同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法
【专利摘要】本发明公开了一种同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法，可以克服七叶一枝花在自然繁殖和人工种植中出现的品种退化问题，步骤如下：(1)繁育组培苗；(2)秋水仙素处理：用以下两种方法之一处理：①在无菌条件下，选取组培继代苗，在茎部造成若干创伤，然后用脱脂棉包裹严密，再在脱脂棉上滴入秋水仙素溶液浸润，在分化培养基上培养，用无菌水洗净，切成单芽后转接到丛生芽诱导培养基中；②将组培苗转接至添加秋水仙素的分化培养基中，培养后，切成单芽转接至丛生芽诱导培养基中；(3)植株分化培养；(4)植株增殖培养；(5)植株染色体检测；(6)选育同源四倍体植株。本发明的方法，对于扩大特有珍稀药用植物种植面积有重要意义。
【专利说明】同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法，属于药用植物育种领域。
【背景技术】
[0002]七叶一枝花为百合科重楼属多年生草本植物，野生环境下生于海拔1800?3200米的林下，山坡林下荫处或沟边的阴湿处，分布于我国云南、四川、贵州、广东、广西、江西、福建等省。以干燥根茎入药，中药名为重楼、七叶莲、灯台七等。根茎含多种留体皂苷、生物碱和氨基酸。中医认为，其性味苦微寒，有清热解毒、消肿止痛、息风定惊、平喘止咳等功效，常用来治疗流行性乙型脑炎，胃痛，阑尾炎，淋巴结结核，扁桃体炎，腮腺炎，乳腺炎，跌打损伤、蛇虫咬伤、淋巴结核、骨髓炎等，是云南白药的主要成分之一。由于该药药用价值高，民间采挖严重，野生资源已日益枯竭。虽然近几年来已开展人工种植，但由于引种的野生品种存在生长缓慢，生长周期长，药材产量低，短时间内还难以满足市场医用需求，因此培育出七叶一枝花性状优良的新品种，才能从根本上解决市场药材短缺的问题，也是保证七叶一枝花药材种植业持续健康发展的重要措施。
[0003]诱导植物多倍体的形成，是加大植物遗传变异，改良植物品性的重要手段。多倍体药用植物一般具有根、茎、叶和花果的巨型性，抗逆性强，药用成分含量高等特性。这正是药材优质、高产育种所期望达到的目标。因此培育七叶一枝花同源四倍体新品种，可以解决药材品种性状改良的问题，同时从根本上解决目前药材产量低、市场需求量短缺的问题。
[0004]单倍体是指体细胞中含有本物种配子染色体数的生物个体。而一倍体是指体细胞含一个染色体组的个体。绝大多数生物为二倍体生物，其单倍体的体细胞中含一个染色体组，如果原物种本身为多倍体，那么它的单倍体的体细胞中含有的染色体组数一定多于一个。如四倍体水稻的单倍体含两个染色体组，六倍体小麦的单倍体含三个染色体组。多倍体就是指体细胞中含有三个以上染色体组的生物个体。同源多倍体是由原来的染色体组加倍形成的多倍体。鉴于此，在进行同源四倍体七叶一枝花植株的培育过程中，就要确实保证细胞内的染色体数呈整数加倍，而不是单单指染色体数的简单增多，否则得到的多倍体只是杂合体(染色体数不规律增加)或嵌合体(含有不同倍性的各种细胞)，而且此类多倍体在继代增殖过程中往往会发生回复突变，且性状不稳定。为了得到纯合同源四倍体七叶一枝花植株，本发明在四倍体植株诱导条件等方面做了细化和改进，并成功实现组培四倍体植株的温室移栽，通过大量实验摸索出了一套培育纯合同源四倍体七叶一枝花植株的方法。
【发明内容】
[0005]针对上述现有技术，本发明提供了一种同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法。通过此方法可快速实现同源四倍体七叶一枝花植株的培育，进而有效提高其活性成分的含量，克服七叶一枝花在自然繁殖和人工种植中出现的品种退化问题。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法，步骤如下:
[0008](I)繁育组培苗:取性状优良的七叶一枝花植株的叶芽，通过植物组织培养技术，繁育出组培苗(该步所涉及的技术为常规技术)；
[0009](2)秋水仙素处理:用以下两种方法之一处理:
[0010]①在无菌条件下，选取生长势强的组培继代苗，在茎部造成若干(2?5个)创伤(所述创伤是指用器械轻轻划伤)，然后用脱脂棉包裹严密，再在脱脂棉上滴入质量浓度为
0.03%?0.05%的秋水仙素溶液浸润，在分化培养基上培养10?15天后,用无菌水洗净，切成单芽后转接到丛生芽诱导培养基中；
[0011]②将组培苗转接至添加质量浓度为0.05%?1.0 %的秋水仙素的分化培养基中，培养20?30天后，切成单芽转接至丛生芽诱导培养基中；
[0012]所述分化培养基的组份组成为:MS+BA 0.5?0.8mg/L+GA3 0.1?0.5mg/L+NAA
0.1?0.3mg/L+CTK (细胞分裂素)0.3?0.5mg/L ( S卩:向MS培养基中加入终浓度为0.5?
0.8mg/L 的 BA、0.1 ?0.5mg/L 的 GA3'0.1 ?0.3mg/L 的 NAA 以及 0.3 ?0.5mg/L 的 CTK 而成；该表述方式为所属领域技术人员惯用的表述方式；下同；所述MS培养基为现有技术中常用的培养基)；
[0013]所述在分化培养基中培养的培养条件为:温度25?30°C，每天日照8?12h，光照强度 60 μ mol.m 2.s 1 ;
[0014]所述丛生芽诱导培养基的组分组成为:MS+BA L 5?2.0mg/L+GA3 0.1?0.5mg/L+NAA0.1 ?0.5mg/L+ 鹿糖 20 ?30g/L ；
[0015](3)诱导植株分化培养:在丛生芽诱导培养基中培养25?35天,诱导产生丛生芽，培养条件为:温度20?30°C，每天日照8?12h，光照强度120 μ mol.πΓ2.s—1 ；
[0016](4)诱导植株增殖培养:将上述长出的丛生芽转接入增殖培养基中，在温度20?30°C,每天日照8?12h,光照强度120 μ mol.πΓ2.s_1的条件下,培养25?35天,将丛生芽分株培养成完整植株；
[0017]所述增殖培养基的组分组成为:MS+BA 2.0?3.0mg/L+NAA 0.2?0.5mg/L+蔗糖20 ?30g/L ；
[0018](5)诱导植株染色体检测:切取步骤(4)中得到的完整植株，在解剖镜下剥离茎尖，经过压片染色，在显微镜下进行染色体数目检测；
[0019](6)选育同源四倍体植株:通过染色体数目检测，筛选出四倍体植株，转接至生根培养基中，在温度25?30°C，每天日照8?12h，光照强度120 μ mol.πΓ2.s—1的条件下，培养25?35天，即培育出同源四倍体完整植株；
[0020]所述生根培养基的组份组成为:1/2MS+NAA 0.1?0.3mg/L+蔗糖20?30g/L(1/2MS是指基础培养基中各物质的浓度为MS培养基的一半)。
[0021]本发明的同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法，选用优良植株的叶芽通过组织培养技术繁育成组培苗，保证了种质来源，在无菌条件下，用秋水仙素对组培苗进行处理，诱导成功率高，同时室内操作不受季节限制，可快速繁殖变异植株，同时有效缩短育种的时间。
[0022]根据秋水仙素诱导多倍体的作用原理，秋水仙素对植物的诱导作用只发生在细胞分裂期，而对于那些处于静止状态的细胞没有作用，需处理的植物组织应该是分裂活跃、旺盛的部位，通常是用萌动的或刚发芽的种子、正在膨大的芽、根尖、幼苗、嫩枝生长点及花蕾等。本申请的课题组前期尝试过浸种法、涂抹法等途径处理七叶一枝花种子和种子苗，但效果均不理想，也未获得纯合四倍体。本实验中，用附加秋水仙素的培养基萌发七叶一枝花种子，容易得到变异苗，但是多为畸形苗，后期存活率低，同时这种新萌发的苗较为脆弱，对秋水仙素的毒害作用敏感。实验过程中发现，处理生长一段时间后的无菌苗获得多倍体的效果更好，再生植株形态差异显著，这可能是由于苗正处于生长旺盛阶段，相同时间内处于分裂期的细胞数量多于种子，用相同浓度的秋水仙素处理，可以使更多的细胞获得加倍的机会。说明采用秋水仙素处理七叶一枝花无菌苗获得多倍体植株是可行的。
[0023]本发明结合七叶一枝花无菌苗快速诱导丛生芽与增殖技术，利用秋水仙素处理使再生植株染色体加倍，诱导产生四倍体七叶一枝花植株，可以克服七叶一枝花在自然繁殖和人工种植中出现的品种退化问题，对于扩大特有珍稀药用植物种植面积，提高七叶一枝花种植收入，满足市场需求以及推广常用中药开发利用有重要意义。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未详尽描述的试剂、方法均为现有技术中已有的常规试剂、方法。
[0025]实施例1同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法
[0026]步骤如下:
[0027](I)繁育组培苗:取七叶一枝花植株的叶芽，通过植物组织培养技术，繁育出组培苗；
[0028](2)秋水仙素处理:在无菌条件下，选取生长势强的组培继代苗，在茎部造成若干(2?5个)创伤，然后用脱脂棉包裹严密，再在脱脂棉上滴入质量浓度为0.05%的秋水仙素溶液浸润，在分化培养基上培养12天后，用无菌水洗净，切成单芽后转接到丛生芽诱导培养基中；
[0029]所述分化培养基的组份组成为:MS+BA0.6mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.2mg/L+CTK0.4mg/L ；
[0030]所述在分化培养基中培养的培养条件为:温度28°C，每天日照10h，光照强度60 μ mol.m 2.s 1 ；
[0031]所述丛生芽诱导培养基的组分组成为:MS+BA 1.8mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+ 鹿糖 25g/L ；
[0032](3)诱导植株分化培养:在丛生芽诱导培养基中培养30天，诱导产生丛生芽，培养条件为:温度28°C,每天日照1h,光照强度120 μ mol.πΓ2.s_1 ；
[0033](4)诱导植株增殖培养:将上述长出的丛生芽转接入增殖培养基中，在温度28°C，每天日照10h，光照强度120μπιΟ1.πΓ2.S-1的条件下，培养30天，将丛生芽分株培养成完整植株；
[0034]所述增殖培养基的组分组成为:MS+BA 2.5mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖25g/L ；
[0035](5)诱导植株染色体检测:切取步骤(4)中得到的完整植株，在解剖镜下剥离茎尖，经过压片染色，在显微镜下进行染色体数目检测；结果:得到完整植株197株，四倍体植株94株，诱导率为47.7% (诱导率=多倍体数/增殖的芽数)；
[0036](6)选育同源四倍体植株:通过染色体数目检测，筛选出四倍体植株，转接至生根培养基中，在温度28°C，每天日照10h，光照强度120 μ mo I.πΓ2.s—1的条件下，培养30天，培育出同源四倍体完整植株，经统计，共培育出77株同源四倍体完整植株，成活率81.9% ；
[0037]所述生根培养基的组份组成为:1/2MS+NAA 0.2mg/L+蔗糖25g/L。
[0038]实施例2同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法
[0039]步骤如下:(I)繁育组培苗:取七叶一枝花植株的叶芽，通过植物组织培养技术，繁育出组培苗；
[0040](2)秋水仙素处理:将组培苗转接至添加质量浓度为0.08%的秋水仙素的分化培养基中，培养25天后，切成单芽转接至丛生芽诱导培养基中；
[0041 ]所述分化培养基的组份组成为:MS+BA 0.6mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.2mg/L+CTK0.4mg/L ；
[0042]所述在分化培养基中培养的培养条件为:温度28°C，每天日照10h，光照强度60 μ mol.m 2.s 1 ；
[0043]所述丛生芽诱导培养基的组分组成为:MS+BA 1.8mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+ 鹿糖 25g/L ；
[0044](3)诱导植株分化培养:在丛生芽诱导培养基中培养30天，诱导产生丛生芽，培养条件为:温度28°C,每天日照1h,光照强度120 μ mol.πΓ2.s_1 ；
[0045](4)诱导植株增殖培养:将上述长出的丛生芽转接入增殖培养基中，在温度28°C，每天日照10h，光照强度120μπιΟ1.πΓ2.S-1的条件下，培养30天，将丛生芽分株培养成完整植株；
[0046]所述增殖培养基的组分组成为:MS+BA 2.5mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖25g/L ；
[0047](5)诱导植株染色体检测:切取步骤(4)中得到的完整植株，在解剖镜下剥离茎尖，经过压片染色，在显微镜下进行染色体数目检测；结果:得到完整植株205株，四倍体植株107株，诱导率为52.2% (诱导率=多倍体数/增殖的芽数)；
[0048](6)选育同源四倍体植株:通过染色体数目检测，筛选出四倍体植株，转接至生根培养基中，在温度28°C，每天日照10h，光照强度120 μ mol.πΓ2.s—1的条件下，培养30天，培育出同源四倍体完整植株，经统计，共培育出92株同源四倍体完整植株，成活率86.0% ;
[0049]所述生根培养基的组份组成为:1/2MS+NAA 0.2mg/L+蔗糖25g/L。
【权利要求】
1.一种同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法，其特征在于:步骤如下: (1)繁育组培苗:取七叶一枝花植株的叶芽，通过植物组织培养技术，繁育出组培苗； (2)秋水仙素处理:用以下两种方法之一处理: ①在无菌条件下，选取组培继代苗，在茎部造成若干创伤，然后用脱脂棉包裹严密，再在脱脂棉上滴入质量浓度为0.03%?0.05%的秋水仙素溶液浸润，在分化培养基上培养10?15天后，用无菌水洗净，切成单芽后转接到丛生芽诱导培养基中； ②将组培苗转接至添加质量浓度为0.05%?1.0 %的秋水仙素的分化培养基中，培养20?30天后，切成单芽转接至丛生芽诱导培养基中； 所述分化培养基的组份组成为:MS+BA 0.5?0.8mg/L+GA3 0.1?0.5mg/L+NAA 0.1?0.3mg/L+CTK 0.3 ?0.5mg/L ； 所述在分化培养基中培养的培养条件为:温度25?30°C，每天日照8?12h，光照强度60 μ mol.m 2.s 1 ； 所述丛生芽诱导培养基的组分组成为:MS+BA 1.5?2.0mg/L+GA3 0.1?0.5mg/L+NAA0.1 ?0.5mg/L+ 鹿糖 20 ?30g/L ； (3)诱导植株分化培养:在丛生芽诱导培养基中培养25?35天，诱导产生丛生芽，培养条件为:温度20?30°C,每天日照8?12h,光照强度120 μ mol.πΓ2.s_1 ； (4)诱导植株增殖培养:将上述长出的丛生芽转接入增殖培养基中，在温度20?30°C，每天日照8?12h，光照强度120 μ mol.πΓ2.s—1的条件下，培养25?35天，将丛生芽分株培养成完整植株； 所述增殖培养基的组分组成为:MS+BA 2.0?3.0mg/L+NAA 0.2?0.5mg/L+蔗糖20?30g/L ； (5)诱导植株染色体检测:切取步骤(4)中得到的完整植株，在解剖镜下剥离茎尖，经过压片染色，在显微镜下进行染色体数目检测； (6)选育同源四倍体植株:通过染色体数目检测，筛选出四倍体植株，转接至生根培养基中，在温度25?30°C，每天日照8?12h，光照强度120μπιΟ1.πΓ2.s—1的条件下，培养25?35天，即培育出同源四倍体完整植株； 所述生根培养基的组份组成为:1/2MS+NAA 0.1?0.3mg/L+蔗糖20?30g/L。
2.根据权利要求1所述的同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法，其特征在于:所述分化培养基的组份组成为:MS+BA 0.6mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.2mg/L+CTK 0.4mg/L。
3.根据权利要求1所述的同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法，其特征在于:所述丛生芽诱导培养基的组分组成为:MS+BA 1.8mg/L+GA3 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖25g/L。
4.根据权利要求1所述的同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法，其特征在于:所述增殖培养基的组分组成为:MS+BA 2.5mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖25g/L。
5.根据权利要求1所述的同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法，其特征在于:所述生根培养基的组份组成为:1/2MS+NAA 0.2mg/L+蔗糖25g/L。
【文档编号】A01H4/00GK104160962SQ201410445856
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】王晓娟 申请人:无锡中农科生物育种技术研究院有限公司