一种远缘杂交甜菜的染色体制片方法与流程

本发明涉及一种甜菜染色体制片方法。

背景技术：

染色体制片观察是植物细胞生物学的主要研究方法之一。染色体制片观察通常采用压片法。

由于甜菜染色体很短。而对远缘杂交甜菜染色体制片难度更大。主要是难识别附加染色体。远缘杂交甜菜染色体较短，对附加的染色体难以进行辨认，这个问题一直在困扰着研究人员。用常规的压片法无法解决这个难题。因此，这对远缘杂交甜菜的深入研究也受到很大的限制。

技术实现要素：

本发明是要解决现有的染色体制片方法难以对远缘杂交甜菜附加的染色体进行辨认的问题，提供一种远缘杂交甜菜的染色体制片方法。

本发明远缘杂交甜菜的染色体制片方法，按以下步骤进行：

一、取样：在每天上午8:00-10:00取远缘杂交甜菜的甜菜心叶或根尖作为待处理样品；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜样品进行预处理，预处理的时间为2-4小时；预处理时间的改进是成功辨别附加染色体的关键。

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜样品2-3次；

四、解离：将水洗后的甜菜样品用解离液解离5-10分钟，解离过程中要不时检查材料的解离情况，以能压散细胞为准，解离适度后用蒸馏水冲洗2-3次；

五、染色和压片：用改良的品红染色液染色2-3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡，不用移动盖玻片，避免细胞变形使染色体扭曲，使染色体分散不重叠，在一个平面为宜。

所述改良的品红染色液的制备方法为：

1、取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a，可长期保存。

2、取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚(即石碳酸)水溶液中，得原液b(2周内使用)；

3、取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c(可长期保存)；

4、取原液c10-20ml加入90-80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液。放置2周后使用，染色效果显著。使用2-3年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，如果没有山梨醇也能染色，但效果稍差。

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

进一步的，步骤一所述远缘杂交甜菜为单体附加系甜菜m14或异源三倍体甜菜。

进一步的，步骤二中8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

进一步的，步骤四所述解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。所述浓盐酸为市售的标准浓盐酸。

本发明的有益效果：

本发明方法解决了远缘杂甜菜染色体难于识别的障碍。

本方法采取延长预处理时间的方法，使预处理时间由原来的1-2小时改为2-4小时。改进后的制片方法很容易识别附加染色体情况，可清晰观察到远缘杂交甜菜附加的染色体情况，实验效率显著提高。

本方法简便易行，成本低。本发明方法的效果好，易于操作和掌握，提高了工作效率，省时省力。普光学显微镜即可观察，一般实验室都可以做到。

利用改进后的制片方法分别对单体附加系甜菜m14、异源三倍体甜菜、白花甜菜普通栽培甜菜进行了制片观察，效果很好，有可重复性。此方法也同样适用于滴片法和涂片法。

本方法使远缘杂交甜菜染色体被成功识别，进而对附加的白花甜菜染色体进行了微分离和微克隆，进而建立了附加染色体的人工染色体bac库。为远缘杂交甜菜的分子生物学及蛋白质组学等研究工作提供了基础保障。

附图说明

图1为实验组1的染色体制片结果；

图2为利用常规压片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果；

图3为利用常规涂片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果；

图4为利用常规滴片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果；

图5为实验组2的染色体制片结果；

图6为实验组3的染色体制片结果；

图7为实验组4的染色体制片结果。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式远缘杂交甜菜的染色体制片方法，按以下步骤进行：

一、取样：在每天上午8:00-10:00取远缘杂交甜菜的心叶或根尖；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜样品进行预处理，预处理的时间为2-4小时；

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜样品2-3次；

四、解离：将水洗后的甜菜样品用解离液解离5-10分钟，解离后用蒸馏水冲洗2-3次；

五、染色和压片：用改良的品红染色液染色2-3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡；

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述远缘杂交甜菜为单体附加系甜菜m14或异源三倍体甜菜。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤四所述解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤五所述改良的品红染色液的制备方法为：

1、取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a；

2、取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚水溶液中，得原液b；

3、取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c；

4、取原液c10-20ml加入90-80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液，放置2周后使用。其它与具体实施方式一至四之一相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实验组1：本实验远缘杂交甜菜的染色体制片方法，按以下步骤进行：

一、取样：在每天上午8:00-10:00取远缘杂交甜菜的心叶；所述远缘杂交甜菜为单体附加系甜菜m14；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶进行预处理，预处理的时间为3小时；预处理时间的改进是成功辨别附加染色体的关键。8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5分钟，解离过程中要不时检查材料的解离情况，以能压散细胞为准，解离适度后用蒸馏水冲洗3次；所述解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。所述浓盐酸为市售的标准浓盐酸。

五、染色和压片：用改良的品红染色液染色3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡，不用移动盖玻片，避免细胞变形使染色体扭曲，使染色体分散不重叠，在一个平面为宜。

所述改良的品红染色液的制备方法为：

1、取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a，可长期保存。

2、取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚(即石碳酸)水溶液中，得原液b(2周内使用)；

3、取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c(可长期保存)；

4、取原液c20ml加入80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液。放置2周后使用，染色效果显著。使用2-3年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，如果没有山梨醇也能染色，但效果稍差。

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

对照组为利用常规压片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片，利用常规涂片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片，利用常规滴片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片。

用olympus-bx51型显微成像系统进行显微摄影。

实验组1的染色体制片结果如图1所示，vv+1c,2n＝2x+1＝19。利用常规压片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果如图2所示，利用常规涂片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果如图3所示，利用常规滴片法进行单体附加系甜菜m14的染色体制片结果如图4所示。

实验组2：本实验远缘杂交甜菜的染色体制片方法，按以下步骤进行：

一、取样：在每天上午8:00-10:00取远缘杂交甜菜的心叶；所述远缘杂交甜菜为异源三倍体；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶进行预处理，预处理的时间为3小时；预处理时间的改进是成功辨别附加染色体的关键。8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5分钟，解离过程中要不时检查材料的解离情况，以能压散细胞为准，解离适度后用蒸馏水冲洗3次；所述解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。

五、染色和滴片：用改良的品红染色液染色3分钟，将染色后的材料采用滴片法制片。

所述改良的品红染色液的制备方法为：

1、取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a，可长期保存。

2、取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚(即石碳酸)水溶液中，得原液b(2周内使用)；

3、取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c(可长期保存)；

4、取原液c20ml加入80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液。放置2周后使用，染色效果显著。使用2-3年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，如果没有山梨醇也能染色，但效果稍差。

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

用olympus-bx51型显微成像系统进行显微摄影。染色体制片结果如图5所示。

实验组3：本实验远缘杂交甜菜的染色体制片方法，按以下步骤进行：

一、取样：在每天上午8:00-10:00取白花甜菜的心叶；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶进行预处理，预处理的时间为3小时；预处理时间的改进是成功辨别附加染色体的关键。8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5分钟，解离过程中要不时检查材料的解离情况，以能压散细胞为准，解离适度后用蒸馏水冲洗3次；所述解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。

五、染色和涂片：用改良的品红染色液染色3分钟，将染色后的材料采用涂片法制片。

所述改良的品红染色液的制备方法为：

1、取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a，可长期保存。

2、取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚(即石碳酸)水溶液中，得原液b(2周内使用)；

3、取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c(可长期保存)；

4、取原液c20ml加入80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液。放置2周后使用，染色效果显著。使用2-3年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，如果没有山梨醇也能染色，但效果稍差。

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

用olympus-bx51型显微成像系统进行显微摄影。染色体制片结果如图6所示，图6为白花甜菜36条染色体。

实验组4：本实验远缘杂交甜菜的染色体制片方法，按以下步骤进行：

一、取样：在每天上午8:00-10:00取普通栽培甜菜的心叶；

二、预处理：用8-羟基喹啉对甜菜心叶进行预处理，预处理的时间为3小时；预处理时间的改进是成功辨别附加染色体的关键。8-羟基喹啉的浓度为0.002mol/l。

三、水洗：用蒸馏水水洗甜菜叶子3次；

四、解离：将水洗后的甜菜叶子用解离液解离5分钟，解离过程中要不时检查材料的解离情况，以能压散细胞为准，解离适度后用蒸馏水冲洗3次；所述解离液由100％乙醇和浓盐酸按体积比1:1组成。

五、染色和压片：用改良的品红染色液染色3分钟，将染色后的材料盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的染色液，用镊子或有弹性的记号笔一端适度敲击盖玻片，排除气泡，不用移动盖玻片，避免细胞变形使染色体扭曲，使染色体分散不重叠，在一个平面为宜。

所述改良的品红染色液的制备方法为：

1、取3g碱性品红溶于100ml体积浓度为70％的酒精溶液中，得原液a，可长期保存。

2、取原液a10ml加入到90ml体积浓度为5％的苯酚(即石碳酸)水溶液中，得原液b(2周内使用)；

3、取原液b55ml加入6ml冰乙酸和6ml体积浓度为38％的甲醛，得原液c(可长期保存)；

4、取原液c20ml加入80ml体积浓度为45％的醋酸和1.5g山梨醇，得到改良的品红染色液。放置2周后使用，染色效果显著。使用2-3年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用，如果没有山梨醇也能染色，但效果稍差。

六、镜检观察：查找中期染色体分裂相，观察、计数，使用加拿大树胶或指甲油封片。

用olympus-bx51型显微成像系统进行显微摄影。染色体制片结果如图7所示，图7为栽培甜菜18条染色体。

由实验结果可以看出，经过本发明的制片方法，单体附加系m14、异源三倍体甜菜和白花甜菜染色体都比其它染色体略长，很容易识别。说明本发明方法的实验效果显著。而且不近适用于压片发，还同样适用于滴片法和涂片法。

本发明受黑龙江大学化学化工与材料学院教育部重点实验室资助。