鲤鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鱼类杂交方法，尤其涉及鲤科鱼类中亚科间的远缘杂交方法。
【背景技术】
[0002] 含量测定亲缘关系在种间或种间以上的杂交称为远缘杂交，是鱼类性状改良常用 的方法。远缘杂交作为一种重要的鱼类遗传育种和性状改良方法，它可以整合整套外源基 因，从而改变杂交后代基因的表达调控，使得杂交后代可能在生长速度、抗逆性、抗病性以 及肉质等方面表现出杂种优势。远缘杂交根据不同的亲本组合，可以形成在表型和遗传型 上都不同的不同类型的鱼。如红鲫与湘江野鲤的属间远缘杂交形成的杂交后代中F1-F2S 二倍体杂交鱼（2n= 100)，F3-F24S异源四倍体鱼（4n= 200);利用异源四倍体鱼与有关 二倍体鱼交配，大规模形成了具有生长速度快、肉质鲜嫩、抗病力强等优点的三倍体鱼（3n =150)。红鲫与团头鲂的亚科间远缘杂交的F1中形成了二倍体天然雌核发育红鲫（2n= 100)、异源四倍体鲫鲂（4n= 148)和异源三倍体鲫鲂（3n= 124);其中异源四倍体鲫鲂通 过自交形成了同源四倍体鱼品系（4n= 200)。
[0003] 鲤鱼（Cyprinuscarpiocarpio)属于鲤科、鲤亚科中的二倍体鱼（2n= 100)，团 头鲂（Megalobramaamblycephala)属于鲤科、舶亚科中的二倍体鱼（2n= 48);在遗传、分 类和体形等生物学特征方面，鲤鱼和团头鲂之间存在较大的差异，尤其是他们之间体细胞 染色体数目差异很大，鲤鱼的染色体数目为100,而团头鲂的染色体数目为48,而且不成倍 性关系。至今国内外还没有鲤鱼与团头鲂亚科间远缘杂交成功的报道，探索一种使鲤鱼与 团头鲂之间的杂交方法并对其后代的生物学特性进行研宄分析具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，克服以上【背景技术】中提到的不足和缺陷，提供一 种受精率尚、!桴化率尚、后代性状优良、对遗传育种具有重要意义的趣鱼与团头妨亚科间远 缘杂交的方法。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种鲤鱼与团头鲂亚科间远缘杂 交的方法，包括以下步骤：首先挑选性成熟特征明显、体征良好的雌性鲤鱼和雄性团头鲂作 为亲鱼专池培育，然后在繁殖季节对所述亲鱼进行人工催产，挑选催产效果良好的亲鱼进 行人工干法授精，授精完成后的胚胎于净水孵化装置中进行流水孵化，待鱼苗孵化完成后 进行饲养，再对饲养后的鱼苗进行检测、筛分，通过流式细胞DNA含量测定、肾组织染色体 倍性检测获得鲤鱼与团头鲂杂交后代，杂交后代包括二倍体天然雌核发育鲤鱼、二倍体天 然雌核发育镜鲤、类鲫鱼的二倍体鱼和四倍体杂交鱼。采用前述技术方案获得的四种类型 的杂交鱼均具有体形优美、生长速度快、抗逆性强等优点，在新型优良鱼类品系培育和遗传 育种方面具有重要价值。
[0006] 上述的鲤鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法，优选的，所述方法具体包括以下步 骤：
[0007] (a)亲鱼的选择和培育：在繁殖期前3?4个月，挑选性成熟特征明显、体征良好 的雌性鲤鱼和雄性团头鲂分别作为远缘杂交的母本亲鱼和父本亲鱼进行专池培育，保持水 质良好；在繁殖期前一个月左右以精饵饲养，每隔2?3天流水刺激一次，促进亲鱼性腺发 育成熟；体征良好的亲鱼一般表现为体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤；
[0008] (b)人工催产：在当年的5月中旬至6月上旬，当水温稳定在20°C以上时，为所述 亲鱼注射黄体素释放激素类似物（LRH-A)与绒毛膜促性腺激素（HCG)的混合催产剂进行催 产，所述黄体素释放激素类似物的用量为6?10yg/kg(最优选10yg/kg)，绒毛膜促性腺 激素的用量为500?800IU/kg(最优选600IU/kg);先注射母本亲鱼，4?5h后再注射父本 亲鱼，父本亲鱼的注射剂量减半；注射完毕后按1 : 6?8的数量比将母本亲鱼、父本亲鱼 放入同一产卵池中，然后视水情及时向池中冲水，尤其在产卵前3?4h，注入一定水量后， 停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精；注射时优选采用胸鳍基部无鳞 处腹腔一针注射法，以提高亲鱼的存活率；
[0009] (C)授精孵化：挑选产卵顺利的母本亲鱼，用帆布担架固定，以便于操作和减少 对母本亲鱼的损伤；然后与产精量大的父本亲鱼进行人工干法授精，受精卵置于水温为 20°C?21°C的净水孵化装置中进行流水孵化；
[0010] (d)饲养：鱼苗全部孵出后，于培养箱中继续培育2?3天，待鱼苗出现腰点后将 鱼苗转入预先培肥的池塘中饲养，1?2天后泼洒豆浆，2?3次/天，力求细、匀；鱼苗长成 后通过流式细胞DNA含量测定、肾组织染色体倍性检测获得杂交后代。四种类型杂交后代 的染色体图分别如图4、图6、图8和图10所示。
[0011] 本发明中流式细胞DNA含量测定法步骤为：用经肝素润湿的一次性注射器从鱼尾 静脉血管采血约0. 2mL，注入装有0. 8%生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混 合液中加入ImL细胞核提取液DAPI-A(nucleiextractionsolution，德国PartecGmbh提 供），处理时间10?15min;样品经过20ym尼龙滤器（德国PartecGmbH提供）过滤；DNA 染色液（DAPI-B，德国PartecGmbH提供）静置于暗处染色样品约5?lOmin，然后上机检 测。通过流式细胞DNA含量测定可以明确的知道鲤鱼与团头鲂杂交后代中二倍体天然雌核 发育鲤鱼、二倍体天然雌核发育镜鲤、类鲫鱼的二倍体鱼和四倍体杂交鱼这四种类型杂交 后代的DNA平均含量以及与参照物普通红鲫的DNA平均含量的比值。
[0012] 本发明中肾组织染色体倍性的检测方法包括：在18°C?22°C水温下培育实验鱼 1?3天后，对实验鱼注射PHA1?3次，每次剂量为2?8yg/g体重，间隔时间为12? 24小时，在解剖取材前2?6小时，注射秋水仙素，剂量为2?4yg/g体重。取出肾组织， 在生理盐水下剪碎肾组织，0. 〇75mol/LKCL低渗处理，在20°C温度下低渗40?60分钟；用 冰醋酸：甲醇（1 : 3)固定肾组织1?3次；在冰冻载玻片上滴片；Giemsa染液染色45? 60分钟，细水流冲洗载玻片背面去除染液，风干后镜检、拍照。通过肾组织染色体倍性检测 也可以明确知道鲤鱼与团头鲂杂交后代中二倍体天然雌核发育鲤鱼、二倍体天然雌核发育 镜鲤、类鲫鱼的二倍体鱼和四倍体杂交鱼这四种类型的染色体数目及其倍性。
[0013] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中，鲤鱼与团头鲂的亚科间远缘杂交 形成的F1中形成了二倍体天然雌核发育鲤鱼（2n= 100)、二倍体天然雌核发育镜鲤（2n= 100)及类鲫鱼的二倍体鱼（2n= 100)和四倍体杂交鱼（4n= 148)，这些杂交后代具有体 形优美、生长速度快、抗逆性强等优点，同时呈现生物多样性的显著特点，在新型优良鱼类 品系培育和遗传育种方面具有重要价值。本发明中的杂交后代显然与现有远缘杂交组合的 亲本和杂交产生后代存在着显著差别，本发明的方法具有受精率高、孵化率高、后代性状优 良等优点，本发明远缘杂交组合获得的二倍体天然雌核发育鲤鱼、二倍体天然雌核发育镜 鲤、类鲫鱼的二倍体鱼和四倍体杂交鱼有望在杂交后代中通过遗传选育培育出二倍体天然 雌核发育鲤鱼品系、二倍体天然雌核发育镜鲤品系、类鲫鱼的二倍体鱼品系和四倍体杂交 鱼品系，其中通过对四倍体杂交鱼品系继续选育，有望研制出新型同源四倍体鱼品系。本发 明在生物进化和鱼类遗传育种方面具有重要的生物学意义。
【附图说明】
[0014] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 这些附图获得其他的附图。
[0015] 图1为本发明实施例中鲤鱼（早）X团头鲂（S)亲本中鲤鱼（早）的外形照片。
[0016] 图2为本发明实施例中鲤鱼（早）X团头鲂（$ )亲本中团头鲂（$ )的外形照 片。
[0017] 图3为本发明实施例中鲤鱼（早）X团头鲂（$ )后代中二倍体天然雌核发育鲤 鱼的外形照片。
[0018] 图4为本发明实施例中鲤鱼（早）X团头鲂（S)后代中二倍体天然雌核发育鲤 鱼的染色体图（2n= 100)。
[0019] 图5为本发明实施例中鲤鱼（早）X团头鲂（S)后代中二倍体天然雌核发育镜 鲤的外形照片。
[0020] 图6为本发明实施例中鲤鱼（早）X团头鲂（$ )后代中二倍体天然雌核发育镜 鲤的染色体图（2n= 100)。
[0021] 图7为本发明实施例中鲤鱼（早）X团头鲂（$ )后代中类鲫鱼的二倍体鱼的外 形照片。
[0022] 图8为本发明实施例中鲤鱼（早）X团头鲂（& )后代中类鲫鱼的二倍体鱼的染 色体图（2n= 100)。
[0023] 图9为本发明实施例中鲤鱼（早）X团头鲂U)后代中四倍体杂交鱼的外形照 片。
[0024] 图10为本发明实施例中鲤鱼（早）X团头鲂（& )后代中四倍体杂交鱼的染色 体图（4n= 148)。