一种柳叶剑蕨愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种柳叶剑蕨愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞培养、稀土调控悬浮细胞生长等步骤，本发明方法所制备的柳叶剑蕨悬浮细胞生长速度快，利用稀土对柳叶剑蕨悬浮细胞进行有目的调控，可以在短期内获得大量的制药原料，并能有效降低生产成本。
【专利说明】一种柳叶剑蕨愈伤组织和悬淳细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组培条件下柳叶剑蕨悬浮细胞的培养，属于植物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 柳叶剑蕨ZcLTOgra遞?e sa/ici/b/ia,剑蕨科植物，产浙江、安徽、河南、湖北、湖南、 江西、福建、台湾、广东、广西、贵州、四川、甘肃，附生树干或岩石上，海拔200-1200米。韩 国、日本也有。用于润肺止咳，主治痨伤咳嗽。目前，柳叶剑蕨的天然资源贫乏，栽培过程中 产量和品质有所下降，因此采用基因技术的方法，开发生产柳叶剑蕨的药用成分，进行柳叶 剑蕨植物资源开发，亦是减少占地的一种新方法。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供柳叶剑蕨细胞悬浮培养的快速繁殖方法，并通 过稀土对悬浮细胞调控获得生长良好，生长速度快的悬浮细胞，可以规模化的为药厂提供 制药原料。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案： 取柳叶剑蕨的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污渍，流水冲洗30min，超 净工作台上氯化萊处理12min，无菌水冲洗5遍，灭菌处理过的柳叶剑蕨叶片接入培养基配 方为MS+NAAO. 5mg/L+IBA4mg/l+4mg/L柠檬酸诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加 蔗糖30g/L，琼脂6. 5g/L，PH5. 8,暗室培养，诱导30天后将诱导出来的愈伤组织放入液体培 养基MS+2,4-DO. 2mg/L+6-BA0. 2mg/L进行悬浮细胞培养，每个三角瓶接种50mLMS液体培 养基，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为80 r/min，温度25°C，附加蔗糖30g/L， PH5. 8,光照20001x，继代2-3次，培养基中加入2mg/L的硝酸铺，30天后，取出称重。
[0005] 采用本发明制备的柳叶剑蕨悬浮细胞，生长速度快，利于大生产操作，能耗小，污 染小，柳叶剑蕨悬浮细胞增长率为85%。
[0006] 下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不 局限于下列实施方式。
【具体实施方式】 [0007] 实施例1 取柳叶剑蕨的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污渍，流水冲洗30min，超 净工作台上氯化萊处理12min，无菌水冲洗5遍，灭菌处理过的柳叶剑蕨叶片接入培养基配 方为MS+NAAO. 5mg/L+IBA4mg/l+4mg/L柠檬酸诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加 蔗糖30g/L，琼脂6. 5g/L，PH5. 8,暗室培养，诱导30天后将诱导出来的愈伤组织放入液体培 养基MS+2,4-DO. lmg/L+6-BA0. lmg/L进行悬浮细胞培养，每个三角瓶接种50mLMS液体培 养基，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为80 r/min，温度25°C，附加蔗糖30g/L， PH5. 8,光照20001x，继代2-3次，培养基中加入lmg/L的硝酸铺，30天后，取出称重，柳叶剑 蕨悬浮细胞增长率为80%。
[0008] 实施例2 取柳叶剑蕨的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污渍，流水冲洗30min，超 净工作台上氯化萊处理12min，无菌水冲洗5遍，灭菌处理过的柳叶剑蕨叶片接入培养基配 方为MS+NAAO. 5mg/L+IBA4mg/l+4mg/L柠檬酸诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加 蔗糖30g/L，琼脂6. 5g/L，PH5. 8,暗室培养，诱导30天后将诱导出来的愈伤组织放入液体培 养基MS+2,4-DO. 2mg/L+6-BA0. 3mg/L进行悬浮细胞培养，每个三角瓶接种50mLMS液体培 养基，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为80 r/min，温度25°C，附加蔗糖30g/L， PH5. 8,光照20001x，继代2-3次，培养基中加入3mg/L的硝酸铺，30天后，取出称重，柳叶剑 蕨悬浮细胞增长率为82%。
[0009] 实施例3 取柳叶剑蕨的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污渍，流水冲洗30min，超 净工作台上氯化萊处理12min，无菌水冲洗5遍，灭菌处理过的柳叶剑蕨叶片接入培养基配 方为MS+NAAO. 5mg/L+IBA4mg/l+4mg/L柠檬酸诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加 蔗糖30g/L，琼脂6. 5g/L，PH5. 8,暗室培养，诱导30天后将诱导出来的愈伤组织放入液体培 养基MS+2,4-DO. lmg/L+6-BA0. 3mg/L进行悬浮细胞培养，每个三角瓶接种50mLMS液体培 养基，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为80 r/min，温度25°C，附加蔗糖30g/L， PH5. 8,光照20001x，继代2-3次，培养基中加入2mg/L的硝酸铺，30天后，取出称重，柳叶剑 蕨悬浮细胞增长率为81%。
[0010] 实施例4 取柳叶剑蕨的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污渍，流水冲洗30min，超 净工作台上氯化萊处理12min，无菌水冲洗5遍，灭菌处理过的柳叶剑蕨叶片接入培养基配 方为MS+NAAO. 5mg/L+IBA4mg/l+4mg/L柠檬酸诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加 蔗糖30g/L，琼脂6. 5g/L，PH5. 8,暗室培养，诱导30天后将诱导出来的愈伤组织放入液体培 养基MS+2,4-DO. 15mg/L+6-BA0. 2mg/L进行悬浮细胞培养，每个三角瓶接种50mLMS液体培 养基，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为80 r/min，温度25°C，附加蔗糖30g/L， PH5. 8,光照20001x，继代2-3次，培养基中加入3mg/L的硝酸铺，30天后，取出称重，柳叶剑 蕨悬浮细胞增长率为83%。
【权利要求】
1. 一种柳叶剑蕨愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤 组织的诱导、悬浮细胞培养、稀土调控悬浮细胞生长等，主要步骤如下： (1) 取柳叶剑蕨的幼嫩叶片，按照常规的消毒方法对其进行灭菌处理； (2) 将步骤（1)灭菌处理过的柳叶剑蕨叶片接入培养基配方为MS+NAAO. 5mg/ L+IBA4mg/l+4mg/L柠檬酸诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂 6.5g/L，PH5.8,暗室培养； (3) 取步骤⑵诱导出来的愈伤组织放入液体培养基MS+2,4-D0. 1-0. 2mg/ L+6-BA0. 1-0. 3mg/L进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5. 8,光照20001x ; (4) 取步骤（3)悬浮培养出来的细胞放入加入稀土的上述培养基中调控悬浮细胞生 长。
2. 按照权利要求1所述的一种柳叶剑蕨愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征 在于：步骤（1)中所述柳叶剑蕨无菌叶片的获得为，取柳叶剑蕨的叶片，先在漂白粉中浸泡 3min，毛刷去除表面污渍，流水冲洗30min，超净工作台上氯化萊处理12min，无菌水冲洗5 遍。
3. 按照权利要求1所述的一种柳叶剑蕨愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征 在于：步骤（2)中所述愈伤组织的诱导采用的是暗室培养，并在培养基中附加柠檬酸，可以 有效防止愈伤组织褐化现象。
4. 按照权利要求1所述的一种柳叶剑蕨愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征 在于：步骤（3)所述的剑蕨悬浮细胞按照下述方法得到：取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组 织，接种到盛有50mLMS液体培养基的三角瓶中，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转 速为 80 r/min，温度 25°C。
5. 按照权利要求1所述的一种柳叶剑蕨愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征 在于：步骤（4)中选用的稀土是硝酸铈，调控浓度为2-4mg/L。
【文档编号】A01H4/00GK104206271SQ201410445602
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】张金芳, 杨存 申请人:南京标科生物科技有限公司