一种黄瑞木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种黄瑞木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞培养等步骤，本发明方法利用细胞悬浮培养方法可以快速获得大量黄瑞木细胞，缩短培养周期，短期内提供大量的制药原料，并能有效降低生产成本。
【专利说明】一种黄瑞木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下黄瑞木悬浮细胞的培养，属于植物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]黄瑞木，t/ramillettii (Hook, et Am.) Benth.et Hook.f.,山茶科，又名乌珠子、杨桐、鸡仔茶、黄板叉木，落叶灌木，性极耐寒、耐旱、耐修剪，喜光，喜较深厚湿润但肥沃疏松的土壤。产于我国东北、华北、西北、华东等地，定州酒庄苗圃有引种。凉血止血，消肿解毒。根:用于鼻衄睾丸炎，腮腺炎。鲜叶:外用治疖肿，毒蛇咬伤，毒蜂螫伤。目前主要的繁殖方法是扦插和压条法繁殖。扦插可选一年生枝，秋冬沙藏后于翌年3月?4月扦插。性极耐寒、耐旱、耐修剪，喜光，喜较深厚湿润但肥沃疏松的土壤，压条可在5月将枝条环割后埋入土中，生根后在翌春与母株割离分栽，使用组培方法对黄瑞木进行快速繁殖尚无研究，利用细胞悬浮培养方法可以快速获得大量黄瑞木细胞，缩短培养周期，短期内提供大量的制药原料。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供黄瑞木细胞悬浮培养的快速繁殖方法，获得生长良好，生长速度快的悬浮细胞，可以短期内大规模的提供制药原料。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
取黄瑞木的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗为2min，超净工作台上氯化汞处理8min，无菌水冲洗4-6遍，消毒处理过的黄瑞木叶片接入培养基配方为MS+2，4-D0.5mg/L+IBA3mg/l+4mg/LABA诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗室培养，诱导出来的愈伤组织放入培养基ER+2，4，5-T0.2mg/L+KT0.2mg/L+VC100mg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，光照40001x，增殖后的愈伤组织放入液体培养基ER+IAA 0.2mg/L+6-BA0.2mg/L+椰乳15%进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x，摇床转速为90r/min，温度26°C，光照 12h。
[0005]采用本发明制备的黄瑞木悬浮细胞，生长速度快，增殖率高，利于大生产操作，能耗小，污染小。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取黄瑞木的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗为2min，超净工作台上氯化萊处理8min,无菌水冲洗4_6遍,消毒处理过的黄瑞木叶片接入培养基配方为MS+2，4-D 0.5mg/L+IBA3mg/l+4mg/LABA诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗室培养，诱导出来的愈伤组织放入培养基ER+2，4，5-T0.lmg/L+KT0.lmg/L+VC100mg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，光照40001x，增殖后的愈伤组织放入液体培养基ER+IAA 0.lmg/L+6-BA0.lmg/L+椰乳15%进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x，摇床转速为90 r/min，温度 26。。。
[0008]实施例2
取黄瑞木的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗为2min，超净工作台上氯化汞处理8min，无菌水冲洗4-6遍，消毒处理过的黄瑞木叶片接入培养基配方为MS+2，4-D0.5mg/L+IBA3mg/l+4mg/LABA诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗室培养，诱导出来的愈伤组织放入培养基ER+2，4，5-T0.2mg/L+KT0.3mg/L+VC100mg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，光照40001x，增殖后的愈伤组织放入液体培养基ER+ IAA 0.2mg/L+6-BA0.3mg/L+椰乳15%进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x，摇床转速为90 r/min，温度26°C。
[0009]实施例3
取黄瑞木的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗为2min，超净工作台上氯化萊处理8min,无菌水冲洗4_6遍,消毒处理过的黄瑞木叶片接入培养基配方为MS+2，4-D 0.5mg/L+IBA3mg/l+4mg/LABA诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗室培养，诱导出来的愈伤组织放入培养基ER+2，4，5-T0.2mg/L+KT0.lmg/L+VC100mg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，光照40001x，增殖后的愈伤组织放入液体培养基ER+IAA 0.2mg/L+6-BA0.lmg/L+椰乳15%进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x，摇床转速为90 r/min，温度 26。。。
[0010]实施例4
取黄瑞木的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗为2min，超净工作台上氯化萊处理8min,无菌水冲洗4_6遍,消毒处理过的黄瑞木叶片接入培养基配方为MS+2，4-D 0.5mg/L+IBA3mg/l+4mg/LABA诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗室培养，诱导出来的愈伤组织放入培养基ER+2，4，
5-T0.2mg/L+KT0.3mg/L+VC100mg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，光照40001x，增殖后的愈伤组织放入液体培养基ER+IAA 0.lmg/L+6-BA0.3mg/L+椰乳15%进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x，摇床转速为90 r/min，温度 26。。。
【权利要求】
1.一种黄瑞木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞培养等，主要步骤如下: (1)取黄瑞木幼嫩茎段和叶片，按照常规的消毒方法对其进行灭菌处理； (2)将步骤(I)消毒处理过的黄瑞木叶片接入培养基配方为MS+2，4-D0.5mg/L+IBA3mg/l+4mg/LABA诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.8，暗室培养； (3)取步骤(2)诱导出来的愈伤组织放入培养基ER+2，4，5-T0.1-0.2mg/L+KT0.1-0.3mg/L+VC100mg/L进行愈伤组织增殖培养，附加蔗糖30g/L,琼脂6.5g/L，PH5.8，光照 40001x ； (4)取步骤(3)增殖后的愈伤组织放入液体培养基ER+IAA0.1-0.2mg/L+6-BA0.1-0.3mg/L+椰乳15%进行悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
2.按照权利要求1所述的一种黄瑞木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(I)中所述黄瑞木无菌叶片的获得为，取黄瑞木的叶片，先在漂白粉中浸泡3min,毛刷去除表面污溃,流水冲洗为20min,超净工作台上氯化萊处理8min,无菌水冲洗4-6 遍。
3.按照权利要求1所述的一种黄瑞木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(2)中所述愈伤组织的诱导采用的是暗室培养，并在培养基中附加ABA，可以促进愈伤组织的诱导和发生。
4.按照权利要求1所述的一种黄瑞木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(3)中所述愈伤组织的增殖中附加了 VC，可以有效防止愈伤组织的褐化现象，且VC的加入方法为过滤灭菌。
5.按照权利要求1所述的一种黄瑞木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)所述的黄瑞木悬浮细胞按照按照下述方法得到:取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有30mLER液体培养基三角瓶中，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为90 r/min，温度26°C，光照12h。
6.按照权利要求1所述的一种黄瑞木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)中加入了 15%的椰乳，对细胞悬浮培养有促进作用。
【文档编号】A01H4/00GK104170739SQ201410449790
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】张金芳, 杨存 申请人:南京标科生物科技有限公司