一种金银花直接体胚发生和植株再生的培养基及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物生物技术领域，涉及一种金银花直接体胚发生和植株再生的培养基及方法。
【背景技术】
[0002]金银花含绿原酸和木犀草素等60余种化学成分，有清热解毒、消炎退肿、增强机体免疫、延缓衰老的功效，还具有抗癌、抗艾滋病的作用，临床上主要用于预防治疗心脑血管疾病，治疗肝炎等。适应性广，抗逆性强，对土壤要求不严，是优良的园林绿化植物，还是良好的水土保持和植被恢复树种。近年来，金银花存在品种落后、苗木质量退化的问题，虽然也有新品种选育的报道，例如湖南省林科院选育出‘金翠蕾’、‘银翠蕾’、‘舜帝I号’和‘花瑶晚熟’等优良新品种，但目前这些品种繁殖多采用嫁接或扦插方式，繁殖系数小，育苗周期长，且易传染病菌，品种退化快。为了加速这些优良新品种的推广应用，也采用组织培养方法，主要是以腋芽做外植体，利用芽培养快繁苗木，但这种芽培养繁殖系数仍旧较低，导致生产成本过高，难以在生产中被大面积推广应用。通过“器官发生”方式，繁殖系数较芽培养高，但操作过程繁琐，生产成本也居高不下，且培育出的苗木变异几率增加。体细胞胚胎发生是指在离体条件下植物体细胞通过与合子胚发生相似的途径发育成新个体的过程。体细胞胚发生，特别是直接体胚发生，是公认的最佳繁殖方法，具有操作简单、繁殖系数高、变异株少、幼苗成活率高、植株完全无病等优点，且繁殖速度快、不受地区、季节和灾害性气候等自然条件的限制，一旦获得优良材料就可以比常规繁殖快数十倍甚至上百倍的速度繁殖，大大降低了生产成本，是未来金银花苗木繁育首选方法。
[0003]金银花组培育苗研究较多。杨培君以金银花‘蒙花’品系的茎段为外植体，于MS和BJii加不同激素配比的培养基上，探讨愈伤组织形成和丛生芽诱导及生根培养的条件，获得较好的增殖和生根培养基；王晓明以‘金翠蕾’无菌叶片为材料，通过先诱导出不定芽，再诱导出不定根的方式，成功诱导出完整小苗，但上述方法只局限于一般“芽培养”及“器官发生”方式繁殖苗木，繁殖系数仍旧不理想，尚无利用金银花叶片作为外植体建立直接体胚发生体系的研究报道。
[0004]公开号CN102577969A号“灰毡毛忍冬渝蕾I号组培种苗的繁育方法”的发明特征是以当年抽出的叶片为外植体，先诱导愈伤组织，进一步接种至分化培养基上诱导不定芽和不定根。公开号CN102577970A号“灰毡毛忍冬渝蕾I号种苗的组织培养基”专利，申请人的发明特征在于种苗繁育的组织培养基，包括愈伤组织诱导培养基、不定芽分化培养基、不定芽继代培养基及生根培养基。公开号CN103548687A号“灰毡毛忍冬渝蕾I号组培苗生根培养基及生根培养方法”专利，申请人的发明特征在于探索出一个最适合组培苗生根的培养基配方及生根培养方法，显著提高生根率。公开号CN103548690A号“灰毡毛忍冬渝蕾I号的增殖培养基及其增殖方法”专利，申请人的发明特征在于调整基本增殖培养基，并提出增殖时最佳的切割工艺。以上专利都局限在金银花器官发生、芽繁或者生根，其培养基组成因器官发生、芽繁或者生根各有差异，基本培养基为B5、改良仏或1/2MB，添加6-BA、NAA、KT、IAA, IBA、活性炭等，但它们均未涉及到体胚发生和通过体胚发生得到再生的金银花植物。
[0005]通过直接体胚发生繁殖苗木，攻克金银花苗木繁殖系数低的技术难题，建立高效的快繁技术体系，可在最短时间内繁殖出质量好，幼苗成活率高的优良种苗，满足市场对金银花健康种苗的需求。因此，研究金银花直接体胚发生培养基及植株再生方法至关重要。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有研究的不足，提供一种能保持母株优良性状的金银花叶片直接体胚发生培养基及方法。直接体胚发生，由于胚直接源于体细胞，不经过愈伤组织阶段，通过此途径得到的再生植物能保持母株优良性状。
[0007]为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为:
100ml所述金银花直接体胚发生和植株再生的直接体胚诱导培养基由如下配比的原料组成:
硝酸铵1000—1400 mg，优选 1200 mg
硝酸钾700— 1100 mg，优选 900 mg
硫酸镁175—185 mg，优选 180.7 mg
氯化钙330— 335 mg，优选 332.2 mg
磷酸二氢钾165—175 mg，优选170 mg
七水硫酸亚铁25— 30 mg，优选27.8 mg
乙二胺四乙酸二钠盐35— 40 mg，优选37.26 mg
硼酸5.5一6.5 mg，优选 6.2 mg
七水硫酸锌8一9 mg，优选8.6 mg
一水硫酸猛15—18 mg，优选16.9 mg
碘化钾0.8—0.85 mg,优选 0.83 mg
二水钼酸钠0.2—0.3 mg,优选0.25 mg
六水氯化钴0.02—0.03 mg,优选0.025 mg
五水硫酸铜0.02—0.03 mg,优选0.025 mg
硅酸钾150— 250 mg，优选200 mg
六水硫酸镍0.003—0.007 mg,优选0.005 mg
肌醇90—110 mg，优选 100 mg
甘氨酸1.8—2.2 mg，优选2.0 mg
烟酸0.3—0.7 mg,优选 0.5 mg
盐酸[!比P多醇0.3一0.7 mg，优选0.5 mg
盐酸硫胺素0.08一0.12 mg，优选0.1 mg
琼脂5— 7 g，优选6 g
鹿糖28— 32 g，优选30 g
6-BA1.8—2.2 mg，优选 2.0 mg
NAA0.01—0.05 mg
95% 乙醇5—15 ml 其余为水。
[0008]1000ml所述金银花直接体胚发生和植株再生的生根培养基由如下配比的原料组成:
硝酸铵500— 700 mg，优选600 mg
硝酸钾400—500 mg，优选450 mg
硫酸镁85—95 mg，优选90.35 mg
氯化I丐160一170 mg，优选 166.1 mg
磷酸二氢钾80—90111〖，优选85.0 mg
七水硫酸亚铁25— 30 mg，优选27.8 mg
乙二胺四乙酸二钠盐35— 40 mg，优选37.26 mg
硼酸5.5一6.5 mg，优选 6.2 mg
七水硫酸锌8一9 mg，优选8.6 mg
一水硫酸猛15—18 mg，优选16.9 mg
碘化钾0.8—0.9 mg,优选 0.83 mg
二水钼酸钠0.2—0.3 mg,优选0.25 mg
六水氯化钴0.02—0.03 mg,优选0.025 mg
五水硫酸铜0.02—0.03mg,优选0.025 mg
硅酸钾80—120 mg，优选100 mg
六水硫酸镍0.003—0.007mg,优选0.005 mg
肌醇90—110 mg，优选 100 mg
甘氨酸1.8—2.2 mg，优选2.0 mg
烟酸0.4—0.6 11^，优选0.5 mg
盐酸P比卩多醇0.4—0.6 11^，优选0.5 mg
盐酸硫胺素0.08一0.12 mg，优选0.1 mg
琼脂4一 8 g，优选6 g
鹿糖25—35 g，优选30 g
IBA3.0一5.0 mg，
活性炭O — 20g，优选O或20g
95% 乙醇5—15 ml
其余为水。
[0009]所述金银花直接体胚发生和植株再生方法是将金银花无菌叶片接种于上述直接体胚诱导培养基上培养，待直接体胚诱导培养基上长出子叶胚后，将子叶胚转接到上述生根培养基中培养，至子叶胚发育成再生小植株。
[0010]优选地，所述方法是将金银花无菌叶片接种于直接体胚诱导培养基上培养，75—80天将直接体胚诱导培养基上长出的子叶胚转接到生根培养基中培养，75—80天，优选80天后发育成再生小植株；直接体胚诱导培养基培养条件为:暗培养1.5-2.5周，优选2周，然后进行光照培养，每天光照时间为10—14小时，优选12小时，光照强度为3500-3900LUX，优选3850 lux，温度为20— 25°C，优选25°C ;生根培养基培养条件为:光照培养，每天光照时间为10 —14小时，优选12小时，光照强度为3500-3900LUX，优选3850 lux，温度为20—25°C，优选25°C;将再生小植株炼苗I一 1.5周，优选I周后移栽至基质中培养，所述基质由泥炭土和珍珠岩按体积比(1.5 — 2.5):1，优选2:1组成。
[0011]本发明涉及的培养基包括直接体胚诱导培养基和生根培养基两种，每种基本培养基均是由MS改良而成。在直接体胚诱导培养基中，