTAB法提取植物基因组DNA取植物(黑麦,十倍体长穗偃麦草,节节麦,乌拉尔图和speltoides,(这些种子购自Germany IPK研究所)幼嫩的叶片，参照文献(Kidwell et al.1992)提取植物的DNA，使DNA的浓度最终达到200ng/ul,然后标记探针。其中speltoides要做封阻,浓度要达到2000ng/ul。2)将下列组分在冰上加入离心管中:
权利要求
1.一种快速分析和鉴定外源染色体的多色荧光原位杂交方法，其包括下述步骤: 1)通过N2O气体预处理并酶解小麦根尖分生区细胞分裂旺盛的组织获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本； 2)利用切口平移方法标记小麦族基础基因组的荧光探针； 3)利用步骤2)构建的荧光探针对利用步骤I)有丝分裂中期分裂相染色体进行荧光原位杂交； 4)分析步骤3)得到的荧光原位杂交结果。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤I)包括下述步骤:(a)N20气体预处理:取合适的小麦根尖，放在湿润的离心管里，放入N2O气室中处理0.5-5小时，N2O的压强为lOATMd.0lMpa) ； (b)将队0气体预处理的根尖固定；(c)酶解处理:将固定好的根尖用水洗涤，切下根尖分生组织，用果胶酶和纤维素酶处理30min-2h。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤2)中标记的小麦族基础基因组选自AA基因组，DD基因组，RR黑麦基因组，IOX长穗偃麦草基因组或转基因目的片段载体。
4.权利要求1所述的方法，其中二倍体乌拉尔图AA基因组和二倍体粗山羊草DD基因组的探针混合质量比例不能少 于1: 4。
5.权利要求1所述的方法，其中二倍体拟斯卑尔托BB基因组的封阻的质量比为160-200 倍。
6.权利要求1所述的方法，其中对所获得的小麦染色体标本进行重复杂交分析，其中每步重复杂交分析洗脱是用2 X SSC室温下洗脱。
7.一种对所获得的植物染色体标本进行重复杂交分析的方法，所述方法包括下述步骤: 1)通过N2O气体预处理并酶解植物根尖分生区或者芽尖分生区细胞分裂旺盛的组织获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本； 2)利用切口平移方法标记荧光探针； 3)利用步骤2)构建的荧光探针对利用步骤I)有丝分裂中期分裂相染色体进行荧光原位杂交； 4)经过简单冲洗，在保持染色体形态的基础上反复使用多种杂交探针进行一次或多次杂交，进行外源染色体的鉴定和分析。
8.权利要求7所述的方法，其中步骤4)的简单冲洗是用2XSSC室温下洗脱。
9.一种制备植物染色体中期分裂相标本的方法，所述方法包括下述步骤: (a) N2O气体预处理:取所述植物合适的根尖或芽尖，放在湿润的离心管里，放入N2O气室中处理0.5-5小时，N2O的压强为10ATM(1.0lMpa) ； (b)将N2O气体预处理的根尖或芽尖固定；(c)酶解处理:将固定好的根尖或芽尖用水洗涤，切下根尖或芽尖分生组织，用果胶酶和纤维素酶处理30min-2h。
10.权利要求9所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。
全文摘要
本发明提供了一种快速分析和鉴定小麦外源染色体的多色荧光原位杂交方法，所述方法包括下述步骤1)通过N2O气体预处理并酶解小麦根尖分生区细胞分裂旺盛的组织获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本；2)利用切口平移方法标记小麦族基础基因组的荧光探针；3)利用步骤2)构建的荧光探针对利用步骤1)有丝分裂中期分裂相染色体进行荧光原位杂交；4)分析步骤3)得到的荧光原位杂交结果。利用本发明提供的方法不但可以用来对小麦远缘杂交种中外源染色体和染色体片段进行鉴定，也可以应用到对其他农作物远缘杂交种中外源染色体和染色体片段的鉴定工作中。
文档编号C12Q1/68GK103205500SQ20131012748
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月12日 优先权日2013年4月12日
发明者韩方普, 吕振玲 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所