新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发 育阶段胚拯救方法。
【背景技术】
[0002] 百合杂交育种技术包括种系内杂交和种系间杂交，种系间杂交即远缘杂交，不 仅存在受精前障碍，如花粉管在花柱内不能正常萌发，还存在很严重的受精后障碍，难 以获得杂种苗。受精后障碍主要由于胚或胚乳和母体生理机能的不协调，受精后胚不 能正常生长发育所致，通常在发育40d左右开始败育，导致杂交失败。幼胚的胚拯救技 术是克服受精后障碍的主要方法，而胚拯救开始的时间和相应的拯救措施与方式是影响 百合胚拯救的关键技术。（Van Tuyl, J.M·，Van Die 鱼Ii,. M.P·，Van Creij, M.G.M·，Van Kleinwee, T. C. M., Franken, J. , Bino, R. J. . Application of in vitro pollination, ovary culture, ovule culture, and embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses[J]· Plant Sci.l991，74 :115-126.)虽然胚極救技术如子 房切片培养、胚珠培养、胚培养等可克服受精后幼胚发育障碍，但不同的远缘杂交组合，不 同胚龄的幼胚所需的技术手段和培养基配方不同。矮牵牛早期胚拯救研究中显示，Nitsch 培养基中较低浓度的氮盐（500mg/LKN0jP80mg/LNH4N03)比其它高浓度氮盐的培养基更有 利于促进授粉后3d幼胚的发育，并且硝态氮（NO3)和铵态氮（NH4+)的质量比为11 :1时适 合胚的发育（Nitsch，J. P. &Nitsch，C. Auxin-dependent growth of exeised Helianthus tuberosus tissue I[J]. Amer. J. Bot. . 1956, 43:831.)〇
[0003] 国内在百合胚拯救方面，主要是针对种系内杂交，种间杂交的胚拯救研究较少， 进行胚拯救的时间又较晚，一般在授粉后40-60天后才对子房进行剥胚离体培养（雷家 军，阮冰洁.大花卷丹与亚洲百合、东方百合种间杂交及胚培养研究[J].东北农业大学学 报· 2011，42 (4) :66-67.)。
[0004] 在百合胚拯救技术方面，国外文献有报道显示，BA抑制胚发生，为使胚培养 得到长度Imm以上的胚，子房培养以不添加生长调节剂为宜（李思义译.百合子房 培养胚培养及杂种鉴定[J].译自农业技术，1990,45(8) :361-366. )。Yumi Obata等 (Yumi Obata，Yoshiji Niimi, Masaru Nakano，Keiichi Okazaki, Ichiro Miyajima. Interspecific hybrids between Lilium nobilissimum and L. regale produced via ovuIes-with-placental-tissue culture[J] · Scientia Horticulturae. 2000,84 ： 191-204.)用仏基本培养基附加质量百分含量5%的蔗糖，对种间远缘杂交组合Lilium nobilissimum和Lilium regale授粉后30d和40d的子房进行子房切段培养，授粉后30d 的子房切段有3%的胚珠成苗，授粉后40d的子房切段有9%的胚珠成苗。
[0005] 浅野义人（浅野义人.百合种间远缘杂交之研究[J].园艺学会杂志.1977， 46(2) :267-273.)认为在MS培养基中加入1.0 X KT4~L 0X10 _2mg/LNAA对幼胚直接发 芽有效，而高浓度的生长调节剂则有抑制有胚发育的作用，并且可诱导幼胚产生愈伤组织。 不同发育时期的幼胚对酸碱度的要求不同，随着幼胚体积的变大，pH值由高逐渐变低，即由 中性变为偏酸性，一般情况下，pH值5. 0-6. O适于大多数胚的生长（周传恩，夏光敏.小麦 远缘杂交胚拯救技术[J].麦类作物学报.2005, 25(3) :88~92)。
[0006] 新铁炮百合是1928年日本育种学家Mr. Nishimura用麝香百合和台湾百合反复杂 交而来的新品种，具有播种繁殖一年开花的特性（Okazaki K. Lilium species native to Japan, and breeding and production of Lilium in Japan[C]. International Symposium on the Genus Lilium 414. 1994,81-92.)。这一特性在百合中罕见，能解决种球繁殖中种 球退化和病毒感染的问题；而且新铁炮百合耐热性强，花期在7月至10月，正是百合鲜切花 供应困难的时候。但新铁炮百合花色和花型单一，分别为白色和喇叭型，为培育生育期短、 花色和花型丰富的百合新品种，需要将其和其他百合杂种系的品种进行远缘杂交，但这一 远缘杂交存在严重的受精后障碍，在授粉后40d胚败育之前采取有效的早期胚拯救措施可 大幅度提尚杂交的成功率。目如国内外还未有相关报道。
【发明内容】
[0007] 为了建立一套完整的新铁炮百合远缘杂交受精后障碍的早期胚拯救技术，本发明 的目的在于提供一种新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，具体步骤如下：
[0008] 1)新铁炮百合远缘杂交后，取子房进行灭菌消毒；
[0009] 2)按授粉后5d-25d、授粉后35d-40d两个不同发育阶段进行胚拯救得到杂交组培 苗：
[0010] A授粉后5d-25d发育阶段胚拯救
[0011] 子房切片培养得到胚珠后，胚珠组织培养，得到杂交组培苗；
[0012] B授粉后35d-40d发育阶段胚拯救
[0013] 胚珠离体培养或胚离体培养，得到杂交组培苗。
[0014] 其中，步骤1)所述新铁炮百合远缘杂交，为以新铁炮百合为母本，与东方百合进 行远缘杂交。
[0015] 所述东方百合优选为百合品种'索邦'。
[0016] 其中，步骤1)所述灭菌消毒的具体方法为：将摘取的子房用体积百分含量75%的 酒精擦拭表面消毒，再以有效氯1 %的次氯酸钠浸泡后无菌水冲洗。
[0017] 其中，A所述子房切片培养所用的培养基为：以仏或1/285培养基为基本培养基， 含有蔗糖的质量百分含量为6%、琼脂的质量百分含量为0. 8%、pH值为5. 8的培养基。
[0018] 其中，A所述胚珠组织培养所用的培养基为：以仏或1/2B 5培养基为基本培养基， 含有蔗糖的质量百分含量为6-9%、琼脂的质量百分含量为0. 8%、pH值为5. 8的培养基。
[0019] 其中，A所述授粉后5d-25d发育阶段胚拯救，最优选为以授粉后IOd的子房进行 子房切片培养，得到胚珠后进行胚珠组织培养，子房切片培养和胚珠培养所用的培养基均 为：以B5培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6%、琼脂的质量百分含量为 0. 8 %、pH值为5. 8的培养基。
[0020] 其中，B所述胚珠离体培养，所用培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有 NAA(萘乙酸）的浓度为0. 01mg/L、蔗糖的质量百分含量为3%、琼脂的质量百分含量为 0. 8 %、pH值为5. 8的培养基。
[0021] 其中，B所述胚离体培养，所用培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有NAA的 浓度为〇. 〇〇lmg/L、6-BA(6-苄氨基嘌呤）的浓度为0. lmg/L、蔗糖的质量百分含量为3%、 琼脂的质量百分含量为〇. 8%、pH值为5. 8的培养基。
[0022] 其中，所述培养的条件为温度25 土 1°C，暗培养。
[0023] 其中，所述新铁炮百合，优选为新铁炮百合品种'Augusta'或'雷山3号'。
[0024] 本发明还提供所述的新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法在百合 育种中的应用。
[0025] 本发明的有益效果在于：
[0026] 本发明的新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法，可克服新铁炮百合 与东方百合杂种系间远缘杂交受精后不亲和的障碍，获得有胚胚珠和杂种苗，为培育花色 和花型多样、且同时具有一年开花等优良特性的百合新品种提供可能。
【附图说明】
[0027] 图1是实施例1中授粉早期5-25d子房切片培养的组培照片；
[0028] 图2是实施例2中授粉早期5-25d子房切片培养后胚珠离体培养的组培照片；
[0029] 图3是实施例3中授粉后35d-40d胚珠直接离体培养的组培照片；
[0030] 图4是实施例4中授粉后35d-40d胚直接离体培养的组培照片。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0032] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0033] 实施例1授粉早期5d-25d不同时期子房切片培养条件筛选
[0034] 1.材料与方法
[0035] (1)分别摘取新铁炮百合'Augusta'为母本，东方百合'索邦'为父本，授粉后5d、 10d、15d、20d、25d的子房；（2)将摘取的子房用绵球蘸取体积百分含量75%的酒精擦拭表 面消毒，有效氯1 %的次氯酸钠浸泡20min，边浸泡边摇动容器，使其充分接触；再用无菌水 冲洗3次，每次2min ; (3)用锋利的手术刀将子房切成2-3mm的薄片水平放置在培养基上； (4)筛选的培养基配方为基本培养基85、1/285、15、1/21^(?!1 = 5.8，琼脂质量百分浓度 〇. 8% )分别附加3%、6%、9%或12%不同质量百分浓度的蔗糖，形成共12种处理组合， 每处理重复3次；（5)培养条件为温度25 ± I °C，暗培养，40d后统计子房段上胚珠的发育情 况。
[0036] 2.结果与分析
[0037] 授粉早期5d-25d不同发育时期子房切片培养条件的筛选结果如表1所示：
[0038] 表1基本培养基和蔗糖浓度对不同发育时期子房切片培养的影响
[0039] CN 105123528 A 说明书 4/8 页
[0040] 结果表明，采用以上方法对新铁炮百合'Augusta'为母本，东方百合'索邦'为父本 的授粉早期5-25d不同时期的子房进行切片培养，发现授粉后5d-25d的子房切片培养，以 B5S 1/2B 5培养基为基本培养基，含有蔗糖的质量百分含量为6 %、琼脂的质量百分含量为 0. 8%、pH值为5. 8的培养基均能较好地培养得到胚珠。其中，授粉后5(1、10(1、15(1、20(1子 房切片培养的最佳培养基配方为4培养基、6%蔗糖、pH = 5. 8、琼脂0. 8%，含成活胚珠的 子房片数分别为50%、75%、66. 7%、43. 3%。授粉后25d子房切片培养的最佳培养基配方 为1/285培养基、6%蔗糖、pH = 5. 8、琼脂0. 8%，含成活胚珠的子房片数为34. 3%。授粉后 的IOd是百合子房切片培养的最佳时期，含成活胚珠的子房片数最高，最高百分比达75%。 图